（微生物学专业论文）青霉素g酰化酶dna家族混组提高合成水解比的研究.pdf

摘要 摘要 j 3 内酰胺类抗生素及其衍生物的工业化生产正在发生震大变革，传统化学转 纯法正在逐步被酶催化法所取代。青霉索g 酰化酶( p e n i c i l l i ng y l a s eo r p e n i c i l l i nga m i d a s e ，e 。c + 3 5 。1 ；1 1 ，楚豫p g a 或p a c ) 怒半合娥争建酸胺类抗 生素工业的重要用酶，主要用于水解青霉素或头孢菌素分别生成母核6 - a p a ( 6 一 氨綦青霉靛酸) 或7 - a d c a ( 7 一氨基头孢烷酸) 。p g a 又可催化6 - a p a 或7 - a d c a 与不同测键醚基供传反皮生成毅的撬釜素。p g a 馕纯半会残争内酸黩获抗垒三素 是一种动力学控制的反应。动力学控制的p g a 催化的合成反应顾i 晦的主要障碍 是伴随着的水解葳应，闯此，合成东解比常作为合成过程有效性的指标。提高 s h 陡是获褥较囊捷生豢产量减少拳瓣熬毒效手段。本磺究运_ 鬻d n a 家族蕊组 技术定向进化p g a ，提高p g a 参与台成反威的s h 比。试验结果如下； 本文通过p c r 将h i s t a g 与p g a 融合，在具有t 7 启动子的p e t - 2 4 a ( + ) 质粒 载体中进行表达，建立了一个通用豹p g a 表达和鳃蚀方法，发酵获褥蛉糨酶缀 c 0 2 + i d a 骧腮载体一步纯化。四秘冀组孵生型p g a ( a f f g a 、e e p g a 、k e p g a 、 p r p g a ) 一步缝纯牧率分鬟为2 7 。6 、3 6 _ 3 、3 3 6 、1 9 7 ；绝纯倍数分剐为 4 0 、1 8 3 、1 0 7 、1 7 。对褥弱静因稀重缀p g a 测定萁参与7 - a d c a 和d 苯甘懿胺 合成头孢氮苄反应的s h ，分剐为2 5 、1 3 、1 7 、3 3 。 采用稀肖酶处理五种青霉素g 酰化酶基因( a 。f a e c a l i s 、b ，m e g a t e r i u m 、晟 c o t i 、i f c i t r o p h i t a 、pr e t t g e r ip g a s ) 进露d n a 家羧混鳃褥到焱台菸基因程亚纂 嵌合予库。缎k e p g a 基因的1 0 5 4 像( 在仪亚基翻连接欺怎) 遴霉亍滋默突变 入一 函”l 谴点，构建含有该突燮基鬻酾质粒( 臂黎载体) ，从孺容缩嵌合体基因 “诬鏊。p c r 获褥豹谈合体片断和骨架载体经n d e y k p n i 酶切后连接转化，约5 0 0 0 个转化子通过抑菌圈法( 2 5m m o l l7 - a d c a ，5 0m m o t l d - p g a ) 初筛得到抑菌 圈较大的嵌台体克隧，欺筛褥约4 0 0 个克隆。 萝謦得救突变壤体经试簧发酵，熙h p l c 分聿露，挑选食成与求黪产物蜂蘸菝院 对照( k c p g a ) 裹2 倍以上黪嶷隆避行进一步实验。淫避测序，序裂融对，分 帮亍嵌合清况，虽浚裔发现嘲撼嵌合，讴获得了爸含突变以及与戳往不同的类似驻 基重缀的究陵。 摘要 本研究建立了一种邋用的克隆、表达和纯化各釉p g a 的方法，使平行比较 各种p g a 的性质以及通过定点突变和定向进化( 溉基重组、d n a 家族混组、基 因终混组等 褥到的重缀p g a 的牲藏戏为哥麓。建立了一条完整可雩亍躺裔遗羹 筛选p g a 突变体s h 特性的路线，并以此法筛选了经d n a 家族泡组建立的p g a 嵌合体基因库，获得了较满意的结果。本研究为以后对p g a 蛋白质工程改造奠 定了一定豹萋穑。 关键词：青霉素g 酰化酶，固定化会属亲和层板，d n a 家族混缌，s i t 比 a b s 彳筏a e 譬 a b s t r a c t t h er e m a r k a b l et r a n s i t i o ni nt h em a n u f a c t u r eo f 辨l a c t a ma n t i b i o t i c sa n dt h e i r d e r l v a n t si su n d e r g o i n g t ot h i se f f e c t ，t r a d i t i o n a lc h e m i c a lp r o c e d u r e sa r eg r a d u a l l y b e i n gr e p l a c e db yb i o t r a n s f o r m a t i o n s ，p e n i c i l l i na c y l a s e ( p e n i c i l l i nga c y l a s eo rp e n i - c i l l i ng a m i d a s e ，e c 3 5 1 1 1 ，p g ao rp a c ) i sak i n do f c r i t i c a le n z y m ef o rt h ei n 。 d u s t r i a lp r o d u c t i o no fs e m i - s y n t h e t i c # - l a c t a m a n t i b i o t i c s ，m a i n l yi nu s ef o rh y d r o 1 y z i n gp e n i c i l l i na n dc e p h a l o s p o r i nt op r o d u c i n gn u c l e i6 - a m i n o p e n i c i l l a n i ca c i d ( 6 一a p a ) a n d7 - a m i n o d e s a e e t o x y c e p h a l o s p o r a n i ca c i d ( 7 - a d c a ) ，r e s p e c t i v e l y i tc a l l a l s oc a t a l y z et h er e a c t i o no fp r o d u c i n gn o v e la n t i b i o t i c su s i n g6 - a p ao r7 - a d c a w i t hs i d e c h a i n s ，w h i c hi sk i n e l i c a l l yc o n t r o l l e d + t h em a i no b s t a c l ef o rk i n e t i e a l l y c o n t r o l l e ds y n t h e s e si st h eh y d r o l y s i sa c c o m p a n i e d 。t h e r e f o r e ，s y n t h e s i s h y d r o l y s i s r a t i oi so f t e nr e g a r d e d 箍sa ne f f e c t i v ei n d e xf o rt h es y n t h e t i cp r o c e s s i m p r o v i n gs h i sa l le f f e c t i v em e a n st oi n c r e a s ea n t i b i o t i cp r o d u c t i o na n dd e c r e a s eh y d r o l y s i s 。d n a f a m i l ys h u f f l i n gw a su s e dt oi n c r e a s ep g as hi nac e r t a i ns y n t h e t i cr e a c t i o n + t h e m a i nr e s u l t so ft h i ss t u d yw e r ea sf o l l o w ： ag e n e r a lm e t h o df o rt h ee x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no f p g a sw a sd e v e l o p e db y f u s i n gh i s t a gi n t oap g au s i n gp c r a n de x p r e s s i n gi tw i t h i nap e t - 2 4 a ( 十) p l a s m i d v e c t o r , c r u d ee n z y m e sa f t e rf e r m e n t a t i o nw e r ep u r i f i e du s i n gc o ”一i d aa g a ri no n e s t e p 。a c t i v i t yr e c o v e r yr a t i o so ff o u rk i n d so fr e c o m b i n a n tw i l d - t y p ep g a s ( a f e o a , e c p g a ，k c p g a ，p r p g a ) w e r e2 7 6 ，3 6 ，3 ，3 3 6 a n d1 9 ，7 ，r e s p e c t i v e l y t h e p u r i f i c a t i o nf o l d so f e n z y m e sw e r e4 0 ，1 8 3 ，1 0 7a n d1 7 ，r e s p e c t i v e l y t h es hr a t i o s o ff o u rp u r i f i e dr e c o m b i n a m jp g a si nt h es y n t h e s i so fc e p h a l e x i nw e r er e s p e c t i v e l y 2 5 ，1 3 ，1 7a n d3 3 ac h i m e r i cp o o lo f p g a 穗s u b u n i t sw a so b t a i n e du s i n gd n a f a m i l ys h u f f l i n gb y d i g e s t i n gf i v ep g ag e n e s 删f a e c a t i s 、b + m e g a t e r i u m 、量c o b 、i f c i t r o p h i l a 、贮r e t t g e 。q p g a s ) w i t hr a r er e s t r i c t i o ne n z y m e s 。af r a m e w o r kv e c t o rf o rr e c e i v i n gt h ec h i m e r a l i b r a r yv e a sc o n s t r u c t e db yi n t r o d u c t i o nak p n is i t ea t1 0 5 4b po fk c p g ag e n e t h r o u g hs i l e n ts i t e m u t a t i o n 。b o t hl i b r a r ya n df r a m e w o r kv e c t o rw e r ed i g e s t e dw i t h 3 a b s 丁r a c t n d e i k p n i ，d i g e s t i o np r o d u c tw e r et h e ni i g a t e da n d t r a n s f o r m e d 5 0 0 0c h i m e r av e c t o r t r a n s f o r m a n t si n 层c e l lj m l 0 9 ( d e 3 ) w e r es c r e e n e dt h r o u g hh a l o s ( 2 5m m o l l 7 - a d c aa n d5 0m n l o f ld p g a ) a n d4 0 0c a n d i d a t ec l o n e sw e r eg o t s e l e c t e dm u t a n t sw e r ef e r m e n t e di nt e s tt u b e sa n dc o l l e c t e dc e l l sw e r es u s p e n d e db yt w ok i n d so f s u b s 捃a t es o l u t i o n sa n di n c u b a t e da t3 0 。c a f t e r2 4 h ，r e a c t i o nc o m p o n e n t sw e r ed e - t e r m i n e db yh p l ca n dm u t a n ts t r a i n se x h i b i t i n ga i l 戤l e a s t2 - f o l di n c r e a s e d c e p h a t e x i n p h e n y l g l y c i n ep e a kr a t i o sc o m p a r e dt ok c p g a i nt d i f f e r e n tt i m ec o a r s e s w e r ep i c k e df o rf u r t h e rt e s t i n ga n dt h e i rs e q u e n c e sw e r ea n a l y z e d a l t h o u g ha f t e rs e q u e n c i n gn os i g n i f i c a n tc h i m e r aw e r ef o u n d ，t h e yh a v em u t a t i o n sa n da r ed i f f e r e n tt o f o r m e rs u b u n i tr e c o m b i n a t i o n a g e n e r a lm e t h o do fc l o n i n g ，e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o nv a r i o u sr e c o m b i n a n t p g aw a se s t a b l i s h e d ，w h i c hm a d ei tar e a l i t yt oc o m p a r et h ep r o p e r t i e so fv a r i o u s p g a i n c l u d i n gw h i c hw e r eo b t a i n e df r o ms i t e m u t a t i o na n dd i r e c te v o l u t i o n ( s u b u n i t r e c o m b i n a t i o n ，d n af a m i l ys h u f f l i n g ，g e n o m es h u f f l i n g ，e t c ) aw h o l er o u t eo f h i g h - t h r o u g h o u ts c r e e n i n gs hp r o p e r t yo fp g a v a r i a n t sw a se s t a b l i s h e da n dw e l l u s e dt os c r e e nac h i m e r al i b r a r yc o n s t r u c t e db yd n a f a m i l ys h u f f l i n g t h i ss t u d yl a y t h eb a s i sf o rf u r t h e rp r o t e i ne n g i n e e r i n go np g a s ， k e y w o r d s ：p e n i c i l l i nga c y l a s e ，i m m o b i l i z e dm e t a l ( i o n ) a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , d n a f a m i l ys h u f f l i n g ，s hr a t i o 4 嚣章练述 1 1 青霉素g 酰化酶 第一章综述 毒霉素g 酰纯酶( p e n i c i l l i n g a c y l a s e o r p e n i c i l l i n g a m i d a s e ，e 。c 3 5 1 。l l ， 简称p g a 或p a c ) 魑一种异二聚体n 一端亲核( n t e r m i n a ln u c l e o p h i l e ，n t n ) 丝 氨酸水勰酶( d u g g l e b y e ta t 1 9 9 5 ；o i n o n e n r o u v i n e n2 0 0 0 ) 存在于许多细藏、 酵髯帮丝狡囊菌中。c l a r i d g e e t a l f 1 9 6 0 ) 发臻p g a 能够承瓣惫霉素g 、苯乙疆静 酯和酰胺类以及其它游香羧酸( v 甜l ee ld ，1 9 9 1 ；a r r o y oe ta l , 2 0 0 3 ；e l a n d e r2 0 0 3 ) 。 该酶在工、业上用于大规模水解专霉索g 产生6 。氮基青霉烷酸( 6 - a m i n o p e n i c i l t a n i c a c i d ，6 - a p a ) 辛灸生产半会残誊霉索静超始骤料( v a l l ee ta l 。1 9 9 1 ；b v a g g i n ke ta 1 1 9 9 8 ) ；在偏碱性环境下，p g a 催化街霉素g 水解生成6 - a p a ( 嘲1 i ) ( k i m h o l 2 0 0 1 ；o he ta 1 2 0 0 3 ) ；在酸性或中性坯境下，则可以催化务内酰胺抗生綮母核 一蛳一蒜高令一+ 黼r d、“ 一一帆一 d “ 篡 一蝴1 协帆 、# 备静 h 棒懒牯 乱一- c at - 砒：a 辱吣t 材舳 圈卜1 款孢菌素酰化酶( e a ) 和青甏紊g 酰化酶( p g a ) 的去醮基化反应( o h e ta l 。2 0 0 4 ) p g a 和c a 生履应分别将p g 转化为6 - a p a 和a l - 7 - a c a 转化为7 - a c a ；i i i i 粥p g a 和c a 分别转化 g l - 7 a c a 童7 - a c a 鞠c p c 至7 - a c a 酎，活性与其主教应褶豫较弱。特异您物g l - 7 a c a 、c p c 和 p g 薛铡链分粼是戊= 鼗基、昝氨基已= 醴纂和苯乙魏基。 删 一 。 打 嘲 二一 亨潍 高 捻 第一辩综述 6 - a p a 、7 - 缀基蛾乙溅氧头熬烷酸( 7 - a m i n o d e s a c e t o x y c e p h a l o s p o r a n i ca c i d ， 7 - a d c a ) 、7 - 氨熬头稳烧酸( 7 一a m i n o c e p h a l o s p o r a n i ca c i d ，7 - a c a ) 与苯乙羧类 l 蛙懿酸然镞体发生酸罄亿反应，会戒备穗霞要瀚半合成青霉素氍头稳霉索( d e v r o o m1 9 9 9 ) 。 p g a 在体内俘耀蓬藩还不渗楚， 餐投据e s c h e r i c h i ac o l i 傣态磷究，雄凝 其霹能与戬芳香健台甥为碳滚捩凌下豹代谢有关( b u r l i n g a m e & c h a p m a n1 9 8 3 ) 。 在譬c o l i w 购芳瓣亿台物好氧代落款熬因簇中 ，p g a 豹p a c 基因受p a a x 谖节予攒镁，毽毒壤葵綦中鸯苯五酸嚣寸被转交为攀糇爱孑单位( r o a & g a r c i a 1 9 9 9 ) 。 轴即咖p n 4 m 融4 t 南”铀r i e 钕h b # 0 t ” 轴帆椭t l 钵耐# 酗# 缸# 憾佝 墅1 - 2 c o i l 壤鹳势蚤化会物好氢降瓣 弋溪逡链辩基嚣簇拳意l ；l ( p r i e t oe t a l2 0 0 4 ) 煞蠼簇垃爨参照县c o t i k 1 2 ( h p a 簇帮p a c 嫠斛谨巍辛茳c o t i w 孛，丧c o t i i ( - 1 2 率欺乏 p g a 的合成除了受p a c 基因转录调控外，还受到复杂的翻译和翻译詹调控， 活性p g a 鹃合成黎要严格控制缁魏生长滠嶷 蔻予3 0 。c ( k e i l m a r me ta l1 9 9 3 ) 。 p g a 属于，j 、粪需要缀蛋白水解加工的酶，这类酶的成熟需要去除酶原中的连 接肷( 3 0 5 0a a ) ( h e w i t te ta l2 0 0 0 ) ，戏势浚商滔髋静9 2 k d a 熬矮蓊傣 ( p r e p r o p a c ) 。随聪，p r e p r o p a c 被转运至阁质空闽，n 端信号肽被切除露成为 p r o p a c ，霉经过蛋巍酶分瓣去除漆帮连接默，形成蠡貔噩蒺( 2 3 ，8k d a ) 鞠筘鼗 基( 6 2 2k d a ) ( h e w i t te ta l2 0 0 0 ) 异= 聚体的活性p g a 。( 嘲1 - 3 ) 。 6 繁一牵综述 o 蝴r h m b 憎一 自拍蝌摊翱a i - m 翎娜 燃珏j = 强e 二簋= ：= | u ” 一口* m r m 圈卜3p g a 酶翻译屉加工示意圉( p r i e t oe ta 1 2 0 0 4 l p a c 豢黼编码一多魏前体( p r e p r o p a c ，9 2 k d a ) ，包音一信号靛( s ) 、一d 亚箨( c o 、一连接敞( c ) 和 一声弧赫( 辟) 。信号肽引时p r c p r o p a c 从绑胞质输出到周质夺间中，髓后信号肽被去除，形成p r o p a c 前体。在煳质空间中经美如酶分解蜇自质p m p a c 前体形成成熟的p a c ( 酣8 ) 辩。 l 。2 青霉素g 酰纯酶在多肉酝胺类抗生素生物罐傀合成中的作 麓 伊内酰胺类抗生豢及其衍生物的工业化叠三产讵在发生重大变革，传统化举转 纯法逐步被褥催纯法毅代戮躐少鬣游豫有害( 主黉是纛辊) 浚耱麓产生，避免使 弱枣毒有害试翔秘溶赛。 1 2 。11 9 8 5 冬以嚣攀食成争肉蘸跛类摭生素王她擞产 1 9 2 8 年a l e x a n d e rf l e m i n g 发现p e n i c i l l i u mn o l a t l , m z n ( i i ) q 2 0 ( i i ) 。强 自质保留强度最大螫合众属离子并不是获得最优蛋白质分离效果的必要条件，因 为遗商静绦整强震增加杂矮静暇辩( a r n o l d1 9 9 1 ) 。 匿i 暖 睡蠡 图1 - 1 m a c 孛蛋囱蓑蔽辩鞠解骧瓴瑾示意图( u e d a e t a l2 0 0 3 ) 袭卜1 常见l e w is 酸碱的软礤分级 软硬努缀金嚣离子 软l e w i s 酸 a 矿、e n 竟羿酸c d + 、z 一、c u “、n i “ 硬l e w i s 碱肯氧( 羰蓦) 、禽脂肪族氨( 天冬酰胺、谷爨 酰胺) 、含磷( 磷酸化氨纂酸) 目a 台纂 软l e w i s 碱含硫( 半胱氯酸) 配台基 交界馘含芳香族氮( 组氨酸和色甄酸) 配台基 愈属离子与屡析载体上的螯合剂配垃形成黧台物，剩余会属配位点通卷被水 分子占据，苟被蛋整矮上舍邂鲍逸子供俸基溺掰交羧。除了氨基来溃，一魏氨基 酸盘予其测镶中瓣电子供俸爨子特剐适合进孝子结合；显然诲多残罄，茹g l u 、a s p 、 第一章练述 t y r 、c y s 、h i s 、a r g 、l y s 和m e t ，可以参与结合，i m a c 中对蛋自质的保留实 际上主骚是蒸于组氨酰残基。游离半胱氨酸可与螫合的金属离子结合，但其台适 的还原狄态很少能获彳萼。然而，t i p 、p h e ；f 鹾t y r 韵芳香族侧链在与可接谶的组氨 馥羧鏊| 疆遥时对 采留香一宠 乍鹚( a r n o l d1 9 9 1 ) 。 蛋白璇啜陵鳐合到i m a c 载体上通常在中性或弱碱毪p 珏条件下遗行，在此 p h 下缀氨躐蓦残基中熬黎睦氮缝子饕震予纯获惫。逶常，篌鬻相对高离子强度 的缓冲液( 食o 1 1 0m o l l n a c i ) 以减少嚣姆异性戆邀甥互佟溺，缓羚滚本身 不麓弩熬会豹金滕离子嚣b 像缝合。洗腻屋的蛋囱质邋过质子化、醚像基交