（发酵工程专业论文）啤酒内源性抗氧化物质酚酸的研究.pdf

摘要 摘要 本论文以青岛啤酒为主要研究对象，考察了该品牌啤酒中的l o 种酚酸类物质含量， 初步确定青岛啤酒中各种酚酸的含量范围。结合酚酸类物质含量及其抗氧化能力，将啤 酒中没食子酸和阿魏酸对应的d p p h 清除率之和作为青岛啤酒酚酸总体抗氧化能力的 代表，称为酚酸抗氧化能力。经啤酒老化试验得出，酚酸抗氧化能力与d p p h 清除率、 t r a p 、t b a 的关系之间有较高的乘冥相关性，说明酚酸抗氧化能力可以作为啤酒抗氧 化能力大小的衡量指标之一。分别考察了高中低档啤酒在老化过程中抗氧化能力的变 化，发现酚酸物质含量和抗氧化能力的变化不尽相同，酚酸抗氧化能力在老化初期高于 酒体的d p p h 清除率，后期较d p p h 清除率有明显的降低，说明酚酸物质提供了较多的 抗氧化力，其他的还原性物质在抗老化方面也做出了一定的贡献。 该品牌啤酒所使用的麦芽中，加麦、澳麦、西北几种麦芽中澳麦提供较小的抗氧化 能力，同时提供的老化物质也最少，对提高啤酒的风味稳定性有利。以单位q 酸计， 香花比苦花提供更多的酚酸和抗氧化能力。酒花老化过程损失相当多的酚酸，酿造过程 中应尽量使用新鲜的酒花。在糖化过程中，酚酸物质含量随蛋白质休止温度的升高而降 低；蛋白质休止时间的长短对总多酚含量、酚酸抗氧化能力和d p p h 清除率几乎没有影 响，儿茶素在3 5 m i n 之后含量有明显增加的趋势；糖化时间的长短对酚酸含量和麦汁的 抗氧化能力几乎没有影响。发酵过程中酚酸抗氧化能力和d p p h 清除率几乎没有变化， 发酵第五天后老化物质略有减少，儿茶素在整个发酵过程中有含量增加的趋势。酿造过 程中添加单宁可使酚酸物质含量增加，老化物质含量降低，提高啤酒的抗氧化能力。 建立了反相高效液相色谱检测酒花和啤酒中黄腐酚的方法。色谱条件为w a t e r s l 5 2 5 色谱仪，色谱柱为z o r b a xe c l i p s ex d b 。c 18 ( 4 6 2 5 0 m m ，5 i _ t m ) ；流动相组成为a 相：甲 醇，b 相：水+ 甲酸( 0 1 ) ；柱温2 5 ；检测波长3 7 0 n m ；流速0 4 m l m i m 进样量1 0 9 l ； 梯度洗脱。本方法线性关系良好，简单，准确，酒花和啤酒中的加标回收率分别为 9 5 0 5 1 0 4 3 0 和9 1 2 1 9 5 5 8 之间，检测了不同酒花和啤酒中的黄腐酚含量，酒花 浸膏类产品中黄腐酚含量偏低，不同啤酒中黄腐酚的含量差别较大。 关键词：酚酸；抗氧化能力；高效液相色谱；黄腐酚 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ec o n t e n to f10k i n d so fp h e n o l i ca c i d si nt s i n g t a ob e e rw a sr e s e a r c h e d a n dt h e c o n t e n ts c o p eo fp h e n o l i ca c i d sw a sp r e l i m i n a r yc o n f o r m e d t h ea n t i o x i d a n ta b i l i t yo f p h e n o l i ca c i d sc o u l db ep r e s e n t e db yt h es u mo fd p p hf r e er a d i c a l s c a v e n g i n ga c t i v i t yo f g a l l i ca c i da n df e r u l i ca c i d 。w h i c hw a sc a l l e dt h ea n t i o x i d a n ta b i l i t yo fp h e n o l i ca c i d s t h e r e w a sag o o dr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea n t i o x i d a n ta b i l i t yo fp h e n o l i ca c i d sa n dd p p h s c a v e n g i n gr a t i o ，t r a pv a l u e ，t b av a l u ed u r i n gt h ea g i n gp r o c e s sw h e ni tw a sr e l a t e dt oo n e k i n d o fb e e r t h ec h a n g e so ft h ea n t i o x i d a n ta b i l i t yo fh i g h ，m i d d l e ，l o wb e e rw e r e i n v e s t i g a t e d ，a n di tw a sf o u n dt h a tt h ea n t i o x i d a n ta b i l i t yo fp h e n o l i ca c i d sw a sh i g h e rt h a n d p p hs c a v e n g i n gr a t i oa tt h ei n i t i a la g i n gs t a g ea n dd e c l i n e df a s t e rt h a ni ta tt h el a t ea g i n g s t a g e i tw a ss h o w e dt h a tt h ep h e n o l i ca c i d sp r o v i d em o r ea n t i o x i d a n ta c t i v i t y , a n do t h e r r e d u c i n gs u b s t a n c e sa l s om a k eac o n t r i b u t i o ni na n t i - a g i n gp r o c e s s as m a l l e ra n t i o x i d a n ta b i l i t ya n dt h el o w e s tc o n t e n to fa g i n gm a t e r a lw e r ep r o v i d e db y a u s t r a l i am a l t w h i c hw a so n eo ft h es t u f fo ft h ef i x e db e e la n di tw a sp r o v e dt ob em o r e c o n d u c t i v et ob e e rf l a v o rs t a b i l i t y t h ea n t i o x i d a n ta b i l i t yo fu n i t 。【a c i db ya r o m ah o pw a s s t r o n g e rt h a nb i t t e rh o p p h e n o l i ca c i d sd e c l i n e df a s td u r i n gt h ea g i n gp r o c e s so fh o p d u r i n g t h es a c c h a r i f i c a t i o np r o c e s s ，t h ep h e n o l i ca c i dc o n t e n tw a sd e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo f p r o t e i nr e s tt e m p e r a t u r e ，a n dt h e r ew a sn o ts i g n i f i c a n tc h a n g ew i t ht h ec h a n g eo fp r o t e i nr e s t t i m ea n ds a c c h a r i f i c a t i o nt i m e t h e r ew a sn os i g n i f i c a n tc h a n g eo fp h e n o l i ca c i da n t i o x i d a n t a b i l i t ya n dd p p hs c a v e n g i n gr a t i oi n t h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s + ( 一) c a t e c h i n sh a da n i n c r e a s i n gt r e n di nt h ee n t i r ef e r m e n t a t i o np r o c e s s p h e n o l i ca c i d si n c r e a s e da n da g i n g m a t e r i a l sd e c r e a s e dw i t ha d d i t i o no ft a n n i n a na n a l y t i c a lm e t h o do fx a n t h o h u m o li nh o pa n db e e ru s i n gh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c l h a sb e e n d e v e l o p e d t h es e p a r a t i o n w a sa c h i e v e do n a r e v e r s e d p h a s ea g i l e n tz o r b a xe c l i p s ex d b c 1 8 ( 2 5 0 m m x4 6 m m ，5 “m ) i nal i n e a rg r a d i e n t ， a n dt h em o b i l ep h a s e sw e r ec o n s i s t e do fw a t e rw i t h f o r m i ca c i d ( 0 1 ，v v ) ( a ) a n d m e t h a n o l ( b ) w i t haf l o wr a t eo f0 4m l m i n i na d d i t i o n t h ec o l u m nt e m p e r a t u r ew a s m a i n t a i n e da t2 5 t h ed e t e c t i o nw a v el e n g t hw a ss e ta t37 0 n m t h e r ew a sag o o dl i n e a r r e l a t i o n s h i p t h ea v e r a g er e c o v e r i e so fh o pa n db e e rw e r eb e t w e e n9 5 0 5 一10 4 3 0 a n d 91 2l 9 5 58 a n dr s d 2 i tw a sp r o v e dt ob eac o n v e n i e n ta n da c c u r a t em e t h o df o r a n a l y z i n gx a n t h o h u m o lc o n t e n ti nh o pa n db e e r k e y w o r d s ：p h e n o l i ca c i d s ；a n t i - o x i d a n ta b i l i t y ；h p l c ；x a n t h o h u m o l i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 羔量 日 期： 驾皇型 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、；1 2 编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：互亏 导师始叠鱼 日 期：知9 - 占弓1 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 随着人民生活水平的提高，啤酒也随经济的发展而发展，逐渐从城市走向农村，成 为深受大众喜爱的饮料之一。消费量的增大同时带来了啤酒市场的激烈竞争，企业若想 在竞争中取胜，首先就要提高啤酒质量，让消费者放心、愉快、健康饮用。如何改善啤 酒的风味稳定性一直都是酿造师们关注的问题，美国酿造工业研究所经过1 5 年的研究， 认为酚类物质是影响啤酒风味稳定性的重要因素【1 - 1 1 , 8 。 酚类物质在酿造过程中能够与啤酒中的蛋白质结合，形成混浊，除去啤酒中的混浊 活性蛋白，从而提高啤酒的非生物稳定性【l2 。1 4 】。酚类物质作为弱氧化剂，能够清除人体 内的自由基，起到预防心血管疾病、癌症等疾病的功效【l 孓墙】，另外，酚类物质还对啤酒 的收敛性、苦味、酒体丰满感等有一定的影响。因此对啤酒中酚类物质的研究符合当今 消费者健康安全营养的消费观念，也是提高啤酒质量的主要途径之一。 1 1 1 啤酒中的酚类物质 酚类物质是指芳环上直接连有羟基的酚类及其聚合物的总称，种类繁多，目前已发 现超过8 0 0 0 种，多为植物的次级代谢产物，对植物具有保护作用，并且可以抑制种子 早熟。根据物质结构，啤酒中的酚类物质还可以作如下分类【1 2 l ： ( 1 ) 酚酸类化合物：主要有咖啡酸、香草酸、对羟基苯甲酸和香豆素四种。这些化合 物有的以游离态存在，有的以酯或糖苷形式存在。 ( 2 ) 儿茶酸类化合物：属于黄烷醇的衍生物。 ( 3 ) 黄酮类化合物：主要是堪非醇、皮酮和极少量的杨莓酮，大多以糖苷形式存在。 ( 4 ) 花色素原：包括原花色素和白花色素，其中前花色素是啤酒中的主要花色素原， 是啤酒的非生物混浊物质，也是啤酒的主要色泽物质。 酚类物质因为其含有一定的功能基团而发生作用，并且功能基团在不同位置上的作 用不同，因此可以按功能基团分类，酚类物质主要的几类结构如图1 1 。 二西i一 苯甲酸 水杨酸( 2 - o h ) 龙胆酸( 2 ，5 一o h ) 原儿茶酸( 3 ，4 一o h ) 没食子酸( 3 ，4 ，5 - o h ) 4 5 苯丙烯酸 p - 香豆酸( 4 - o h ) 咖啡酸( 3 ，4 - o h ) 阿魏酸( 4 - o h 3 - o c hs ) o 黄酮酸 槲皮素( 3 , 5 ，7 ，3 ，4 一o h ) h r l 、 r 2 0 雌 儿茶素 ( + ) - 儿茶素( r 1 = h r 3 = o h ) ( - ) - 表儿茶素 ( r 1 2 h r 2 = o h r 3 = h ) 图1 - 1 酚类物质母体结构图 f i g 1 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fp o l y p h e n o l s 啤酒中酚类物质的主要来源为大麦芽和啤酒花。麦芽中含有很多简单酚酸类和多酚 瓣文 江南大学硕士学位论文 物质，约占大麦干重的o 1 o 3 ，啤酒中8 0 的酚类物质来自麦芽，它们多存于麦皮、 糊粉层、胚乳以及储藏蛋白中，是黄烷基的单体多酚，如花色苷、儿茶酸及其低聚体【8 】， 对发芽有一定的抑制作用，使啤酒具有涩味。另外酒花中的酚类物质约占酒花干重的4 8 ，主要存在于酒花的前叶片及蛇麻腺中，在酿造过程中与蛋白质结合产生凝固物沉 淀，有利于啤酒的稳定【1 ，9 】。 1 1 2 啤酒中酚类物质的保健作用 酚类物质能够影响啤酒的收敛性、苦味、酒体丰满感等。酚类物质因其在酿造过程 中与啤酒中的蛋白质结合，形成混浊，影响啤酒的非生物稳定性。酚类物质作为弱氧化 剂，能够清除人体内的自由基，起到预防心血管疾病、癌症等疾病的功效f 1 3 。8 1 ，酚类物 质抗氧化作用主要表现为【6 ，7 】： 1 清除具有破坏性的自由基如o 、r o 2 和h o ，这些自由基具有强烈的氧化作用 可破坏活细胞。 2 抑制脂质过氧化反应。 3 作为金属螯合剂，能够螯合过渡态铁离子和铜离子。 随着生活水平的提高，人们越来越关注食品的保健作用。以色列一些学者指出每天 饮用1 2 盎司啤酒可以预防心脏病，他们表示，饮用啤酒可以降低胆固醇含量、增强抗 氧化性、降低纤维蛋白的含量从而保护心脏，酚类物质在这个过程中起主要作用。他们 首先提出酒精饮料引起纤维蛋白原的结构变化使凝血蛋白活性降低。 大量研究表明，酒花中黄酮类化合物具有抗动脉硬化、降低胆固醇、解痉、防辐射 作用。酒花中特有的黄腐酚成为近几年医学界研究的热点，主要由酒花蛇麻腺分泌产生， 是酒花树脂的一部分，目前被发现仅存在于酒花中，具有抗癌、抗病毒、预防动脉样硬 化和糖尿病、抗氧化等生理功能【1 9 。2 2 】。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 啤酒中酚类物质作用机理的研究 近年来，对于酚类物质对啤酒风味稳定性的影响，研究人员已经提出多种反应机理， 其中自由基理论被广为接受。 自由基是指含有孤立的不成对价电子的原子或原子基团，种类很多，较活泼的是氧 自由基，又称活性氧，包括：羟自由基( o h ) 、超氧阴离子自由基( 0 2 。) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、 单线态氧( 1 0 2 ) 以及由此衍生的烷氧自由基( r o ) 、氢过氧基( h 0 2 ) 、氢过氧化物( r o o h ) 、 烷基过氧化物自由基( r o o ) 。自由基不仅对啤酒风味稳定性产生影响，还对啤酒中老化 物质及混浊物质的形成存在影响，在众多氧自由基中，o h 一基自由基被认为是最活泼的 自由基，它能够与啤酒中的异律草酮、不饱和脂肪酸、高级醇、发生反应，导致啤酒老 化【1 。 根据f o n t o n 反应原理，在有过渡态金属离子如f e 2 + 和c u + 存在时，h 2 0 2 易产生o h 基 2 第一章绪论 f e 2 + 十h 2 0 2 f e 3 + + ) h + o h 酚类物质具有螯合金属离子的作用，从而有利于啤酒中自由基生成量的减少。 h a n a s a k i y 【2 4 】研究了1 5 种类黄酮类化合物对o h 和o 2 的清除能力，发现表儿茶素、 儿茶素、芸香苷和7 ，8 二氢黄酮对o h 的清除能力是甘露醇的1 0 0 3 0 0 倍，具有特异清 除羟基自由基的能力，而桑色素、5 , 6 ，7 一三羟黄酮、杨梅酮、和槲皮素在含量高于5 0 1 , t m o l l 时，不仅不能够清除羟基自由基，反而在f o n t o n 反应中增加羟基自由基的含量。除单 羟基黄酮外，其它类黄酮都具有清除o - 2 。自由基的能力。桑色素虽然没有清除o h 和o 2 的能力，但是仍然具有一定的抗氧化能力。 1 2 2 啤酒中酚类物质的研究方法与主要结论 对于多酚和蛋白质共同作用影响啤酒非生物稳定性的问题大家已经做了非常深入 的研究，作用机理也比较成熟，稳定性的问题也已得到基本解决。近年来，研究人员更 加侧重于对啤酒风味稳定性的研究，并且通过大量实验建立了多种评价酚类物质抗氧化 能力的方法，包括d p p h ( 1 ，1 二苯基苦基苯肼) 自由基反应实验、t r o l o x 等价实验( t e a c ) 、 和2 ，2 连氮3 乙基苯并噻唑6 磺实验等。 随着自由基理论的提出，采用e s r 研究分析啤酒中的自由基，以及相关物质的作 用逐渐发展起来，对于采用e s r 技术研究啤酒中自由基的技术是从1 9 8 8 年k a n e d a 等 人【2 弛6 】首次采用以p b n ( 2 苯叔丁基硝酮) 为捕集剂的e s r 法测定啤酒中自由基开始的， 经过研究，根据加成物e s r 谱初步认定o h 是啤酒中最主要的自由基，并可能是通过 f o n t o n 反应由f e 2 + 、c u + 等过渡态金属离子催化h 2 0 2 产生。1 9 9 6 年u c h i d a 等人【2 7 ，2 8 】经 过研究发现高温过程、发酵和过滤是啤酒酿造过程产生自由基最多的三个阶段，初步提 出评价啤酒抗氧化力和老化程度的新指标一迟滞时间( 1 a gt i m e ) 。严敏【2 州在啤酒中添加( + ) 儿茶素后的o h 生成速率明显下降，但迟滞时间没有变化，说明酚类物质对于迟滞时间 之后自由基的生成有抑制作用；相对于直接影响迟滞时间的s 0 2 来说，此类清除剂的作 用缓慢而持久，对啤酒整体抗氧化力的影响较为明显。 刘群涛【3 0 】研究了国内外不同品牌啤酒中的十种主要的酚酸，认为没食子酸和儿茶素 是其中最重要的酚酸，并提出将酚酸的抗氧化能力作为衡量啤酒抗氧化能力大小的指标 之一。但是至今仍未有人得出多少剂量的抗氧化剂才有效的结论。 1 2 3 抗癌物质黄腐酚的研究进展 黄腐酚是一种含异戊二烯基的查耳酮，1 9 1 3 年被p o w e r 等人首先分离并进行了鉴 定和命名，主要存在于酒花中，由酒花蛇麻腺分泌产生，占酒花干重的0 1 1 。黄腐酚 具有清除自由基和抗氧化的能力，因为其抗癌作用近年来成为医学界的研究热点，研究 者们通过大量的体外试验和动物实验，研究了黄腐酚对不同癌症，包括乳腺癌、结肠癌、 前列腺癌等的防治机理，发现黄腐酚预防癌症的作用机理主要有：抑制诱导前致癌物质 向致癌物转变的酶的活性、诱导致癌剂解毒酶的催化活性、禁止癌细胞在早期的增长。 黄腐酚还具有抗病毒、预防动脉样硬化和糖尿病、抗氧化等生理功能【1 9 - 2 2 , 3 1 - 3 6 】。但是其 作用机理还有待进一步研究，黄腐酚在人体内的代谢和吸收的研究仍处于空白状态。 3 江南大学硕士学位论文 1 3 立题背景 关于啤酒酚类物质的研究已有几十年的历史，国内外研究人员在这方面作了很多工 作，研究了酚类物质的作用机理并建立了多种可能的反应模型，对酚类物质的提取方法， 定性定量检测方法进行了研究和完善。 近几年我国的啤酒事业发展迅速，啤酒产量已跃居世界第一位，人均年消费量达 3 0 l ，啤酒企业发展趋向集团化，但是市场竞争更加激烈造成啤酒价格持续下降，给不 少企业带来很大冲击，要在这种形势下保持企业的发展，提高啤酒质量是首选。具有良 好的非生物稳定性和风味稳定性的啤酒是酿造者们追求的目标，酚类物质在这方面起着 举足轻重的作用。 1 4 主要研究内容 本实验室曾经以国内外各品牌啤酒为对象，研究了啤酒中酚酸含量及酚酸对啤酒风 味稳定性的影响。为了进一步了解国内啤酒的发展状况，本研究选择国内最具代表性的 青岛啤酒为主要研究对象，研究啤酒中各种酚酸类物质对啤酒内源性抗氧化力的贡献， 以及对啤酒老化以及风味的影响程度，确定对青岛啤酒有营养价值的酚酸物质种类，并 从其使用的原料和工艺着手研究酿造过程对酚酸抗氧化力的影响。同时考察了部分工艺 条件对酚酸含量和抗氧化能力的影响。本论文也对酒花中特有的黄腐酚进行了初步研 究。 本论文主要进行了以下几个方面的探索： 1 、研究不同酚酸抗氧化能力的强弱，确定对青岛啤酒内源性抗氧化能力贡献较大 的酚酸种类，并考察酚酸物质抗氧化能力与啤酒风味老化之间的关系。 2 、从生产原料和工艺条件出发研究酚酸抗氧化能力的变化。 3 、建立反相高效液相色谱法( r p h p l c ) 澳, u 定酒花和啤酒中黄腐酚的方法。 4 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 材料与试剂 原儿茶酸、儿茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、p 香豆酸、阿魏酸和槲 皮素、黄腐酚标准品购自s i g m a 公司，没食子酸标准品购自百灵威化学试剂公司。乙酸 乙酯、冰醋酸、乙醚、无水乙醇、硫代巴比妥酸、碘化钾、碘酸钾、羧甲基纤维素钠、 氨水、硫代巴比妥酸均为分析纯。甲醇，乙腈为色谱纯，水为超纯水。0 4 5 t m 有机相 和无机相微孔滤膜。2 ，2 。连氮( 3 苯乙基噻唑啉6 一磺酸盐) ( a b t s ，日本和光纯药株式会 社) ，2 ，2 偶氮( 2 脒基丙烷) - - 氢化物( a a p h ，s i g m a - a l d r i c h 化学试剂公司) ，二苯代苦味 酰肼自由基( d p p h ，9 0 ，东京工业株式会社) 。酚酸含量调查所用啤酒样品为青岛啤酒 厂提供，详情见表2 1 。黄腐酚含量调查所用酒样为市售啤酒，详情见表2 2 。酒花，麦 芽为青岛啤酒厂提供。 表2 - 11 2 种青岛啤酒的特性 t a b l e2 1c h a r a c t e r i s t i c so f12k i n d so ft s i n g t a ob e e r 2 2 仪器 w a t e r s1 5 2 5 泵；w a t e r s2 4 8 7 检测器；w a t e r s7 1 7 进样器；b r e e z e 3 0 色谱工作站。 k q 3 2 0 0 d b 型数控超声波清洗器；i k ar v 1 0 旋转蒸发仪；电子精密天平；d l f u w 2 2 0 5 0 型e b c 磨( 德国b u h l e r - m i a g 公司) ，协定糖化仪( 杭州博日科技有限公司) ，家用粉碎榨汁 机，分光光度计( 上海u n i c o 公司) 。 江南大学硕士学位论文 2 3 试验与分析方法 2 3 1 酚酸色谱分析方法 2 3 1 1 溶液配n t 3 0 】 a 单标配制：分别准确称取0 0 1 0 0g 酚酸标样，用甲醇水( 5 0 ：5 0 ) 溶解后，定容于 1 0m l 容量瓶，低温避光保存，一个月重新配制新鲜溶液。 b 混标配制：从配好的单标溶液中各取lm l ，移入容器中，配制成5 0 的甲醇溶 剂的混标，现用现配。可按需要稀释成不同浓度。 c 洗脱液配制：按洗脱液组成条件，b 相：甲醇+ 冰醋酸( 0 1 ) ，a 相：水+ 冰醋 酸( o 1 ) ，定量移取甲醇、乙酸于容量瓶中，然后用超纯水定容至刻度线，配制成a 、 b 两种洗脱液，现用现配。 2 3 1 2 样品预处理方法【3 0 】 a 啤酒和麦汁样品预处理：1 0 0 m l 除气啤酒( 麦汁) ，3 7 磷酸调节p h 为2 ，加 n a c l2 0g ，1 0 0m l 乙酸乙酯萃取3 次，有机相4 0 真空旋转蒸发至干，4m l 甲醇水 ( 5 0 ：5 0 ) 溶解，o 4 5l x m 微孔滤膜过滤。低温避光保存备用。 b 麦芽预处理：麦芽经粉碎后，用5 0 甲醇超声提取6 0 m i n ，离心分离得上清液。 经0 4 5 9 m 微孔滤膜过滤，冷冻保存备用。 c 酒花预处理：酒花经粉碎后，精确称量1 9 酒花粉末加入7 m l 无水乙醚摇动1 5 m i n 后超声波5 m i n ，1 5 0 0 x g 离心1 0 m i n ，去除上清液，再加入2 0 m l5 0 甲醇溶液摇动1 5 m i n 后超声6 0 m i n ，15 0 0 x g 离心10 m i n ，上清液经0 4 5 p , m 微孔滤膜过滤冷冻保存备用。 2 3 1 3 色谱分析条件【3 0 】 表2 - 3 梯度洗脱条件 t a b l e2 3g r a d i e n tc o n d i t i o nf o re l u a n t t i m e ( m i n ) 0 1 54 55 05 26 0 流动相a ( ) 9 58 04 02 0 9 5 9 5 流动相b ( ) 52 06 0 8 055 瞬 i q qz p 母jq9哪。o：9 0 p 耵，l 邮l e ( 1 2 食子酸；2 原儿荼酸；3 儿茶素；4 香草酸；5 咖啡酸；6 丁香酸；7 表儿荼素；8p 番豆酸；9 阿魏酸；l o 槲皮素) 图2 1 l o 种酚酸标准h p l c u v 色谱图 f i g 2 - 1h p l c - u vc h r o m a t o g r a r no f10k i n d so fp h e n o l i ca c i d ss t a n d a r dc o m p o u n d z o r b a xe c l i p s ex d b c 1 s ( 4 6 x 2 5 0n n l ，5 岬) 色谱柱( 安捷伦公司) ，流动相梯度洗脱( 见 表2 3 ) ，在紫外检测波长2 8 0n l t l 和2 5 4n m ( 原儿茶酸，香草酸和槲皮素在2 5 4h i l l ，其 6 第二章材料与方法 余在2 8 0n m ) 处检测；柱温2 0 ；流速1m l m i n ；进样量l o 此。标样色谱图见图2 1 所示。 2 3 2 黄腐酚色谱分析处理方法 2 3 2 1 溶液配制 a 标样配制：精确称取黄腐酚标准品0 0 0 1 0g 用甲醇溶解，定容到1 0 m l ，按照 需要稀释成不同浓度，冷冻保存备用，每个月新鲜配制。 b 流动相配制：按洗脱液组成条件，a 相：甲醇b 相：水+ 甲酸( 0 1 ) ，定量移取 水、甲酸于容量瓶中，然后用超纯水定容至刻度线，配制成a 、b 两种洗脱液，0 4 5 1 a m 微孔滤膜过滤，现配现用。 2 3 2 2 样品处理方法 a 酒花预处理：称取酒花颗粒约0 2 9 ，加入2 0 m l 甲醇甲酸混合液( 甲醇：甲酸 = 9 9 ：1 ) ，超声波超声2 0 m i n ， 3 5 0 0 9 离心5 m i n ，收集上清液，沉淀用同样步骤进行二 次萃取，将上清液充分混匀，用0 2 2 p m 有机膜过滤，冷冻保存备用。 b 液液萃取：1 0 0m l 除气啤酒，体积分数3 7 h 3p 0 4 调节p h 为2 ，加n a c l2 0g ， 1 0 0m l 乙酸乙酯萃取3 次，有机相4 0 。c 真空旋转蒸发至干，4m l v ( 甲醇) ：v ( 水) = 5 0 ：5 0 溶解，0 4 5p m 微孔滤膜过滤，低温避光保存备用。 c 固相萃取：w a t e r s5 0 0 m gs e p - p a kc 1 8 小柱用5m l 甲醇活化，1 0m l 超纯水洗， 2 5m l 除气啤酒用3 7 h 3p 0 4 ( v v ) 调p h 为1 5 后过柱，用1 2m l 乙腈洗提，有机相4 0 旋转蒸发至干，4m l 甲醇溶解，0 4 5 m 有机膜过滤，冷冻保存备用。 2 3 3 常规指标检测方法 a 0 l 酸、p 酸的测定：啤酒工业手册仪酸、p 酸的测定 酒花劣化度= 6 1 8 0 + 1 0 2 l o g ( o t 一酸含量p 酸含量) b 总多酚含量测定3 7 】 取1 0 0 0m l 经除气的酒样和8 0m l 羧甲基纤维素溶液置于2 5m l 容量瓶中，充分 混匀；加o 5m l 铁试剂( 3 5 新的绿色柠檬酸铁铵) ，充分混匀；加入o 5m l 氨水( 1 ：2 ) ， 再充分混匀。用水稀释到刻度，混匀，放置1 0m i n 后比色。以不加铁试剂的同样操作 为空白。在6 0 0 n m 处用l o m m 比色池，以空白为对照使用分光度计测定样品溶液的吸 光度。 总多酚物质( m g l ) = 吸光度值8 2 0 c d p p h 清除率测定【3 8 】 准确称取1 0m gd p p h ，用无水乙醇溶解并定容至2 5 0m l ，配制成d p p h 溶液。将 2m l 待测液及2m ld p p h 溶液置于一具塞试管中，混匀，室温暗室放置6 0m i n ，以无 水乙醇为空白于5 1 7n n l 测其吸光度加。 按下式计算清除率： 清除率： 1 竺垒蔓】1 0 0 7 江南大学硕士学位论文 式中：a c ： 2m l 无水乙醇加2m ld p p h 溶液的吸光度 a i ：2m l 待测液加2m l d p p h 溶液的吸光度 a i ： 2m l 待测液加2m l 无水乙醇的吸光度 d t r a p 值测定例 取4 0 此样品加入5m l 反应混合液( 含有7 5 pm o l la t b s 和2 m m o l la a p h 的 5 0m m o l l 醋酸盐缓冲液 ( p h 4 3 ) 反应混合液，在4 5 。c 水浴反应6 0 m i n ，冷却至室温备 用。) 中，2 5 水浴保温1 5m i n ，比色；另取4 0 “l 的5 0m m o l l 醋酸缓冲液( p h 4 3 ) 代替样品作空白，其它操作相同；然后取4 0 此1m m o l l 抗坏血酸盐溶液作标准参照， 实验操作相同。 计算：t r a p 值( m m o l l ) = ( a 样- a 空白) ( a 标- a 空白) c 标 注：c 为抗坏血酸盐浓度：a 为吸光值；t r a p 表示相当于多少m m o l l 抗坏血酸。 e t b a 值测定【3 9 】 准确配制含3 3 硫代巴比妥酸的5 0 乙酸溶液，该溶液需新鲜配制。取澄清样品5 m l ，添加2m lt b a 乙酸溶液，混合均匀，6 0 水浴6 0m i n ，迅速冷却，在5 3 0n l t l 下 比色；同时取5m l 样品，加2m l 蒸馏水代替t b a 试剂，做空白。吸光度值即表示老 化前驱物的含量。 f s i ( s t a b i l i t yi n d e x ) 系数：基于d p p h 清除率和t b a 值得到的一个系数，反应风 味稳定性。s i = d p p h 清除率x 1 0 0 t b a 值。 2 3 4 实验方法 a 麦汁制备 a 协定糖化：麦芽由e b c 磨粉碎后，加入4 5 酿造水，蛋白质休止3 0 m i n 后升温 至7 0 保温6 0 m i n ，降温过滤，备用。 b 全麦麦汁制备：麦芽由e b c 磨粉碎后，加入4 5 c 酿造水，蛋白质休止4 0 m i n 后 6 3 保温5 0 m i n ，升温至7 2 保温2 0 m i n ，然后至7 8 保温1 0 m i n 过滤，备用。 b 酒花添加试验 酒花添加按照啤酒苦味值1 1 ，酒花添加量为7 m g la 酸，酒花利用率为3 0 计。在 考察不同酒花对麦汁中酚酸含量的影响时，按照等量a _ 酸添加酒花，其中苦花在煮沸过 程进行到一半时添加，香花在煮沸结束前l o m i n 添加，煮沸时间6 0 m i n 。 在考察不同时间点添加酒花对麦汁抗氧化能力的影响时，分别在麦汁煮沸1 0 m i n 、 2 0 m i n 、3 0 m i n 、4 0 m i n 、5 0 m i n 时添加等量酒花，煮沸时间6 0 m i n 。将煮沸后的麦汁定容 到原体积，测定麦汁浓度，并将数值换算到相同麦汁浓度进行比较。 c 食用单宁添加试验 取1 0 。p 左右的麦汁3 0 0 m l ，煮沸6 0 m i n ，在煮沸结束前1 0 m i n 时加入不同量食用单 宁，以不添加单宁的麦汁为空白，煮沸结束后回复原体积，过滤，测定麦汁浓度，并将 检测数值换算到相同麦汁浓度进行比较。 8 第三章结果与讨论 第三章结果与讨论 3 1 青岛啤酒酚酸类物质抗氧化能力评价 啤酒作为大众喜欢的饮品，其风味稳定性是质量的重要指标，提高风味稳定性主要 是延缓啤酒氧化老化，2 0 世纪3 0 年代后期，k l i m o v i t z 和k i n d r a k a l 4 0 1 提出通过添加抗坏 血酸盐和亚硫酸盐来防止啤酒的氧化并获得一定的效果，但是近年来随着消费者消费意 识的改变和相关规则的出台，使用天然抗氧化剂成为趋势。因此在酿造过程中如何保护 和提高内源性抗氧化物是提高啤酒质量的主要途径。 酚类物质是啤酒中的内源性抗氧化物质，对啤酒的口感、色泽、非生物稳定性及风 味稳定性有重要影响，其中以游离形式或以脂及糖苷的形式存在的酚酸类单宁一酚酸具 有还原性，是啤酒主要的内源性抗氧化物质之一。酚酸的分析鉴定工作已经开展多年 4 1 , 4 2 】，随着高效液相色谱( h p l c ) 技术、液相质谱联用( l c m c ) 、核磁共振( n m r ) 等先 进技术的普及，目前已检出4 0 多种酚酸。本实验室根据有关报道 1 , 4 1 j ，选择1 0 种含量 较高的酚酸：没食子酸、原儿茶素、儿茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、p 香豆酸、阿魏酸和槲皮素为研究对象，建立了高效液相紫外色谱检测酚酸的方法，并对 啤酒中的酚酸物质抗氧化能力进行了初步研究。 本节在前人工作的基础上，进一步研究青岛啤酒中酚酸类物质对啤酒内源性抗氧化 能力的贡献，并通过老化试验考察酚酸物质抗氧化能力与啤酒风味老化的关系。 3 1 1 青岛啤酒中酚酸物质含量检测 本实验室曾经研究了市售不同品牌啤酒中酚酸物质含量，并进行了分析，结果表明 不同的生产原料和酿造工艺酚酸物质含量差别明显，为了进一步考察国内啤酒的发展状 况，我们选择国内最具代表性的品牌青岛啤酒作为研究对象。 从青岛啤酒选取1 2 种产品按照2 3 1 2 方法处理，检测其中酚酸含量，并用s p s s 软件进行描述性分析，结果见表3 1 和表3 2 。 表3 - 1 啤酒中各种酚酸物质含量( m 叽) t a b l e3 - 1p h e n o l i ca c i d sc o n t e n ti n12b e e rs a m p l e s ( m g l ) 9 江南大学硕士学位论文 表3 - 2 啤酒中酚酸物质含量分析 没食了酸原儿茶酸儿茶素香草酸咖啡酸丁香酸表儿茶索 p - 香豆酸阿魏酸槲皮素 从结果来看，在偏度和峰度上，酚酸含量并不成正态分布，除没食子酸、香草酸、 槲皮素为负偏峰外，其余均为正偏峰。不同种类的啤酒中各种酚酸含量不同，中值和平 均值相差不大，酚酸含量的差异可能与其生产原料、加工工艺的不同有关。参考本实验 室之前的啤酒酚酸含量普查结果1 3 0 1 ，在平均含量水平上，青岛啤酒中没食子酸、香草酸、 咖啡酸、丁香酸、阿魏酸的含量较高，原儿茶素、儿茶素、表儿茶素含量较低。 为了更加直观地分析数据，将不同浓度的啤酒统一折换为1 0 。p 计，结果如表3 3 。 表3 - 3 同一麦汁浓度的酚酸物质含量( m g l ) ( 以1 0 。p 计) t a b l e3 - 3c o n t e n to fp h e n o l i ca c i d so fs i n g l e u n i tw o r tc o n c e n t r a t i o n s 从折合为1 0 0 p 之后的酚酸含量来看，1 0 。p 啤酒各种酚酸含量均高于1 1 0 p 啤酒， 而7 种8 0 p 啤酒中有近半数啤酒的没食子酸和阿魏酸含量高于1 0 0 p 啤酒，这可能与其 所使用的原料有关，原麦汁浓度较高的啤酒多使用一定比例的进口麦芽，原麦汁浓度较 低的啤酒大部分使用国产麦芽。8 。p 啤酒中除儿茶素和表儿茶素低于1 0 。p 啤酒外，其 他酚酸物质含量相当。不同啤酒单位麦汁浓度的酚酸含量不同，是生产原料、酿造工艺、 1 0 第三章结果与讨论 贮酒时间等众多因素综合作用的结果，需要根据各方面差异进行具体分析。 3 1 2 啤酒中酚酸物质抗氧化能力的评价方法 k a n e d a 和l e n t i n i 掣5 2 ，5 3 1 经研究发现，啤酒清除d p p h 自由基的能力随酚类物质含 量的变化明显变化，而采用p b n 作为自由基捕集剂的e s r 试验不能体现酚酸含量的变 化。因此采用测定d p p h 清除率的方法比较酚酸的抗氧化能力。 表3 41 2 种啤酒酚酸抗氧化能力与抗氧化能力评价指标的相关性 t a b l e3 - 4c o r r e l a t i o n sb e t w e e na n t i o x i d a n ta b i l i t yo fp h e n o l i ca c i d sa n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f b e e r 注：+ 表不在p o 0 5 显著，+ 表4 i 在p 西北。 3 2 2 酒花对酚酸含量和抗氧化能力的影响 啤酒中有相当一部分的酚类物质是由酒花提供的，酿造过程中，酒花不仅能够提供 单体酚类物质，还能够提供相当一部分的大分子酚类物质，酒花提供的多酚在煮沸过程 中能够起到保护作用，可对啤酒风味及风味稳定性产生重要影响，因此酿造过程添加酒 花意义重大。考察了青岛大花、札一、马可波罗、斯丹纳、哈拉道等5 种酒花的酚酸含 量以及添加酒花后麦汁抗氧化能力的变化。 a 不同酒花中酚酸物质含量调查 取该品牌啤酒使用的五种酒花进行酚酸含量检测，结果见表3 - 6 。 表3 - 65 种酒花中的酚酸含量( r t g g ，干计) t a b l e3 - 6p h e n o l i ca c i d sc o n t e n to f5k i n d so fh o p 从表3 6 可以看到，札一香花含儿茶素的含量最高，青岛大花和马可波罗的阿魏酸 与p 香豆酸含量都高于其他几种酒花，斯丹纳和札一香花的没食子酸含量较高。在酿造