（植物学专业论文）农杆菌介导法将bt毒蛋白基因导入水稻的研究.pdf

农杆菌介导法将b t 毒蛋白基因 导入水稻的研究 摘要 本文以当前培育超级杂交稻正在广泛使用的两个优势亲本培矮6 4 s 和9 3 1 1 作为主要研究对象，对影响其成熟胚来源的愈伤组织诱导、分化和植株再生条件 进行了优化；对影响农杆菌转化上述籼稻的条件进行了探索和优化：建立了高频 的离体再生系统和比较高效的遗传转化方法。同时对转基因植株进行了分子检测 和抗虫性分析。 1 培矮6 4 s 和9 3 1 1 离体再生系统的优化 研究了影响两种籼稻愈伤组织诱导、继代和分化成苗的相关因素，结果表明： 种子本身的生理状态是影响愈伤组织诱导频率的主要因素之一；将n 6 培养基的 大量元素与m s 微量元素组合，同时提高v b i 和肌醇的含量可显著提高愈伤组 织的诱导和培养效果；在合适的2 , 4 d 浓度下，添加其他外源激素不能显著提高 愈伤组织的诱导率，但可改善愈伤组织的胚性生长状态；交替使用不同的培养基 成分和激素浓度配比可使长期继代培养物保持胚性状态，延长继代培养的时间： 预分化和干燥处理使植株再生的频率和质量大大提高。 采用我们优化后的培养条件与处理方式，培矮6 4 s 和9 3 1 1 愈伤组织的诱导 频率分别可达到6 2 4 5 和8 5 3 0 ；继代培养时间达三个月左右仍能保持较好的 胚性生长状态；对于继代两次胚性生长状态良好的愈伤组织分化频率分别可达到 8 5 5 和8 7 7 。 2 采用农杆菌介导法将b t 毒蛋白基因导入水稻 同样以上述两种籼稻为主要研究材料，比较了分别以预培养的幼胚和幼穗、 幼胚、成熟胚来源的愈伤组织作为转化受体的愈伤组织转化频率，结果表明预培 养4 - 6 天的幼胚最适宜作为农杆菌介导转化的受体；其次是来源于幼胚和成熟胚 的生长状态良好的胚性愈伤组织。 以y e b 培养基作为共培养培养基i 对于农杆菌e h a l 0 5 ( p u b l m ) 来说，菌 液浓度为o d 值= o 8 时，愈伤组织的转化率最高。 在农杆菌侵染愈伤组织过程中，通过负压处理可明显提高水稻愈伤组织的转 化频率。对于6 0 m l 的注射管而言，抽拉距离确定在6 c m 左右，抽拉次数4 0 次 对提高水稻愈伤组织的转化频率最为有效。 采用c a 2 + 和表面活性剂处理以提高转化频率是本实验的重大创新。在愈伤 组织浸染后，分别以浓度为2 0 n u n o l l 和3 0 m m o l l 的c a c l 2 的溶液处理培矮6 4 s 和9 3 1 1 胚性愈伤组织，同时在处理液中添加0 1 t w e e n 2 0 以降低细胞的表面张 力，对促进愈伤组织的转化和转化植株的再生效果最好。经上述处理可使9 3 1 1 愈伤组织的转化率和抗性植株再生率分别达到5 8 3 3 和3 3 3 3 。 选取部分植株进行p c r 分析、d n a 点杂交、p c r - s o u t h e m 杂交。以上分子 检测结果表明，绝大部分经抗性筛选得到的转化植株的基因组中已整合有外源基 因。 关键词：籼稻，愈伤组织，农杆菌，转化，抗虫 l i s t u d i e so n i n t r o d u c i n g b t - t o x i ng e n ei n t o r i c ev i a a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s a b s t r a c t t w oa s p e c t so fr e s e a r c hw e r ep e r f o r m e do nt w ov a r i e t i e so fi n d i c ar i c e ( o r y z a s a t i v a l ) p e i a i 6 4 s ( p a 6 4 s ) a n d 9 311w h i c hw e r e e m p l o y e de x t e n s i v e l y a s o u t s t a n d i n gs e l e c t a b l ep a r e n t so f c u r r e n ts u p e rh y b r i di nt h i sa r t i c l e t h em a i nr e s u l t s w e r e 龋f o l l o w s ： o p t i m i z a t i o n o f r e g e n e r a t i o ns y s t e m s u i t a b l ef o r g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o no f p r e d o m i n a n t i n d i c ar i c e s e v e r a lf a c t o r s a f f e c t i n g i n d i c ar i c ep e i a i 6 4 sa n d9 3 1 1 c a l l u si n d u c t i o n , s u b c u l t u r e ，b u dd i f f e r e n t i a t i o na n dp l a n tr e g e n e r a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d w i t h m a t u r ee m b r y o sa se x p l a n t s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a th i g hr a t i oo f 【n 0 3 + - u 】 n h 4 + - n 】，n b n - l e l o u si n o r g a n i cm i c r o - e l e m e n t sw i t hl a r g e ra m o u n to fv i t a m i n e b l a n di n o s i t o lw e r et h e o p t i m a l m e d i u me l e m e n t s w i t ht h e o p t i m a l2 , 4 - d c o n c e n t r a t i o n ，s u p p l e m e n t i n gt h ei n d u c t i o na n ds u b c u l t u r em e d i u mw i t hn a a ， a b aa n ds o m ec y t o k i n i nc a n n o tr e m a r k a b l yi m p r o v ec a l l u si n d u c t i o nf r e q u e n c y ac e r t a i nc o n c e n t r a t i o no ft h e s ep l a n tg r o w t h 婵g i l l a t o r sm a y , h o w e v e r , m a k ef o r i m p r o v e da n d i n c r e a s e de m b r y o g c n i cc a l l u s a p p l i c a t i o no fd i f f e r e n tm e d i u ma n d v a r i e dc o n c e n t r a t i o no fh o r m o n ea l t e r n a t i v e p l a y s a ni m p o r t a n tr o l eo nt h e m a i n t e n a n c eo f e m b r y o g e n i cs t a t eo fl o n g - t e r mc u l t u r e de a l l i p r e - d i f f e r e n t i a t i o n a n dp r o p e rp a r t i a ld e s i c c a t i o no fc a l l ib e f o r et r a n s f e r r e dt or e g e n e r a t i o nm e d i u m w a sf o u n dt o a p p a r e n t l yi m p r o v e t h e f r e q u e n c y a n d q u a l i t y o f p l a n t d i f f e r e n t i a t i o n w i t l lo u r o p t i m i z e d c u l t u r ec o n d i t i o na n dt r e a t m e n t s t y l e ，i n d u c t i o n f r e q u e n c yo f p e i a i 6 4 sa n d9 3 1l c a nb er e a c h e d6 2 4 5 a n d8 5 3 0 r e s p e c t i v e l y a n da f t e r3m o n t h so fs u b c u l t u r ec a l l ic a nr e m a i n h i g h - q u a l i t ye m b r y o g e n i cs t a t e ， w h e nh i g h - q u a l i t ye m b r y o g e n i cc a l l ia f t e rt w ot i m e so fs u b c u l t u r ew e r eu s e da s h i a c c e p t o r , c a l l u s d i f f e r e n t i a t i o n f r e q u e n c y c a na r r i v e a t8 5 5 a n d8 7 - 7 r e s p e c t i v e l y s t u d i e so nt r a n s f o r m a t i o no fi n d i c ar i c ew i t hb t - t o x i ng e n e m e d i a t e db y a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s p r e c u l t u r e di m m a t u r e e m b r y o a n dc a l l u sd e r i v e df r o m y o u n gp a n i c l e ， i m m a t u r e e m b r y o a n dm a t u r e e m b r y o w e r eu s e da s a e c e p t o r f o r g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o nm e d i a t e d b ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s , t h et r a n s f o r m a t i o n r a t eo f t h ea b o v e a c c e p t o r w a s i n v e s t i g a t e dr e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t i m m a t u r e e m b r y o a f t e rp r e c u l t u r e df o r 耷石dw a st h eb e s t i nr e s p e c tt ot h ec o n c e n t r a f i o n o f a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sw h e n c a l l iw e r e c o t r a n s f o r m a t e di nm e d i u my e b ，t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n se r a1 0 5 ，o d v a l u eo f 0 8w 船t h eb e s t n e g a t i v ep r e s s u r ed i s p o s i t i o ni nt h ep r o c e s so fa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s i n f e c t i n gc a l l u s 、v a sf o u n dt o b ea b l et o i m p r o v et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yo f i n d i c at e s t e dd e e a p p a r e n t l y w i t ht h e6 0 m li n j e e t o r , d r a w i n gd i s t a n c eb e i n g6 c m a n d d r a w i n g t i m e s b e i n g 4 0c a n p e r f o r m 也eg r e a t e s te f f e c t c a 2 + a n dm e m b r a n es u r f a c ea c t i v a t o rb e 啦u s e dt op r o m o t et r a n s f o r m a t i o n m a yb ei n n o v a t i o no f0 1 1 1 r e s e a r c h a f t e ri m m e r g e da n di n f e c t e di nc o c u l t u r e m e d i u my e b ，c a l l ib e i n gi m m e r g e di n2 0 m m o l la n d3 0 m m o l l c a c l 2w i t h a d d i t i v eo 1 t w e e n 2 0c a nm o s tr e m a r k a b l yi n c r e a s et r a n s f o r m a t i o np e r c e n t a g e o fc a l l id e r i v e df r o m p e i a i 6 4 sa n d9 311 r e s p e c t i v e l y t h et r a n s f o r m a t i o n r a t ea n d r e g e n e r a t i o nr a t e o fh e r b i c i d e - r e s i s t a n c ed e ep l a n t so f9 311 v a r i e t yc a nr e a c h 5 8 3 3 a n d3 3 3 3 r e s p e c t i v e l y p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) ，s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sp e r f o r m e dt o w a r d 1 0t r a n s g e n i cr i c e p l a n t sr e v e a l e dt h a tf o r e i g ng e n e sw e r ei n t e g r a t e di n t ot h e g e n o m e o f t h e s e p l a n t s k e yw o r d s ：i n d i c ar i c e ，c a l l u s ，a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s , t r a n s f o r m a t i o n ， i m e e tr e s i s t a n c e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明，并表示了谢意。 ，n 研究生签名：坯缸矽钢 u 时间：2 0 0 3 年5 月2 9 臼 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名： 时间：2 0 0 3 年5 月2 9 日 时间：2 0 0 3 年5 月2 9 日 缩略词 2 4 d 6 b a b p c a r b c e f d n t p s e d t a k a n k b l b m e t n a a p c r r i f s d s s s c t - d n a t e t j t f i s 中文名 2 , 4 二氯苯氧乙酸 6 - 苄基氨基嘌呤 碱基对 羧苄青霉素 头孢霉素 脱氧核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 卡那霉素 千碱基对 l b 细菌培养基 多效唑 萘乙酸 聚合酶链式反应 利福平 十二烷基磺酸钠 柠檬酸钠，氯化钠缓冲液 转移d n a t r i s e d t a 缓冲液 致瘤质粒 三羟甲基氨基甲烷 缩写说明 英文名 v 2 , 4 d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e b a s e p a i r s c a r b e r c i l l i n c e f o t a x i n e d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d k a n a m y c i n k i l o b a s ep a i r s l u r i a - b e r t a n ic u l t u r em e d i u m m u l f i - e 缗 c tt r i a z o l e n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n r i f a m p i c i n s o d i u md o d e c y ls u l f o t e s o d i u mc i t r a t e s o d i u mc h l o r i d eb u f f e r t r a n s f e r r e dd n a 删s 甩d 1 ab u f f e r t u m o r - i d u c i n gp l a s m i d t r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e 第一章文献综述 1 9 8 3 年，国际上有三个实验小组几乎同时应用根癌农杆菌的t i 质粒作为载 体系统，成功地将外源基因导入烟草和矮牵牛，获得了转基因植物，标志着植物 基因工程的诞生“1 。经过二十年的发展，植物基因工程原理与技术逐步走向成熟。 到目前为止，人类所获得的转基因植物已达两百多种阻1 ，改良的性状涉及抗虫、 抗病、抗除草剂、抗胁迫、提高品质或产量、创造雄性不育等数十种。在众多的 转化方法中，农杆菌介导法由于其独特的优点，成为目前应用最为广泛的一种。 1 根癌农杆菌介导植物遗传转化的机理 很早以前，人们就发现，根癌农杆菌侵染植物后能诱使植物根部产生瘤状物， 人们对这种现象一直疑惑不解。直到1 9 7 4 年，z a e n e n 等在根癌农杆菌体内分离 出了一种与肿瘤诱导有关的质粒。发现凡丢失了这种质粒后，农杆菌的致瘤能力 就会完全丧失，从而证明该质粒就是农杆菌的肿瘤诱导因子，因而这一质粒被称 为t i 质粒( t u m o r i n d u c i n gp l a s m i d ) 。现在，人们所采用的农杆菌介导法就是利 用改造后的t i 质粒作为转化载体，将外源基因导入到受体植物细胞中的。 1 1 根癌农杆菌及其t i 质粒的结构与功能 根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) ，又称根癌土壤杆菌，是土壤杆菌属 ( a g r o b a c t e r i u m ) 的一种格兰氏阴性细菌，细胞呈杆状，大小0 8 1 5 3 0m ， 以1 4 根周生鞭毛进行运动。 根癌农杆菌在土壤中含量极其丰富，好氧。其最适生长温度为2 5 3 0 ，最 适p h 值6 0 9 0 。根癌农杆菌的宿主十分广泛，绝大多数双子叶植物和裸子植物 都可受到它的侵染口1 。单子叶植物由于其创伤反应与双子叶植物不同，在单子叶 植物的伤口附近往往发生木质化或硬化，而且没有明显的细胞分裂发生，因而大 多数单子叶植物不是根癌农杆菌的天然宿主。在自然状态下，根癌农杆菌可以通 过病斑或伤口侵染敏感植物，导致冠瘿瘤的产生，但细菌本身并不进入寄主植物 细胞。 在根癌农杆菌诱发植物根部产生肿瘤的过程中，起关键作用的是其体内存在 的t i 质粒( t u m o r i n d u c i n gp l a s m i d ) 。t i 质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链 d n a 分子，大约2 0 0k b 。各种t i 质粒在结构上都可分为四个部分：毒性区 f v i r u l e n c er e g i o n s ) ：又称v i r 区。v i r 区大小为3 0 k b 4 0 k b ，分v i r a m 等至少十 多个操纵予h 3 ，不同类型的t i 质粒所含有的操纵子数目不完全相同。该区段的 基因能激活t d n a 的转移，使农杆菌表现出毒性。t d n a 区( t r a n s f e r r e d - d n a r e g i o n s ) ：该区在农杆菌侵染植物体时，被从t i 质粒上切割下来，转移到植物细 胞中去。由于该段d n a 上含有与肿瘤形成有关的基因，因此t d n a 的整合导 致植物肿瘤的发生。接合转移区( r e g i o n se n c o d i n gc o n j u g a t i o n s ) ：该区段上存在 细菌间进行接合转移有关的基因( i r a ) ，调控t i 质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿 碱能激活t r a 基因，诱导t i 质粒的转移，从而使肿瘤扩散。复制起始区( o r i g i o n o fr e p l i c a t i o nr e g i o n ) ：该区段的存在保证t i 质粒进行自我复制。可见，上述t i 质粒的四个部分中，与冠瘿瘤生成直接相关的是v i r 区和t d n a 区。 1 2 根癌农杆菌转化植物细胞的分子机理 农杆菌转化植物细胞的实质是t d n a 的转移与整合。这就要求农杆菌附着 在植物细胞壁，t d n a 被剪切加工后穿越细菌细胞壁、原生质膜和核膜，最后 整合进植物基因组。其具体过程甚为复杂。首先，当根癌农杆菌附着到受伤的植 物细胞壁上之后，会诱导植物创伤细胞分泌信号分予，如乙酰丁香酮( a s ) 。然 后，a s 等与组成型表达的v i r a 蛋白质因子结合，引起v i r a 蛋白质自身磷酸化， 并将信号传递到v i r g 蛋白质，后者是一种d n a 结合蛋白，它被磷酸化后通过特 异性地v i r 区基因启动子中1 2 b p 的保守序列结合而加强对与转录有关的其它蛋 白的聚集，从而活化v i r 区其它基因。r b 基因合成组成t 复合物向植物细胞转 移的膜通道”1 受到信号分子的激活作用之后，v i r d 基因编码的一种核酸内切 酶。先在t d n a 的r b 序列中的第3 和第4 碱基之间切开一个单链缺口，随后 在t d n a 同一条链的l b 序列中切出第二个单链缺口。于是t - d n a 变以单链 的形式释放出来，并在r b 序列的引导下，与v i r d 2 蛋白质结合成复合物，定向 的从根瘤土壤杆菌细胞转移到寄主植物细胞，再在v i r e 2 蛋白质的引导下，进入 寄主细胞核内并随机整和到染色体基因组上1 。整合过程中，首先靶d n a 出 现一个缺刻，随着d n a 解链，宿主细胞的5 斗3 的外切酶活性使缺刻扩大 成裂口，然后t d n a 侵入裂口，末端与靶d n a 单链上的少数核苷酸配对形成 2 异源二倍链，接着t d n a 悬接在外侧的末端被切掉，t d n a 与靶d n a 末端相 连，然后靶d n a 上链出现缺刻，并以整合后的t d n a 下链为模板合成t d n a 的第二条链，从而完成整个整合过程。同时，t i 质粒中移走的单链t d n a 区， 通过d n a 复制得到修复，因此尽管发生了单链t - d n a 的转移，根癌农杆菌细 胞并没有丧失任何遗传信息。 图l 农杆菌介导转化植物细胞分子机理示意图皓1 2 农杆菌介导法转化单子叶植物的研究进展 农杆菌介导的植物遗传转化最初是在双子叶植物中取得成功的。这并非偶 然，正如前面所提到的，与双子叶植物相比，水稻等单子叶植物对农杆菌的侵染 不敏感，因而它们不是农杆菌的天然宿主，致使人们曾一度认为农杆菌不能转化 单子叶植物，p o r t r y k u s 随3 就曾断然指出，农杆菌转化单子叶植物是不可能的。 然而，农杆菌介导法在转化植物中所表现出的诸多优点使人们并没有停止研究其 应用于单子叶植物的步伐。 2 1 农杆菌介导法转化系统的特点 植物的转化技术一开始是以原生质体为受体的p e g 介导法和电激法占主要 地位。后来，为了解决基因转化对原生质体的依赖，人们开始尝试许多将外源基 因直接导入组织或细胞的方法，如基因枪法、花粉管通道法、电激法、显微注射 法、超声波导入法、激光微束穿刺法、炭化硅纤维导入、电泳法等。 这些直接转化方法尽管有的如基因枪转化法等曾一度得到比较广泛的应用， 但均存在较大的缺陷，如基因枪转化法成本高昂，对细胞造成较大损伤或死亡； 花粉管通道法效率低，在操作上受到季节限制，且后代筛选工作量极大；电激法 等其他几种方法普遍存在转化效率低下，技术不成熟等缺陷。不仅如此，这些将 外源基因直接导入受体细胞的方法普遍存在一个最为致命的弱点，即转化后代的 遗传稳定性差，造成植株变异程度高，目标性状难以稳定。 与上述直接转化方法相比，农杆菌转化法属于一种纯生物学的方法，其精巧 的转基因系统使其具有明显的优越性：转化频率高。t d n a 在转移过程中受 到蛋白质的保护及定向作用，使其免受核酸酶的降解，能完整、快速、准确地进 入细胞核，因而转化效率较高；可导入大片段d n a ，且导入的外源基因拷贝 数低，整合位点稳定，表达效果好。而直接转化法的外源d n a 结构变化较大， 常发生d n a 环化、甲基化、片断分离、丢失和重排等；再生株可育程度高， 后代遗传稳定性好，变异小。研究中发现，基因枪等直接转化法常造成大量的不 育株和变异株，造成了应用中的困难；技术要求低，操作设备简单。由于转化 机理清楚，有人甚至认为农杆菌转化方法是一种“天然的”转化方法，有助于避 免转基因沉默，所以目前国内外学者开始普遍重视农杆菌介导的转化技术1 0 3 o 随着农杆菌转化技术各种参数的不断优化和技术体系的不断完善，目前这一方法 已取代基因枪转化法成为水稻遗传转化研究工作的首选。 2 2 农杆菌介导法转化单子叶植物的影响因素 农杆菌转化单子叶植物的影响因素很多，如何建立适宜的转化条件是取得成 功的关键。 2 2 1 植物基因型 不同种的单子叶植物对农杆菌的敏感程度不同，甚至同一种单子叶植物的不 同品种对农杆菌的敏感程度也会有较大差异。一般认为，基因型的特异性与细胞 4 的生理状态有关，具体来说与细胞壁的结构( 影响细菌吸附) 、细胞受伤后的生 理反应( 如小分子酚类化合物的分泌) 、细胞内源激素水平( 影响细胞的生长、 分化) 等因素有关。因此，在转化之前必须针对植物的不同基因型选择适宜的转 化条件。 就水稻而言，尽管利用农杆菌介导转化水稻的3 个皿种粳稻、籼稻和爪哇稻 都获得了成功n 卜”1 ，但不同品种转化难度不同，一般粳稻比籼稻容易转化成功， 籼稻不同品种之间也存在明显的差异。然而籼稻品种分布广泛，占整个水稻品种 的8 0 以上，对其改良的意义更大。因此，探索适于籼稻遗传转化的各种技术条 件成为一项十分重要而紧迫的工作。 2 2 2 再生系统的来源及状态 一个理想的转化受体应具备较高的被感染率和转化植株易于再生两方面的 先决条件。因此，s m i t h 和h o o d 掣1 4 】认为用农杆菌转化单子叶植物，应选择处 于适宜生理状态的那些组织，其特点是：能够产生v i r 基因活化分子；农杆菌比较 容易附着于细胞壁上；内源激素浓度适宜；细胞分裂旺盛，d n a 大量合成，有 利于t d n a 的摄入和整合。最初，人们尝试将农杆菌注入茎尖、根尖等处的分 生组织，这些分生组织容易被农杆菌感染而转化，但不易再生转基因植株c 1 5 o 幼胚的转化频率较高，且易于筛选，但转化受季节和环境的限制。幼穗、幼胚和 成熟胚来源的愈伤组织常被用于禾谷类作物转化。v i j a y a c h a n d r a 掣1 6 】研究水稻 不同组织( 细胞) 对农杆菌、r i r 基因诱导的结果表明，成熟胚盾片和盾片来源的愈 伤组织是最容易被农杆菌转化的组织。h i e i 等7 1 以成熟胚盾片来源的愈伤组织 作为粳稻转化的起始材料获得了高达2 8 6 的转化频率。成熟胚取材方便，其愈 伤组织转化效率高，因而被广泛应用。 2 2 3 菌株与质粒载体的类型 在一大批被分离的农杆菌菌株中，仅有少数几种被改造并应用于单子叶植物 转化。其中常用的如章鱼碱型菌株l b a 4 4 0 4 ，琥珀碱型菌株a 2 8 1 等。菌株a 2 8 1 是超毒力菌株，其宿主范围广、转化率高，这是由于该菌株中的t i 质粒p t i b 0 5 4 2 所决定的。由此发展起来了两个转化系统：一是由p t i b 0 5 4 2 衍生出来的卸甲t i 质粒e h a l 0 1 ，另一个是将v i r 区部分基因引入普通双元载体中建立起来的超级 双元载体系统。两者在单子叶植物转化中发挥了重要作用。 h i e i 等人1 测试了两个菌株和3 个双元载体质粒在水稻中的转化效率。结 果表明l b a 4 4 0 4 ( p t o k 2 3 3 ) 较l b a 4 4 0 4 ( p l g l 2 1 h m ) 和e h a l 0 1 ( p i g l 2 1 h m ) 均 高，而e h a l 0 1 ( p t o k 2 3 3 ) 甚至比普通农杆菌与双元质粒组合对水稻的转化率还 低。但在小麦和大麦转化中，e h a l 0 1 ( p i g l 2 1 h m ) 则是最有效的。可见菌株和质 粒组合对特定单子叶植物的转化具有特异性。此外，在质粒构建过程中，可考虑 应用超驱动序列( o v e r d r i v es e q u e n c e ) 、内含子、5 末端序列、基质结合区( m a r ) 等来增加单子叶植物对农杆菌的敏感性、提高转化效率和增强外源基因的表达活 性 1 8 20 2 2 4 v i r 区基因的诱导 与双子叶植物不同，大多数单子叶植物受到农杆菌侵染后，其受伤部位附近 的细胞容易木质化或硬化而没有明显的细胞分裂现象，不能或极少释放酚类化合 物，因而不能诱导产生农杆菌趋化运动和诱导v i r 区基因表达。因此多数单子叶 植物不在农杆菌宿主范围之列，这曾是制约农杆菌转化单子叶植物的一个关键因 素。 s t a c h e l 等人 悖1 首先从烟草中分离出两种农杆菌侵染诱导物乙酰丁香酮( a s ) 和羟基乙酰丁香酮( 0 h a s ) 。目前已经发现至少四类4 0 多种酚类化合物对m 都有诱导活性。化合物而不必采用伤害处理。h i e i 等人证明水稻转化成功的一个 关键因素是在转化的多个步骤中加入1 0 0pm o l l 的乙酰丁香酮。c h a r t 等【2 0 1 认为 马铃薯细胞悬浮液中富含酚类化合物，采用马铃薯细胞悬浮液作为共培养的培养 基同样能提高农杆菌转化效率。许耀等砼还发现一些小分子量的糖类，如半乳 糖和葡萄糖等在乙酰丁香酮浓度很低或缺乏时，也可极大地促进v i r 基因的表达， 但有研究表明，在乙酰丁香酮浓度达1 0 0um o l l 时，两者没有协同作用【2 2 】。 此外，研究还表明：较高的渗透压、适当浓度的冠瘿碱也能有效地增强v i r 基因的表达。 2 2 5 选择合适的培养条件 优良的组织培养和共培养条件是制约水稻遗传转化成败的一个关键因素。水 稻成熟胚和幼胚愈伤组织的诱导及继代培养基本培养基有m s 、n 6 、n b 和c c 培养基。易自力等伫3 】证明籼稻在c c 培养基上出愈率最高，粳稻则在n b 培养基 上出愈率最高。a b a ( 2 5 5 0 m g l ) 的添加有利于愈伤组织的诱导和胚性状态的 维持，多效唑( 1 i n g l ) 的添加有利于壮苗。 农杆菌转化的共培养条件除了培养基成分外，主要包括温度、p h 值和时间 6 等。低于2 8 c 的温度、较低的p h 值( 一般为5 2 ) 有利于诱导v i r 基因的表达口。 共培养的时间依不同的基因型与农杆菌菌株组合不同，目前的资料大多为2 4 日。 2 2 6 标记基因及筛选剂的选择 在单子叶植物基因转化中，外源基因稳定整合的频率低。如何选择适当的筛 选标记以准确、有效地区分转化与非转化细胞，产生选择压力，使未转化细胞不 能生长，且不干扰细胞的正常生长与植株再生是转化成功的重要环节之一。常用 的筛选标记基因有：新霉素磷酸转移酶( n p t i i ) 基因、潮霉素磷酸转移酶( h p t 或 h p h ) 基因、p h o s p h i n o t h r i c i n ( p p t ) 乙酰基转移酶( p a t ) 基因、a m i n o g l y c o s i d e 乙酰 转移酶基因、二氢叶酸还原酶( d h f r ) 基因等，其中前三种使用较为普遍。 n p t - i i 基因编码产物对某些氨基葡萄糖苷类抗生素如卡那霉素、新霉素、g 4 1 8 等具有抗性，可以利用这些抗生素作为选择剂。但对水稻而言，卡那霉素对愈伤 组织的选择效果较差，且选择后愈伤组织再生绿苗困难，g 4 1 8 的选择效果较好， 但也同样面临再生困难的问题1 2 扪。潮霉素是一种很强的细胞生长抑制剂，对许多 种植物都产生很高毒性。能有效识别转化与未转化组织，对愈伤组织再生影响较 小，因此，在农杆菌介导的水稻转化中，蛔r 基因已被广泛使用。 2 3 农杆菌介导法在水稻等重要单子叶植物转化中的应用 单子叶植物转化最早获得成功的是石刁柏。1 9 8 7 年，b y t e b i e r 等人【2 6 1 用含 b o $ n p t 基因的重组t i 质粒感染石刁柏愈伤组织，获得抗卡那霉素的再生植株， 并获得了外源基因整合的分子证据。水稻的农杆菌介导转化直到1 9 9 0 年口7 1 才有 成功的报道。在此之后，玉米【2 8 1 、小型2 9 1 、大麦【3 0 】、甘蔗叫等重要经济作物均 获得了利用农杆菌转化成功的报道。据统计，到2 0 0 1 年底为止，已有共7 科2 0 多种单子叶植物利用农杆菌转化获得成功。而且在水稻等重要农作物中的转化频 率最高已超过3 0 0 , 6 ，接近双子叶植物。 3 水稻抗虫基因工程研究进展 8 0 年代以来，基因工程技术的兴起和发展，为防治害虫开辟了一条崭新的 途径。由于该方法具有安全、有效、可降低投资和减少环境污染等诸多优点，因 而，自1 9 8 7 年首次报道抗虫转基因植物以来f 3 2 3 5 】，在该领域的研究方面取得了 长足的进步。与此同时，通过利用基因工程手段解决水稻这一重要粮食作物的抗 7 虫问题成为人们的共同目标。 3 1 几种常见的抗虫基因及其在水稻基因工程中的利用 目前应用于植物转化的抗虫基因根据其来源可分为三种类型：微生物来源的 抗虫基因、植物来源的抗虫基因和动物来源的抗虫基因。而应用到水稻转化的主 要是前两类。 3 1 1 苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因 苏芸金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 在芽孢形成过程中产生大量伴胞 晶体。伴胞晶体主要由苏芸金芽孢杆菌毒蛋白( b t - t o x i n ) 或称杀虫晶体蛋白( i c p ) 组成。b t - t o x i n 是一类分子量为1 3 0 1 6 0 k d 的蛋白质，当被昆虫取食后，昆虫肠 道内专一的蛋白酶将其降解产生分子量为6 0 k d 左右的多肽分子。该多肽分子可 与昆虫中肠道刷状缘表皮细胞表面的特异受体结合，干扰钾a t p 酶活性，造成 离子渗漏，破坏细胞的渗透平衡，进而引起细胞肿胀和裂解，并最终导致昆虫死 亡。 b t - t o x i n 基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因。自1 9 8 1 年s c l m e p f 和 w h i t e l e y 口卯分离克隆出第一个b t t o x i n 基因，到目前为止，已有1 8 0 多个不同 的b t - t o x i n 基因被克隆和测序b 们。目前对这些结晶蛋白的分类方法有多种，较 为公认的是将其分为4 大类1 3 种类型。其中类型i ( c r y i ) 具有抗鳞翅目的活 性，类型i i ( c r y l l ) 具有抗鳞翅目和双翅目的活性，类型i l i ( c r y l l l ) 抗鞘翅目 害虫，类型i v ( c r y i v ) 抗双翅目害虫。 人们对b t t o x i n 基因的利用经历了一段长期的探索过程，最先获得的转 b t - t o x i n 基因植株所用的基因是一完整的野生型基因或切短了3 、端的野生型基 因，所获得的转基因植株抗虫性都很弱，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0 0 0 1 或者几乎检测不到。进一步的研究发现，b t - t o x i n 基因在植物中的表达量过低主 要是由于野生型基因m r n a 的不稳定性造成的。另外，b t - t o x i n 基因是原核基因， 在植物中进行翻译时由于某些种类的t r n a 含量过少而降低了翻译效率。于是， p e r l a k 日扪和i a n n a c o n e 3 9 1 等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，分别对c r y ia ( b ) 基因和c r y i i i 基因进行了改造，去除了原序列中存在的p o l y a 和富含a t 的a t t t a 序列等不稳定元件，并选用了植物偏爱的密码子。此外，根据以上原 理人工构建b t - t o x i n 基因也获得成功。结果使植物毒蛋白的表达量增加高达可溶 8 性蛋白的o 0 2 一1 利用b t t o x i n 基因在水稻中的表达来控制螟虫危害，已有许多成功的报道。 1 9 9 1 年谢道听h 们采用花粉管通道法成功的将b t - t o x i n 基因导入水稻品种中花1 l 号，获得了转基因水稻植株，分子杂交技术证明杀虫基因已整合到水稻基因组中。 m a q b o o l 等通过基因枪将人工合成的c r y i i a 基因转入水稻，毒蛋白的表达 量可高达l ，某些植株的杀虫率可达到1 0 0 。向友斌、舒庆尧等h 23 用农杆菌 介导法将密码子经优化的c r yia ( b ) 基因和c r yia ( c ) 基因导入到5 个籼、梗稻品 系中，其中转c r y ia ( b ) 基因的秀水1 1 获得了高抗二化螟、稻纵卷叶螟的性状， 被正式定名为克螟稻。经检测其b t 毒蛋白的含量占可溶性蛋白的0 5 3 ，对 1 - 5 龄幼虫的毒杀作用达到1 0 0 。t u 等4 如将b t _ - t o x i n 基因导入明恢6 3 ，并利 用其制得杂交后代汕优6 3 ，对此杂交后代进行田间分析表明其对螟虫表现高抗， 且产量未受到任何影响。 3 1 2 蛋白酶抑制剂基因 蛋白酶抑制剂( p r o t e i n a s ei n h i b i t o r ，p i ) 是一类存在于某些植物中的蛋白质， 它可与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用，形成酶抑s d n 复合物( e i ) ，由此 抑制蛋白消化酶的活性。此外，蛋白酶抑制剂还可进入昆虫淋巴系统，干扰昆虫 免疫功能和蜕皮过程。 x u 等3 将由a c t i n 1 启动子驱动的c p t i 基因导入水稻品系，获得了抗二化 螟的株系。安韩冰等h 5 3 将c 埘基因用基因枪导入水稻，获得了抗性可育株。 朱祯等m 们对c p t i 基因经体外修饰后导入水稻恢复系明恢8 1 和明恢8 6 ，其对螟 虫表现出了良好的抗性；用其配制的杂交组合目前已完成中试，表现出了良好的 应用前景。张良佑等h 7 1 用基因枪法将s