硫酸盐还原菌的测定+MPN法.doc

ICS 7104040G 76a雪中华人民共和国国家标准GBT 1464352009代替GBT 1464351993工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第5部分：硫酸盐还原菌的测定 MPN法Examination of bacteria and algae in industrial circulating cooling waterPart 5：Examination of sulfate-reducing bacteria-MPN test2009-05-18发布20100201实施中华人民共j国国家质量监督检验检疫总局省寿中国国家标准化管理委员会厘111GBT 1464352009刖置GBT 14643(工业循环冷却水中菌藻的测定方法分为以下几个部分：第1部分：黏液形成菌的测定平皿计数法第2部分：土壤菌群的测定平皿计数法第3部分：黏泥真菌的测定平皿计数法第4部分：土壤真菌的测定平皿计数法第5部分：硫酸盐还原菌的测定MPN法第6部分：铁细菌的测定MPN法本部分为GBT 14643的第5部分。本部分代替GBT 146435 1993工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定MPN法。 本部分与GBT 1464351993相比，在技术内容上并无变化，只是对文本结构和文字进行了修改。本部分的附录A、附录B、附录C为规范性附录。 本部分由中国石油和化学工业协会提出。 本部分由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会(sACTC 63SC 5)归口。 本部分负责起草单位：中海油天津化工研究设计院、天津正达科技有限责任公司。 本部分主要起草人：朱传俊、张全、邵宏谦、李琳、白莹。 本部分于1993年首次发布。GBT 1464352009工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第5部分：硫酸盐还原菌的测定 MPN法1范围GBT 14643的本部分规定了工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定方法。 本部分适用于工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定，也适用于原水、生活用水及粘泥中硫酸盐还原菌的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 14643的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。GBT 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(GBT 603 2002，ISO 63531：1 982，NEQ)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3方法提要本法采用多试管发酵技术，在(291)培养21 d，如果试管内产生黑色沉淀并伴有硫化氢臭味的 表明阳性反应，采用MPN技术对被测试样中的硫酸盐还原菌进行计数。4试剂和材料本部分所用试剂，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GBT 6682中三级水的规定。 试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GBT 603之规定制备。41磷酸氢二钾。42氯化铵。43硫酸钠。44氯化钙。45硫酸镁。46乳酸钠。47酵母汁：生化试剂。48硫酸亚铁铵。49维生素C。410氯化钠。411氢氧化钠溶液：40 gL。412盐酸溶液：1+11。413硫代硫酸钠。414乙醇溶液：75(体积分数)。1GBT 1464352009415牛皮纸。416医用脱脂棉。5仪器、设备51无菌箱(室)或超净工作台。52蒸汽压力灭菌器。53生化培养箱。54电热干燥箱：温度可控制在60280。55电热恒温水浴锅：恒温范围37100。56刻度吸管：l mL。57刻度吸管：5 mL。58试管：150 mm15 mm并配上密封的塞子。59试管架。510刻度三角瓶：500 mL。511磨口三角瓶：100 mL。512磨口试剂瓶：1 000 mL。513容量瓶：l ODDmL。6试验前准备61无菌水的制备将水分装在100 mL磨口三角瓶中，每瓶40 mL，每个三角瓶塞子和瓶口间插人一小纸片来防止粘 连，每个瓶子的瓶日均用牛皮纸包扎，以防污染，用蒸汽压力灭菌器于(1211)灭菌15 rain。62培养基的制备621称取下列试剂： 磷酸氢二钾05 g； 氯化铵 10 g； 硫酸钠0，5 g； 氯化钙01 g； 硫酸镁 20 g； 乳酸钠 35 g； 酵母汁 10 g。将上述试剂溶解在1 000 mL水中，用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至7202，并分装在500 mL刻度三角瓶中，每瓶不超过350 mL，瓶口塞上棉塞，并用牛皮纸包好，用蒸汽压力灭菌器于 (121土1)灭菌15 min。622硫酸亚铁铵溶液：在培养基使用的当天称取12 g硫酸亚铁铵，在无菌箱(室)内均匀地摊在离 紫外线灯30 cm处灭菌30 rain，在无菌操作下，把硫酸亚铁铵溶解于事先准备好的无菌水中，混匀。623维生素C溶液：在培养基使用的当天称取04 g维生素C，在无菌箱(室)内均匀地摊在离紫外 线灯30 cm处灭菌30 min。在无菌操作下，把维生素C溶解于事先准备好的无菌水中，混匀。624在无菌操作下，按每100 mL培养基各加入10 mL硫酸亚铁铵溶液和10 mL维生素C溶液。63无菌稀释水的制备631生理盐水的配制：称取85 g氯化钠溶解在1 000 raL水中，混匀。632将生理盐水分装在100 mL磨口三角瓶中，每瓶45 mL，每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸片， 塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于(121土1)灭菌15 min。2GBT 146435200964刻度吸管的灭菌641将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10 mm15 mitt，棉花不 宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。642每支刻度吸管用l条约40 mm50 mm宽的牛皮纸条，以45。左右角度螺旋形卷起来，吸管的 尖端在头部，粗端用多余纸条折叠打结，不使散开。标上度量，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于 (160士2)灭菌2 h。65试管的灭菌 将洗净并烘干后的试管塞上密封的塞子，数支一捆，每捆管口用牛皮纸包扎，置电热干燥箱中，于(1 602)灭菌2 h。66采样瓶的灭菌将洗净并烘干后的1 ooo mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱中，于(160土2)灭菌2 h。67硫代硫酸钠灭菌将硫代硫酸钠放在无菌箱(室)内。并均匀地摊在离紫外线灯30 cm处灭菌30 min。7测定步骤71水祥的采集711用无菌采样瓶采集被测样品，在取样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部分受杂菌污染，瓶 内要灌满水样。712若采集的水中有余氯，应在采样前，在无菌操作下，于无菌采样瓶中加入硫代硫酸钠，加入量为 每升水样约01 g。713水样采集后，应立即进行测定，如果在2 h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中，于410保存，存放时间不宜超过24 h。经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，于30左右活化4 h5 h，再进行测定。72无菌箱(室)灭菌 把试验所用的无菌培养基、无菌稀释水、无菌吸管等用品放入无菌箱(室)内，打开紫外线灯灭菌30rain。73水样的稀释和接种731水样放人灭过菌的无菌箱(室)中，立即用75乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃无菌箱 (室)内的酒精灯。以下对水样的稀释和接种的操作应在无菌箱(室)内火焰区进行。732选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种培养后无硫酸盐还原菌生长，在空白稀释水样瓶 上标上稀释度数。733用lo倍稀释法稀释水样，即用5mL无菌吸管吸取5mL水样注入到45mL空白稀释水中充分 摇匀，此时稀释度为lo_。734另取一支5mL无菌吸管吸取5mLl0-1水样注入到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为10，依次类推，直至需要的稀释度为止。735将水样(包括稀释水样)分别接种于无菌试管中，试管置试管架上，每个稀释度重复接种5管(根 据需要也可重复接种3管或4管)，每管接种1 mL，每接一个稀释度更换一支无菌吸管。736另取一组试管不接水样作为空白。737用事先在水浴上加热至60，并迅速冷却到20的无菌培养基灌满试管(735、736)盖上 密封盖子。GBT 146435200974培养 在生化培养箱中，于(291)培养21 d。8计数与报告81 凡产生黑色沉淀并伴有硫化氢臭味的表示有硫酸盐还原菌存在，以“+”(阳性)表示，其余试管以 “一”(阴性)表示。82如果空白出现阳性反应，表明测定过程中有污染，本次测定无效。83算出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来。84在10进位稀释中多于三个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度，对这三个 稀释度的决定是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的两个更高的稀释度，算出 阳性组合指数(见表1示例1、2、4)。85若按照上条规定的原则选出三个稀释度后，有更高的稀释仍然产生一个阳性试管，就应该将这一 个阳性试管并人所选择的最高稀释的阳性结果中(见表1示例3)。86根据阳性组合的指数，查表(附录A)得出最大可能菌数(MPN)除以阳性组合指数的第一位数字 的稀释度数，即为每毫升水样中硫酸盐还原菌的菌数(如果每个稀释度重复接种4管或3管，根据阳性 组合的指数查“附录B”表B1或“附录c”表c1。表1稀释度、生长情况及阳性试管数阳性组合 报告方式 示例10010叫 10-2 103 10一指数 个mL1520 5 0101=5055200l+一+一一一2542 25100一2544200+353214100一1453110+ll4510 3510 235102555109精密度91 由于微生物是不稳定的，精确的试验不能实现，精密度表达仅能按MPN程序。92在样品中细菌的分布是不规则的，有时细菌成倍地吸附到小颗粒上，MPN正确度随着平行管的 增加而增加，当使用5个平行管时，每管加1 mL样品时测定结果的置信度为95。GBT 1464352009附录A (规范性附录) 五个平行管最大可能的菌数五个平行管最大可能的菌数见表A1。表A1指数 个mL 指数 个mL指数 个mL指数 个mL0000020312 40013513850010221007 401175205000204 21109 40220 5217001002 21212 40325 5229501l0422009 410175231200120622l1241120524i5002004222144122552517502106230124202053080030O62311442125 531 11010002 2401442230 53214010104 30008 4302553317010206 3011-143130 53420010308 30214 43240 535 25011004 3101144035 54013011106 3111444149541 17011208 31217 45040 54225012006 31320 45140 543300121083201450025 544350122103211750130 5454501300832220 50240 5502501311 O33D 17 50360 551 3501411133120 50475 5526002000534020 510355539002010734125 51145 554 16002020935025 51260 55518005CBT 1464352009附录B (规范性附录) 四个平行管时最大可能菌数四个平行管时最大可能菌数见表1。表B1指数 个mL 指数 个mL 指数 个mL 指数 个mE00000 1131323l20 4025000102 12008 24020 40370002051211124l30 4103500307 12213300114115501002 123163011641280011051301130220 41311001207 1311430325 41414001309132163101642060020051401431120 42195021071411731230 42213002209200O6 31335 423170030 0 720109 32020 42420O031092021232130 43011504009 2031632235 431 165041122100933030 43220010003 211133313543330010105 2121633240 43435010208 21320 33350 4402501031_0220 1_334035 44140011005 22l1634145 44270011108 22220 40025 4431400112102301740135 44416006GBT 1464352009附录C (规