（果树学专业论文）筛选与桃花粉育性基因连锁的分子标记及SCAR标记的转化.pdf

摘要 桃花粉可育，不育性状是衡量果实产量的一个重要指标，寻找与桃花粉可育 不育基因紧密连锁的分子标记，对开展桃的育种工作具有重要意义。本试验以重 阳红大久保杂交获得的3 2 株f 1 代群体为试材，利用r a p d 、a f l p 技术对桃 花粉可育不育性状进行研究。主要研究结果如下： 以改良的c t a b 法提取基因组d n a ，经过检测，适合于r a p d 、a f l p 分析 的需要。优化了桃适宜的r a p d 反应体系：总反应体积为2 5 i _ t l ，其中模板d n a 4 0 n g ，m 够lz 2 0 m m ，d n t p1 5 0 1 1 m ，1 0 b u f f e r2 ，5 9 l ，t a qd n a 聚合酶1 u ，p r i m e r 2 0 p m o l ，余下的用d d h 。0 补充。 采用b s a 法，从f 1 代个体中随机选取5 株样品d n a 等量混合，构成花粉 可育和不育基因池。利用1 8 0 个r a p d 引物，筛选出了两个与桃花粉育性基因连 锁的r a p d 标记0 p w 0 3 9 0 0 、o p w 0 3 1 3 0 0 ，经过j o i n m a p 3 0 软件的分析， 确定该标记与桃花粉育性基因的遗传连锁距离为6 4 6 c m 和1 5 0 2 c m 。 利用9 6 对a f l p 引物组合，筛选出1 6 个引物组合在桃花粉育性基因池中表 现多态性，通过f 。代分离群体验证，结果表明：绝大多数片段与花粉育性基因 p s p s 无连锁关系，只有引物组合e + a t m d + c t t 扩增的片段( 4 0 0 b p ) 与目标性 状发生分离。但该标记的重组率较高，为2 8 1 ，与桃花粉育性基因p s p s 的连 锁距离为3 2 0 4 c m 。 把与桃花粉育性基因连锁的r a p d 标记o p w 0 3 9 0 0 转化为s c a r 标记 s c w 0 3 9 0 6 ，该序列已被g e n e b a n k 收录，登录号为d q 6 5 9 6 7 6 。摸索了与桃花 粉育性基 ( p s p s ) 连锁s c a r 标记的p c r 退火温度，最终确定扩增程序为：9 4 预变性5m i n ；9 4 。c 变性4 5 s ，6 8 。c 退火4 5 s ，7 2 延伸1m i n ，3 5 个循环； 7 2 。c 终延伸5m i n ；4 。c 终止。通过后代群体及品种验证，表明已成功转化为与 桃花粉育性基因连锁的s c a r 标记，可以作为桃花粉育性基因的鉴定标记。 关键词：桃；r a p d ；a f l p ；s c a r ；花粉育性 a b s t r a c t p o l l e ns t e r i l i t yc h a r a c t e ro fp e a c ht a k e sa sas i g n i f i c a n tv a l u ew h i c hw e i g h sf r u i to u t p u li n s e a r c ho fm o l e c u l a rm a r k e r sw h i c ht i g h t l yl i n k e dt op o l l e ns t e r i l i t yg e n e ，a si th a ss i g n i f i c a n c eo f p e a c hb r e e d i n g i nt h i sr e s e a r c h ，m o l e c u l a rm a r k e r sl i n k e dt op o l l e ns t e r i l i t yc h a r a c t e ro fp e a c h w e r es t u d i e dw i t hr a p da n da f l pt e c h n o l o g yi n3 2f l p o l u l a t i o nh y b r i d e df r o mc h o n g y a n g h n n gp e a c ha n dd a j i u b a op e a c h t h em a t r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： t h r o u g hd e t e c t i n g ，g e n o m ed n aw a se x t r a c t e db yi m p r o v e dc t a bm e t h o dw h i c hw a s s u i t a b l ef o ra n a l y s i so fr a p d 、a f l pr a p dr e a c t i o ns y s t e mo fp e a c hw a so p t i m i z e d ：t o t a l v o l u m ew a s2 5m ，m c l u d i n go f4 0 n gt e m p l a t ed n a ，2 0 m mm g c l 2 ，1 5 0 9 md n r p 2 5 p 1l o x b u f f e r , 1 ut a qd n ap o l y m e r a s e ，2 0 p m o lp r i m e r , t h er e s tw a ss u p p l i e dw i t hd d h 2 0 a d o p t i n gb s am e t h o d , s a m p l ed n ao f5i n d i v i d u a l sw e r es e l e c t e df r o mf lp o l u l a t i o nm i x e d e q u a l l ya n dc o n s i s t e do fg e n ep o o lo fp o l l e nf e r t i l i t ya n ds t e r i l i t y u t i l i z i n g1 8 0r a p dp d m e r s ， t w ol i n k e dr a p dm a r k e r s ( o p w 0 3 9 0 0a n do p w 0 3 - 1 3 0 0 ) w e r es c r e e n e d , t h eg e n e t i cd i s t a n c e w h i c hl i n k e dt op o l l e ns t e r i l i t yo f p e a c hw e r e6 4 6 e ma n d1 5 0 2 c mr e s p e c t i v e l y 1 6p r i m e rc o m b i n a t i o n sw h i c hr e p r e s e n t e dp o l y m o r p h i s mi i l p o l l e ns t e r i l i yw e r es c r e e n e d f r o m9 6a f l pp r i m e rc o m b i n a t i o n s ，t h r o u g hi d e n t i f i c a t i o no ff 1p o l u l a t i o n ，t h er e s u l t si n d i c a t e ： t h e r ew e r en ol i n k a g er e l a t i o nb e t w e e nm o s tf r a g m e n t sa n dp s l p s ，f r a g m e n tw a ss e g r e g a t ef r o m p s s w h i c h o n l y p r i m e r e + a t m + c t t a m p l i f i e d ( 4 0 0 b p ) b u tr e c o m b i n a t i o n w a s t o oh i g h ( 2 8 1 、 a n dt h el i n k a g ed i s t a n c ew a s3 2 0 4 c m c o n v e r s i o no p w 0 3 - 9 0 0o fr a p dw h i c hl i n k e dt o p o l l e ns t e r i l i t yg e n et os c w 0 3 9 0 6o f s c a rm a r k e r t h i ss e q u e n c ew a sa d o p t e db yg e n e b a n k , a n dt h e l o g g i n gn u m b e ri sd q 6 5 9 6 7 6 p c ra n n e a lt e m p e r a t u r eo fs c a rw o sg r o p p e dw h i c hl i n k e dt o p s p s ，t h ea m p l i f i c a t i o nw a s c a r d e do u t ：9 4 ( 2 p r e 。d e n a t u r i n g5m i n ；9 4 * cd e n a t u r i n g4 5 s ，6 8 0a n n e a l i n g4 5 s ，7 2 c e x t e n s i o n1m i n ，3 5 c y c l e s ；7 2 。cf i n a le x t e n s i o n5r a i n ；4 0 t e r m i n m i n g t h r o u g hi d e n t i f i c a t i o n o ff 1p o l u l a t i o na n dv a r i e t i e s ，s c a rm a r k e rw h i c hl i n k e dt op o l l e ns t e r i l i t yh a sb e e nt r a n s f o r m e d s u c c e s s f u l l y i tc a l lb e u s e da sa ni d e n t i f i c a t i o nm a r k e ro f p o l l e ns t e r i l i t yi np e a c h k e yw o r d ：p e a c h ；r a p d ；a f l p ；s c a r ；p o l l e nf e r t i l i t y 英文缩略表 一延边大学硕士学位论文 前言 ， 一本研究的目的、意义 桃，属于蔷薇科( r a s a c e a e ) ，李属( p r u 门u sl ) 植物，栽培历史悠久，分布 十分广泛，是我国重要果树种类之一。桃是自花授粉果树，遗传基础比较简单 1 】， 染色体数目较少( 2 n = 1 6 ) ，基因组也小，许多重要的经济性状属于单基因控制的 质量性状，适合进行遗传特性的研究【2 】。我国是桃资源的富国，但也是良种的贫 国，在基础研究方面与国外相比还存在很大差距，这在很大程度上制约了资源的 开发和利用，也制约了品种选育工作的速度，给果树育种工作带来很大困难。因 此，应用分子标记技术进行性状遗传和早期选择研究就显得更为迫切。 花粉育性是由一对单基因p s p s 控制，可育( p s ) 对不育( p s ) 为完全显性， 花粉不育的品种和植株均属于隐性同质结合的基因型1 3 “，即基因型p s p s 和p s p s 的品种花粉可育，基因型p s p s 的品种花粉不育。桃的花粉育性是衡量果实丰产、 稳产中的一个重要指标。生产中一部分桃品种如晚黄金、重阳红、深州蜜桃等， 由于本身没有健全花粉，栽培中必须配置授粉品种，如果遇到花期阴雨、低温等 不适于传粉昆虫活动时常导致减产 ”。利用高信息量的分子标记技术，筛选与桃 的花粉育性基因紧密连锁的分子标记，不仅可以及早判断、淘汰不符合经济性状 要求的植株，也缩短了桃的育种年限，为桃的果实产量提供保证。目前，在苹果、 桃、葡萄、柑桔、草莓等果树上，已经找到了很多与主要性状基因连锁的分子标 记，但国内尚未有与桃花粉育性基因紧密连锁分子标记的报道。本试验利用p a p d 、 a f l p 技术，结合b s a 法，筛选与桃的花粉育性基因连锁的分子标记，再进一步转 化为一种更为稳定的分子标记s c a r 标记。该标记具有迅速、简便、低成本的 特点，就目前来说，是一种比较理想的分子标记，可直接应用于桃的辅助选择育 种中。本试验通过从分子水平上进行研究，为今后更好地利用分子标记技术，进 行桃的遗传学研究和育种提供新的理论依据。 二主要蜊a 分子标记概述 遗传标记( 主要包括形态标记、细胞学标记、生化标记和d n a 分子标记) 的应 用，极大地促进了生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的进程 【6 】。但形态标记、细胞学标记、生化标记这三种标记数量非常有限，且受发育时 一延边大学硕士学位论文 期、生长环境等因素的影响，严重制约了遗传标记的应用和发展。分子标记是以 生物的大分子，尤其是生物体的遗传物质一一核酸的多态性为基础的遗传标记， 其数量丰富、遗传稳定、不受基因表达与否的限制以及操作简便等独特的优越性， 被广泛应用于植物学研究的各个领域。目前，应用果树种质资源和育种研究常用 的分子标记技术有r f l p 、r a p d 、a f l p 、s s r 、s c a r 等【7 】。 1 r f l p 标记 r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) ，即限制性片段长度 多态性。首先由美 b o t s t e i nd 等嘲人提出作为标记构建遗传连锁图谱的，基本 原理是用限制性内切酶把d n a 分子切割成大量的长短不等的小片段，这些小片段 的数目及长度反映了限制性内切酶酶切位点在d n a 分子上的分布。不同来源的d n a 具有不同的限制酶酶切位点的分布，每一种d n a 限制酶组合所产生的片段是特异 的，从而产生多态性。r f l p 标记是一种共显性标记，可以区别纯合体和杂合体， 它以d n a 分子与杂交探针间的同源性为基础，实验结果具有可靠性强、重复性好 的优点。但r f l p 技术也存在操作复杂、成本较高、需要使用放射性同位素进行标 记等不足。 2 r p d 标记 1 9 9 0 年，美国杜邦公司的w i l l i a m s 【9 1 和加利福尼亚生物研究所的w e l s h ”】研 究小组几乎同时发现了一种新的分子标记，随机扩增多态性d n a ( r a n d o m a m p l i f i e d p 0 1 y m o r p h i cd n a ) ，简称r a p d 。r a p d 技术是在聚合酶链式反应，简 称p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 【1 1 】基础上发展起来的，它以基因组d n a 为 模板，以人工合成的随机寡核苷酸序列为引物( 通常为1 0 个碱基) ，通过p c r 扩 增，合成的d n a 片段经琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色后，在紫外光下可 以看到新合成的不同大小的d n a 片段形成的带，带的多态性反映了模板d n a 相 应区域的多态性。r a p d 标记的优点是多态性较高，信息量大；模板用量少，对 d n a 的质量要求不高；操作简便快速，效率高，可以实现自动化；成本相对较 低，不需使用放射性同位素，安全性高。但r a p d 标记也有自身的缺点，其主要的 缺点就是稳定性、重复性较差；无法区分纯合显性和杂合显性。 延边大学硕士学位论文 3 f l p 标记 a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) ，即扩增片段长度多态性。是 1 9 9 3 年由荷兰k e y g e n e 公司科学家z a b e a u 和v o s 等1 2 1 人发明的一种新的d n a 分子标记技术。其基本原理是，将基因组d n a 用限制性内切酶消化后，再用已 知序列的双链人工接头( a r t i f i c i a la d a p t e r ) 连接上，然后进行扩增。a f l p 的扩 增分为两步：第一步是预扩增，选择性碱基的数目可以是1 或o 个核苷酸引物进 行扩增，预扩增的产物用作第二步扩增( 也称选择性扩增) 的模板，所用引物选 择性碱基为2 或3 个。最后，通过p a g e 胶电泳分离检测，根据扩增片段长度 的不同来检测多态性。a f l p 为显性标记或共显性标记，具有多态性强，检测信 息量大，重复性、稳定性高等优点，但实验程序比较复杂，对d n a 的纯度和内切 酶的质量要求严格，成本高。 4 s s r 标记 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 即简单序列重复，或称为微卫星标记( m i c r o s a t e l l i t e s ) 【” 。它是以2 5 个核苷酸为单位的多次串联重复的d n a 序列，如( g a ) n ，( a c ) n ，( g 从) n ，( n 为重复次数) ，重复的次数一般是1 0 5 0 。同一类微卫 星d n a 可分布在基因组的不同部位，由于s s r 两侧一般是相对保守的单拷贝序列， 因此，可根据两侧序列设计一对特异引物来进行p c r 扩增。s s r 标记的多态性主要 依赖于基本单元重复次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的。所以， s s r 标记具有可靠性好、共显性遗传、在基因组中数量丰富、多态性高以及适合 自动化分析等优点。但是，s s r 标记引物的开发较为困难，需要d n a 的序列信息， 为此，该技术的应用在一定程度上受到限制。 5 s c 根标记 s c a r ( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ) 1 1 4 1 ，即序列特异扩增区。 其基本原理为：获得多态性d n a 片段后，将其回收并连接在适合的载体上，再转化 到适当的受体菌中，摇菌、挑菌、培养，然后提取质粒d n a ，p c r 鉴定，最后测序。 根据所测的d n a 序列，设计个1 8 2 4 b p 左右的寡核苷酸引物，以此特异性引物对 基因组d n a 进行p c r 扩增，便可以扩增出与克隆片段一样大小的特异性带。s c a r 标记在不同个体间表现为存在缺失，如果以r a p d 标记转化为s c a r 标记，则此标 延边大学硕士学位论文 记为显性标记，如果是从r f l p 技术转化来的标记，则此标记为共显性标记。s c a r 标记克服了r a p d 技术的不稳定性，相对于r f l p ，a f l p 来说，它不采用杂交探针， 同位索标记，方法简便，成本较低。 三。分子标记技术在果树遗传育种研究中的应用 迄今为止，d n a 分子标记技术已在品种鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构 建、基因定位、分子辅助选择育种等方面得到了广泛的应用。 1 品种鉴定与分类 果树大多是多年生木本植物，且主要采用无性繁殖，长期以来，不同地域相 互引种栽培，出现了许多同物异名和同名异物的现象。随着分子标记技术的日益 发展，为品种鉴定和分类开辟了广阔的前景。宋婉等【15 】对中国枣现有生产品种及 野酸枣共6 8 个品种进行了品种鉴定。赵锦等【i6 1 也对2 5 个枣品种、品系及其2 个近 缘种酸枣和毛叶枣进行了r a p d 分析，探讨了供试枣品种和品系的亲缘关系。程中 平【1 7 】利用筛选出来的2 2 个引物将1 9 个油桃品种分为3 类，并建立了油桃的品种分 子识别表。曹后男等1 8 1 利用r a p d 技术，选用2 3 个引物共扩增出1 2 2 条多态性d n a 带，通过聚类分析把3 4 个桃品种划分为三个品种群。d i r l e w a n g e r 等【l9 j 利用a f l p 和r a p d 技术对桃的4 5 个品种的变异进行了研究。易干军等口o f 蓝n a f l p 技术，对 3 5 个香蕉品种( 系) 进行了鉴别和分类，并且证实了3 个引自不同国家的异名品 种实际上是同一香蕉品种。熊光明刚利用a f l p 技术对柑橘属及其近缘属的1 6 个 种，8 7 个生物型进行了分类鉴定，最后划分为4 大类群。祝军等 2 2 1 应用a f l p 技术， 从6 8 个引物中筛选出了4 对多态性高、分辨能力强的引物，区分了供试的2 5 个苹 果品种。h u r t a d o 等2 3 】也应用a f l p 技术对1 6 个杏品种进行了遗传多样性的分析， 通过聚类分析，结果1 6 个杏品种被分为两大类：一类为北美品种群；另一类为欧 洲品种群。此外，在苹果 2 4 - 2 6 】、柑桔口7 之9 1 、葡萄 3 0 - 3 1 1 、梨f 3 2 - 34 1 、桃3 5 。、杏”1 、 樱桃洲、龙眼 4 2 1 、芒梨4 3 卅、香蕉 4 5 - 4 6 】、枣 4 7 4 ”、李【4 9 。5 0 培也进行了品种鉴定 和分类方面的应用。 2 遗传连锁图谱的构建 对于些多年生木本果树而言，由于世代周期长、单位面积种植的株数少， 不易获得个体间表现差异的、有一定数目的高世代群体，加之有些果树存在严重 一延边大学硕士学位论文一 自交退化现象，因而很难获得一定数量的自交纯系【5 ”。经典的遗传习谱是根据形 态、生理和生化标记构建的，由于这些遗传标记数量在作图群体的两采本上极为 有限，且图谱分辨率饱和度低，所以发展缓慢。而应用d n a 分子标记来构建量传 连锁图谱比基于性状分离的传统作图方式速度快、效率高。 h e m m a t m 等【5 2 1 在传统的果树杂交育种理论基础上提出了“双假测交模型” ( d o u b l ep s e u d o t e s t c r o s sf o r m a t ) ，即利用多年生果树高度杂合f 1 代即发生 分离的特点，克服了构建连锁图谱通常需要f 2 代、回交群体等。“双假测交模型” 的提出为f l 代即可用于多年生果树遗传作图确立了理论基础，简化和推动了果树 遗传图谱的构建工作。利用d n a 标记构建遗传连锁图，与传统遗传连锁图的构建 原理相似。其基本步骤包括：( 1 ) 选择适合作图的d n a 标记；( 2 ) 根据遗传材 料之间的d n a 多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合；( 3 ) 建立具有大量 d n a 标记处于分离状态的分离群体；( 4 ) 测定作图群体中不同个体或株系的标记 基因型；( 5 ) 对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。r a j a p a k s e 等【5 3 】利用来自杂交组合n e wj u r s e y p i l l a r x k v7 7 1 1 9 的4 株f l 代个体自交所产生 的7 1 株f 2 代为作图群体，构建了桃的遗传连锁图，包括形态标记、r f l p 标记和 r a p d 标记，4 7 个标记分布于8 个连锁群上，覆盖基因组长度3 3 2 c m ，标记间的平 均距离为8 c m 。吴俊p 4 1 以大久保、兴津油桃杂交获得的f 2 代1 0 9 株群体为试 材，采用a f l p 、r a p d 、s s r 、s c a r 标记构建了桃遗传连锁图谱。祝军等口” 对i , 4 、m m 系矮化砧木用a f l p 技术依据引物p 4 4 m 6 4 构建了指纹图谱。房经贵等 5 6 1 采用a f l p 技术，利用1 6 对引物构建了两个芒果育种亲本的指纹图谱，获得了 两个品种分子水平上的多态性信息。罗素兰【5 7 1 也利用r a p d 标记技术，构建了种 间杂交组合( 毛葡萄8 3 4 9 6 粉红玫瑰) 的一个葡萄分子连锁图谱。h u r t a d o 等 5 8 1 应用a f l p 、r a p d 、r f l p 和s s r 标记对杂交组合g o l d r i c h v a l e n e i a n o d e 的8 l 株 f l 代个体进行分析，构建了双亲的遗传连锁图谱，遗传连锁距离分别为5 1 l c m 和 4 6 7 2 c m 。此外，在柑桔 ”、梨6 0 1 、桃【6 1 侧、草莓6 5 1 等果树上，应用分子标记 技术也构建了遗传连锁图谱。 3 质量性状基因定位 质量性状基因常由单个或少数基因控制。其作图先应找到与目的基因紧密连 锁的分子标记，然后利用相关软件进行作图。分子标记与目标性状基因连锁的紧 延边大学硕士学位论文 密程度越高，结果就越准确，其利用价值也越大。寻找与目的基因紧密连锁的分 子标记的方法，目前主要有3 种：( 一) 连锁图法( l i n k a g em a p ) ；( 二) 近 等位基因系法( n e a ri s o g e n i cl i n e ，简称n i l ) ；( 三) 集群分离分析法( b u l k e d s e g r e g a n ta n a l y s i s ，简称b s a ) 。由于大多数果树尚未构建遗传连锁图，或图 谱饱和度低，以及果树上近等位基因的获得相对困难，使得b s a 法成为筛选果树 重要农艺性状基因标记的主要方法【6 6 】。 b s a 法是将目标基因性状分离的杂交群体分成2 组，一组后代表现目标基因的 性状( 如抗病) ，另一组不表现目标基因的性状( 如感病) ，从每组后代中各随机选 择5 - 1 0 株后代，分别等量混合d n a ，构成2 个对l l d n a 库，再采用d n a 指纹技术寻找 对比d n a 库间的多态性差异，这种差异极有可能是与目标基因连锁的分子标记， 最后用所有的分离后代单株，验证该多态性片段是否真正与目标基因连锁，并计 算其遗传连锁距离。采用b s a 法筛选目标基因的分子标记时，结合r a p d 、a f l p 技 术，操作简单易行，使用也最多【6 ”。苹果的柱型性状是一种非常适合矮化密植的 性状，是受显性单基因( c o ) 控制的质量性状。王彩虹等 6 s j 习b s a 法昶 a f l p 技术 相结合，筛选n c o 基因一个a f l p 标记，该标记与c o 基因位点的重组率为( 3 3 2 3 ) ，且此标记在苹果基因组中为单拷贝。田义轲等【6 9 1 以短枝富士( s p urf u j i ) 舞姿( t e l a m o n ) 的1 0 5 株f l 群体为试材，利用r a p d 技术和b s a 法，进行了苹果柱 型基因( c o ) 分子标记的研究。通过对3 0 0 条随机引物的筛选，获得一个与c o 基因 紧密连锁的r a p d 标记s 1 1 4 2 - 6 8 2 ，连锁距离为2 8 6 c m 。对该标记片段进行序列测定， 并转化为s c a r 标记。结果表明该s c a r 标记特征带与柱型性状的共分离结果与原 r a p d 标记表现一致。罗素兰等 70 】应用r a p d 技术结合b s a 法，筛选了2 8 0 个引物，获 得了与葡萄抗霜霉病主效基因( r p v 一1 ) 紧密连锁的标记0 p 0 0 6 1 5 0 0 ，遗传距离为 1 7 c m 。毕晓颖等 7 l 】也相同的方法，获得了苹果属显性矮生主基因d w 连锁的 r a p d 标记。x u 等 7 2 j 应用a f l p 技术筛选出了1 5 个与苹果抗黑星病基因( v f ) 紧 密连锁的分子标记，1 5 个标记都位于v f 区域0 6 c m 以内。 桃的许多经济性状为单基因控制的质量性状，表现为简单的显隐关系，因而 极适用于获得目标基因的标记。x i a o 等【7 3 】利用b s a 法和a f l p 技术筛选与猕猴桃 性别连锁的分子标记，结果发现有4 个条带明显与性别连锁，其中2 条带只在雄性 个体中出现，而另外2 条带主要或只在雌性个体中出现。张潞生等7 4 1 也用a f l p 延边大学硕士学位论文 结合b s a 方法获得了与猕猴桃雄性性别基因连锁的标记，为猕猴桃性别控制基因 的进一步研究打下了基础。目前，在苹果u 5 - 8 1 】、8 外8 2 - s 4 j 上研究的较多。 4 数量性状基因定位 大多数果树的重要农艺性状表现为数量遗传特点，如产量、果实品质、成熟 期、树冠大小、抗逆性等皆为数量性状。控制数量性状的基因称作数量性状基因 座( q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i ，简称q t l ) 。长期以来人们无法用孟德尔遗传规律来解 释那些介于亲本之间的表型性状，通过大量的实验，人们才发现这些性状受许多 基因的控制，不同的数量性状，其q t l 在基因组中的数量、位置和作用各不相同。 近年来，由于分子标记的发展，我们可以将复杂的数量性状进行分解，像研 究质量性状一样对控制数量性状的多个基因分别进行研究，使得q t l 作图得到迅 速发展。目前q t l 定位的方法主要包括：1 区间作图法，2 多元回归法，3 满 细作图法，4 标记回归法，5 完整连锁图作图法。借助于高密度的遗传连锁图 谱，就能定位q t l ，并且由于数量性状的广泛存在，受到植物学家、果树育种学 家的普遍重视。d i r l e w a n g e r 等【8 5 】用一个甜桃( f e r j a l o n j a l o u s i n ( r ) ) 和一个酸桃 ( f a n t a s r a ) 杂交所得的f 2 群体分析了控制桃果实酸甜度的q t l ，用同工酶、r f l p 、 r a p d 和a f l p 构建了包括1 2 个连锁群的遗传图谱，其中控制果实p h 值、果酸、 可溶性糖含量等都有至少一个q t l 被检测，并发现它们大多都在第二连锁群上。 v h - u e l 等 86 对控制抗桃卷叶病的q t l 也进行了作图，他们用两个杂种桃种内杂交 所得的7 7 株f l 代群体，采用r f l p 和r a p d 作了一张含9 8 个基因座，包括9 个连锁 群的分子图谱，覆盖基因组长度4 7 1 c m ，发现抗桃卷叶病的q t l 在6 个连锁群上 都有分布，其中有两个稳定表型效应的q t l 被分别定位在第3 和第2 个连锁群上。 c o n n e r 等8 7 1 也应用分子标记对苹果树体发育的相关性状进行了研究。 5 分子标记辅助选择育种 分子标记辅助选择( m a r k e r a s s i s t e ds e l e c t i o n ，简称m a s ) 就是利用与目的 基因紧密连锁的d n a 标记，对目标性状进行跟踪选择的育种技术。标记辅助选择 有效的前提是标记与目标性状紧密连锁。在植物育种中对目标性状进行选择是新 品种培育的中心环节，传统的育种方法多依赖于植株的表型，要求有丰富的经验 和长达几年甚至几十年的时间。而分子标记辅助选择可以直接选择在目的基因附 近发生重组的个体，从而避免或显著减少连锁累赘，提高选择的效率。标记与目 延边大学硕士学位论文 的基因的遗传距离是影响辅助选择效率的一个重要因素，一般与目的基因的遗传 距离应小于5 c m 。d i r l e w a n g e r 等【8 8 l 于1 9 9 4 年最先用r a p d 标记位点构建了含8 个连锁群的桃遗传连锁图谱，并找到了与油桃型、垂枝型、抗蚜型等经济性状连 锁的r a p d 标记。w a r b u r t o n 等【8 9 】利用b s a 法从桃与油桃杂交后代中筛选出与果 肉硬质、离核、黄肉连锁的r a p d 标记。徐炎等l 州以感病x 抗病的葡萄种问杂交 组合白玉霓塘尾的f l 代个体为试材，根据b s a 法和r a p d 技术，筛选到了一个与 中国野生葡萄抗白腐病基因连锁的r a p d 标记，并将该标记转化为s c a r 标记，可用 作抗白腐病基因分子辅助选择的依据。j h j u n 等【9 l 】筛选出了与桃果肉粘离核紧 密连锁的4 个r a p d 标记。王晓梅等1 9 2 利用a f l p 技术，应用4 8 个引物组合， 检测了雌雄银杏基因组d n a 的多态性，筛选出与银杏性别有关的分子标记， 获得了两个为银杏雌性基因组所特有的标记。l u 等 9 3 】在桃砧木研究中获得的与 控制根癌线虫的两个基因( m i ，m i j ) 紧密连锁的a f l p 标记，连锁距离分别为 6 0 c m 、3 4c m ，这些标记可用于桃砧木的辅助选择上。s o s i n k i 等【9 4 】在构建桃 的连锁图时获得与2 个控制抗根癌线虫位点紧密连锁的a f l p 标记，并转为s t s ， 可直接用于分子辅助选择育种中。姜立杰等【9 5 】以桃品种京玉和美味的正反交6 9 株f l 群体为试材，利用r a p d 技术扩增出了与桃果肉白肉黄肉性状连锁的8 9 9 b p 的多态性片段，并转化为s c a r 标记，与白岗，黄肉性状的连锁距离为2 1 c m ，为 桃果实白肉，黄肉性状育种的分子标记辅助选择奠定了基础。 四分子标记技术在果树育种中的应用前景 对于多年生果树来说，由于其高度杂合、自交不亲和、育种周期长等特点， 传统的育种方法盲目性很大。在资源利用方面，果树一般长期无性繁殖，栽培品 种形态相似，区分困难，利用分子标记技术加以鉴别，准确可靠，同时也可作为 新品种登记及资源保护的有力依据。目前，在果树农艺性状基因分子标记的筛选 和应用研究方面已取得了长足的发展，将这些研究的成果充分应用到育种实践 中，可大大加快果树育种进程，缩短育种年限，缓解育种进程馒以及占地多、投 资大的不足。随着分子生物学技术的发展，新的分子标记还会不断出现，2 l 世纪 这个生物科学时代，分子标记技术将在果树种质资源研究中发挥越来越重要的作 用，可以预见分子标记技术在果树上的应用研究必将迎来一个迅速发展的时代。 一延边大学硕士学位论文 第1 章材料与方法 1 。1 材料 1 1 1 试验材料 桃品种：重阳红( 花粉不育k 大久保( 花粉可育) 。 杂种群体：1 9 9 8 年，以重阳红为母本、大久保为父本进行杂交试验，获得 了杂种f l 代5 2 株，从中选取3 2 株，其中花粉可育1 6 株，花粉不育1 6 株，所 有试验材料采自河北昌黎。 1 1 2 主要试剂与仪器 试剂：c t a b 、e d t a ( 2 n a ) 、t r i s 碱、p v p 、b 一巯基乙醇、t a qd n a 聚合 酶( 3 u p i ) 、d n t p s ( 脱氧核糖核苷三磷酸，d a t p 、d t t p 、d c t p 、d g t p ) 、琼 脂糖( 西班牙产) 、引物、接头、e c o ri 限制性内切酶，以上试剂购自华美公司 北京分公司：m s e i 限制性内切酶( n e b 公司) ；1 4 d n a 连接酶、尿素、t e m e d ( p r o m e g a 公司) ：d n a 回收试剂盒( t a k a r a ) ，银染试剂盒( b i o n e e r 公司) 。 仪器：h e r m l e 2 3 8 3 型台式低温离心机，h i t a c h iu 一3 0 1 0 紫外可见分光光度 计，d b 8 0 2 4 0 3 3 型p c r 仪，g e n ea m p p c rs y s t e m9 7 0 0 型p c r 仪，g d s 8 0 0 0 凝胶成像系统，n u 6 6 2 1 w 3 4 型超低温冰箱、d 8 9 9 2 3 3 型超纯水器( n a n op u r e i n 击m i t yu v ，u f ) ，s e 3 型取液器( 2 1 0 0 0 u 1 ) 及吸头，d y y - i i i 型电泳仪及各种 规格电泳槽，d y y 一1 2 型电泳仪、d y c z 。2 0 b 型电泳槽、w d - 9 4 0 5 b 型水平摇 床，恒温摇床h z s h ，超净工作台s w c j l f 型。 1 2 方法 1 2 1 基因组总d m 制备 采用c t a b 澍9 6 1 提取基因组总d n a ，并略做改进。 1 ) 取2 9 左右的刚研磨好的新鲜叶片置于5 0 m l 离心管中，加1 5 1 7 5 m l 经6 5 预热的2 c t a b 提取缓冲液，2 0 0 9 lb 一巯基乙醇。 2 ) 充分混匀后，在水浴锅中6 5 。c 温浴1 小时，每2 0 分钟轻轻颠倒一次离心管。 3 ) 加等体积氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 混合液，颠倒混匀混合物，室温放置3 0 分 钟， 1 8 下7 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟。 延边大学硕士学位论文 4 ) 取上清液，转入到一个新的离心管，加入1 0 m l 左右的2 c t a b 提取缓冲液， 水浴3 0 分钟，每1 0 分钟颠倒混匀一次。 5 ) 取上清液，加等体积氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 混合液，1 8 。c 下8 0 0 0 r p m 离心 l o 分钟。 6 ) 取上清液，加入等体积预冷的异丙醇，沉淀d n a 。 7 ) 捞出d n a ，用7 0 酒精冲洗几次，室温干燥，加适量的t e 缓冲液，在6 5 水浴锅中溶解d n a 。 8 ) 加等体积苯酚，氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次。每次1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分 钟。 9 ) 取上清液，加1 1 0 体积醋酸钠( p h 5 2 ) ，2 倍体积的无水乙醇，置于一2 0 。c 3 0 分钟沉淀d n a ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟。 1 0 ) 用7 0 酒精冲洗几次，室温干燥，加入适量t e 缓冲液，再加适量的r n a s e ( 1 0 m g m 1 ) ，3 7 c 恒温箱中过夜，一2 0 冰箱中保存各用。 1 2 2 基因组d n a 的检测与定量 ( 1 ) 电泳检测： 从f l 代群体随机选取l o 个d n a 样品，在o 7 琼脂糖凝胶，o 5 t b e 缓 冲液，3 - 5 v c m 下电泳，凝胶中加入e b ( 0 5 p g f r o ) ，并用九d n a i i n di l lm a r k e r 作对照。电泳结果用g d s 一8 0 0 0 凝胶成像系统照相，检测d n a 样品大小及完整 性。 ( 2 ) 紫外分光光度计测定o d 值： 用h i t a c h iu 一3 0 1 0 紫外可见分光光度计测定d n a 样品的o d 2 3 0 、o d 2 6 0 和 o d 2 8 0 ，并计算o d 2 6 0 o d 2 3 0 、o d 2 6 0 o d 2 8 0 及d n a 原液浓度c 。 计算公式c ( g g i i l l ) = o d 2 6 0 x 5 0 稀释倍数。o d 2 6 0 o d 2 8 0 值在1 8 2 0 、 o d 2 6 0 o d 2 3 0 值在2 0 以上表明d n a 纯度高，根据原液浓度将d n a 样品用t e 缓冲液稀释成5 0 n g g l 备用。 1 2 3 花粉育性基因池的构建 根据b s a 法的原理，从1 6 株f 1 代的可育、不育个体d n a 样品中，随机选 取5 株，等量混合，构成花粉育性基因池，编号为a 、b 。其中，a ：花粉可育， b ：花粉不育。 一延边大学硕士学位论文 图1 花粉可育( 左) 和不育( 右) 的桃花 f i g1f l o w e r so f p o l l e nf e r t i l i t y0 e 哟a n ds t e r i l i t y ( r i g h t ) o f p e a c h 1 2 4r a p d 分析 r a p d 分析过程采用曹后男刚的方法，并略有不同。利用d b 8 0 2 4 0 3 3 型p c r 仪进行扩增，分析体系如下： 1 2 4 1r a p d 技术体系 ( 1 ) p c r 反应体系：。 t e m p l a t ed n a ( 1 0 n g u 1 ) 2 0 9 l m g c l 2 ( 2 5 m m ) 1 5 9 l d n t p s ( 2 5 m m ) 1 5 9 t p r i m e r ( 1 0 p m 0 1 )2 0 8 1 1 0xp c rb u f f e r 2 5 m 1 d d h 2 01 5 1 7 1 a l t a q d n a p o l y m e r a s e ( 3 u 9 1 ) o 3 3 9 1 tt a lv o l u m e 2 5 9 l ( 2 ) p c r 扩增程序： s t e p l s t e p 2 s t e p 3 s t e m s t e p 5 s t e p 6 9 4 o c 9 4 。c 3 6 。c 7 2 。c 7 2 0c 4 。c 5 m ir l 5 m i n 5 0c y c l e s 厂_ i i l j n n n_：1 m m l 1 2 延边大学硕士学位论文 ( 3 ) 产物检测：在含o 5 r t g m le b 的1 4 琼脂糖凝胶上电泳，制胶和电