（有机化学专业论文）手性分析在原料药和医药中间体质量控制中的应用.pdf

摘要 分析了手性分析在药品质量中的重要性和紧迫性，剖析了目前药物手性分析 的手段，介绍了手性固定相在高效液相色谱中的应用研究进展，确立了原料药和 医药中间体手性分析研究的选题思想， 利用手性固定相高效液相色谱( h p l c ) 方法，重点介绍了氯毗格雷原料药手性 分析方法的优化过程，在优化过程中重点考察了二乙胺、流动相配比、流速和柱 温对分离的影响，通过一系列方法的优化确定最佳的色谱条件，建立了氯吡格雷 原料药中手性对映异构体的h p l c 分析方法，并对实际样品进行分析，方法简单、 专属性强。 介绍了手性固定相h p l c 分离技术对西酞普兰革酸盐对映异构体进行分离并 按国际要求进行方法的科学验证，方法可操作性强，具有较好的专属性、检测限 低、重现性好、结果准确可靠，符合产品生产质量控制要求。 简要介绍了左乙拉西坦及关键中间体、培哚普利关键中间体、缬沙坦、卡巴 拉汀和福辛普利三个关键中间体的手性固定相h p l c 分析方法，均具有较好的专 属性，方法操作性强、重现性好、线性范围广、准确度高。 根据研究进度安排，完成了氯吡格雷、西酞普兰草酸盐、缬沙坦、左乙拉西 坦、卡巴拉汀等原料药和左乙拉西坦关键中间体、培哚普利关键中间体、福辛普 利关键中间体等化合物的手性异构体的h p l c 分析方法的开发，并对分析方法进 行了科学验证。 a b s t r a c t i nt h i sr e p o r t , w ed i s s e r t a t e dt h ei m p o r t a n c ea n du r g e n c yo fc h i r a la n a l y s i si nd r u g q u a l i t yc o n t r 0 1 s u m m a r i z e dt h ep r e s e n tm e t l l o d so nc n a n t i o m e r i cp h a r m a c e u t i c a l a n a l y s i s ，i n t r o d u c e dt h es t u d yd e v e l o p m e n tp r o g r e s s o n a p p l i c a t i o no fc h i r a l s t a t i o n a r yp h a s ei nh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( a p l c ) ，e s t a b l i s h e d s u b j e c ti d e o l o g yo fc h i r a la n a l y s i si na c t i v ep h a r m a c e u t i c a li n g r e d i e n t ( a p oa n d p h a r m a c e u t i c a li n t e r m e d i a t e c h i r a la n a l y t i c a lm e t h o do f c l o p i d o g r e la p lw a so p t i m i z e db ya p p l i c a t i o no f c h i r a l s t a t i o n a r yp h a s ei nh p l c t h ei n f l u e n c eo f d i e t h y l a m i n e ，m o b i l ep h a s e ，f l o wr a t ea n d c o l u m nt e m p e r a t u r ew e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u mc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o nw a s e s t a b l i s h e d t h ef a c i l i t ya n ds e l e c t i v i t yo ft h em e t h o dw a sp r o v e nb yt h ea n a l y s i so f t h ep r a c t i c es a m p l e t h ea p p l i c a t i o no f c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ei nh p l c s e p a r a t i o no f c i t a l o p r a mo x a l a t e e n a n t i o m e r sw a sv a l i d a t e da c c o r d i n gt ot h ei n t e r n a t i o n a lr e q u i r e m e n t t h em e t h o d w a sp r a c t i c a l ，s e l e c t i v e ，a c c u r a t ea n do fl o wd e t e c t i v el i m i t , g o o dr e p r o d u c i b i l i t y , w h i c hw a si na c c o r d a n c ew i t ht h er e q u i r e m e n to f q u a l i t yc e n t r 0 1 t h ea p p l i c a t i o no fc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ei nh p l ca n a l y s e so fl e v e t i r a c e t a ma n d i t sk e yi n t e r m e d i a t e ，k e yi n t e r m e d i a t eo f p e d n d o p r i l , v a l s a r t a n , r i v a s t i g r a i n e ，a n dt h r e e k e yi n t e r m e d i a t e so ff o s i n o p r i lw e r es u m m a r i z e d t h em e t h o dw a ss e l e c t i v e ，f a c i l e ， a c c u r a t ea n do f g o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n dw i d el i n e a rr a n g e a c c o r d i n gt os c h e d u l eo ft h es t u d y ，w ec o m p l e t e dt h ee s t a b l i s h m e n to fc h i r a l h p l ca n a l y t i c a lm e t h o & o fc l o p i d o 孕e l ，c i t a l o p r a m ，v a l s a r t a n ，l e v e t i r a c e t a m ， r i v a s t i g m i n ee t ca p ia n dl e v e t i r a c e t a n a ，p e r i n d o p r i l ，f o s i n o p r i lk e yp h a r m a c e u t i c a l i n t e r m e d i a t e s ，w h i c hw a sv a l i d a t e da c c o r d i n gt ot h ei n t e r n a t i o n a lr e q u k e m e n t 2 第一章手性分析前沿 一、手性分析在药品质量中的重要性 手性是自然界的一种普遍现象，天然存在的手性化合物很多，构成生物体的 基本物质如氨基酸、糖类等也都是手性分子，如自然界中的糖为d - 构型，氨基酸 为l 构型，蛋白质和d n a 的螺旋构象又都是右旋的。1 8 4 8 年，j i r a g e o3 首次成功地 用结晶方法分离出酒石酸铵盐的外消旋体，他的工作标志着手性分离的开始近 年来手性拆分技术的研究取得了可喜的进展嘲，仅以药物为例，目前，常用的化 学药物约为1 8 5 0 种，其中5 2 3 种是天然半合成药物，除6 种非手性药物和8 种外消 旋体外，都是单一对映体；另外在1 3 2 7 种全合成药物中，7 9 9 种为非手性药物， 5 2 8 种为手性药物( 约占4 0 ) 嘲。手性药物的快速发展可由1 9 9 3 2 0 0 3 年全世界手 性药物的销售统计和预测来说明( 见表1 ) m 。1 9 8 0 年手性药物在世界药物销售总 额中仅为3 ，1 9 9 0 年也仅为9 ，而1 9 9 8 年世界药物市场的总销售额为3 3 5 0 亿美 元，手性药物的销售却占了3 0 ( 约9 0 0 亿美元) ；1 9 9 9 年世界药物销售额为3 6 0 0 亿美元，手性药物占3 2 ( 约1 1 5 0 亿美元) ，为各类化学药物之首旧。与手性药物 增长同步，手性原料药和手性中间体的市场也在增长，而且手性药物的这种发展 趋势仍在不断上升，到2 0 0 6 年全球上市的化学合成新药中，至少有6 0 为单一异 构体药物。广阔的应用前景和巨大的市场发展推动了手性分离的研究。 表11 9 9 3 - - 2 0 0 3 年手性药物的销售额 t a b 1t h es a l ea m o u n to fc h i r a lm e d i c i n e sb e t w e e n1 9 9 3 2 0 0 3 1 年份 1 9 9 31 9 9 41 9 9 51 9 9 61 9 9 71 9 9 81 9 9 92 0 0 3 l 销售额( 亿美元) 3 5 6 4 5 25 0 07 2 98 7 99 0 0 1 1 5 0 1 4 6 0 由于光学活性化合物与生物活性和药物活性密切相关，研究有效方法分离和 制备光学活性化合物具有显著的现实意义。在医药工业，己知药物中约有3 0 - 4 0 是光学活性的手性药物。在生物的手性环境中，药物分子的手性不同会表现出 截然不同的生理、药理、毒理作用”。多巴胺是治疗帕金森症的有效药物，临 床实验证明仅s 一异构体有效，r 一异构体则产生严重的副作用。镇静剂沙利度胺 ( t h a l i d o m i d e ) 曾在欧洲广泛使用，但它只有r 一异构体具镇静作用，一些孕妇服 用此药后引起胎儿畸变，实验证明，这是s 一异构体副作用的结果。1 。1 9 9 2 年3 月， 美国食品和药物管理局( f d a ) 发布了手性药物的行政指令，要求所有在美国上市 的消旋体药物均要说明其中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。 1 9 9 7 年1 月，f d a 发布了手性药物发展的另一条行政指令，对于早期批准上市的消 旋体药物要求用相应成分手性药物替代，对于这类新上市的光学纯药物将提供5 年专卖权，并且相应消旋体药物须撤出市场。目前这个年销售额超过1 0 0 0 多亿美 元的高新科技产业强烈地吸引世界各国的大制药公司及其相关的研究机构，使其 相继从事手性药物的研究与开发”。 手性化合物是其化合物结构具有左右对称的性质，它们的化学、物理性质非 常相似。手性化合物尤其是手性药物对映体的分离分析具有非常重要的意义，已 成为分析化学领域中广泛研究的课题之一，这是因为手性药物的两个对映体具有 不同的药理和毒理作用。近几十年来，手性化合物的药害事故屡见报道，医药品 中比较有名的药害是酞咪多啶酮，1 9 5 7 年由联邦德国吕南特尔化学公司首先生 产，作为镇静剂应用于临床，此后的几年中，发现许多服用这种药物的早期孕妇， 其婴儿有严重的畸形现象，1 9 6 1 年被禁止使用。为了研究该药物左右旋体对妊娠 的影响，1 9 7 9 年b l a s h k e 等“”把左右旋体分离后，分别投喂妊娠中的小白兔，发 现( s ) 异构体具有强烈的致畸作用。这一研究，进一步唤醒了人们对异构体化合 物的重视。为了能准确地了解药效和安全用药，发展和建立简单、快速的手性药 物对映体的分离分析方法，并应用于临床研究和医药质量控制，显得日益迫切。 二、药物手性分析的手段 手性化合物尤其是手性药物对映体的分离分析在药物研究和医药工业发展 方面具有非常重要的意义，已成为分析化学领域中最具有挑战性的研究课题之 一。发展和建立简单快速的手性药物对映体分离分析方法，并用于质量控制和临 床研究，也是医药界关注的重大课题。 高效液相色谱( h p l c ) 、气相色谱( g c ) 、超l 临界流体色谱( s f c ) 和高效毛细管 电泳( h p c e ) 是手性拆分的主要手段。截止目前，h p l c 被认为是测定对映体纯度和 分离制备光学纯单一对映体的最好的方法“1 。它适应范围广，操作条件温和， 不会发生分离物构型变化或生物活性被破坏等现象，常用来分离分析对映体药 物，技术成熟且有许多手性固定相和手性添加剂可用；g c 只能分析挥发性物质， 在药物手性中间体分析中将有应用的空间。“8 ；s f c 采用手性固定相在手性化合 4 物的分离也具有独到的应用酬；h p c e 因具有高效、快速、低耗、操作简单、适 用范围广和分离模式多样等优点而受到广泛重视，现已用于对映体的分离分析。 毛细管电泳等是常用的手性药物分离方法m 1 。在手性分离中毛细管电泳具有以下 优点：较高的分离效率，使具有较小分离选择系数的对映体也可以达到满意的分 离；可供选择的分离模式多且变换简单，手性选择试剂直接加入载体电解质中， 容易通过选用不同的手性选择试剂和改变背景电解质的组成提高分离选择性；手 性选择剂的消耗量很少，运行成本较低。 现已报道对映体分离的模式还有毛细管区带电泳( c z e ) 、毛细管凝胶电泳 ( c g e ) 、胶速电动色谱( m e c c ) 。其中c z e 需采用手性添加剂与对映体形成稳定性各 异的外消旋体来进行分离分析；c g e 是将环糊精等手性添加剂固定在凝胶上进行 分离分析，不足之处在于凝胶和手性选择性添加剂品种有限；在m e c c 的缓冲液中， 利用手性试剂和表面活性剂构成“假固定相”，引入分配机理分离对映体，但对 缓冲液的要求比较高，和质谱( m s ) 的联用也受到限制。 近年来兴起的毛细管电色谱( c e c ) 是h p c e 和h p l c 的杂化体，它将这两者有机 地结合起来，可以灵活地将手性固定相引入方式、流动相添加剂和驱动方式等几 种因素相互组合，而形成多种分离、操作模式；在分离选择和柱效等方面显示了 h p l c 和h p c e 单独使用时所不能达到的优势1 。和h p l c 相比，它所需的固定相和样 品大大减少；和h p c e 相比，它克服了电泳模式的不足，兼有 l p l c 分配机理和h p c e 电迁移特征。作为一种新型的微分离技术，它在分离分析对映体方面极具潜力。 三、手性固定相在高效液相色谱中的应用研究进展 目前常用的h p l c 手性分析方法有3 种：手性衍生化：注意手性衍生化试 剂对映体纯度7 9 9 ，在衍生化反应过程中无外消旋发生 t 6 o 手性流动相添加剂： 因试剂较贵，用量较多，检测困难，峰形及分离度较差，应用较少。“。手性固 定相：手性固定相是将手性物质化学键合或涂布在担体上形成的，它与被分析的 对映体相互作用形成瞬时的非对映异构配合物，其结合强度一个异构体强于另一 个，故保留不同，得以分离。现在手性分离的直接法已成为药物手性分析和制备 的主要方法删。 对映体的拆分曾被认为是相当困难及复杂的实验技术，随着2 0 世纪7 0 年代手 性色谱的兴起和迅速发展，该难题得以逐步解决，尤其是近几年，药物对映体 的分析已成为药学领域的研究热点。将手性化合物键合到固定相表面后，由于样 品中的对映体与键合的子性分子形成非对映异构体络合物的结合能力的差异而 达到拆分目的，该固定相即被称为手性固定相( c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，c s p ) 。 由手性固定相液相色谱分离测定对映体己成为对映体分离发展最为迅速的领域 h 岫。目前，采用高效液相色谱法( l p l c ) 分离手性化合物取得了显著进展，已广泛 应用于众多领域，并已制备出大量用于h p l c 的c s p 。拟就目前应用较广泛的几类 c s p 作一简要介绍。 1 多糖类衍生物c s p 多糖类衍生物包括纤维素衍生物和直链淀粉衍生物。纤维素自身具有手性识 别能力，但不能直接做固定相，然而其衍生物作为c s p 具有较高的手性识别能力， 能拆分大量的对映体；直链淀粉与纤维素同样系由d 一葡萄糖单元构成，但直链淀 粉因在其d - 葡萄糖单元a 键上存在1 个螺旋结构而致使其结构更有序；同时，上述 2 种衍生物的手性识别能力存在较大差异，可能是因葡萄糖单元构象不同、结构 有序性存在差异所致。目前，其广泛用于h p l c ，可分离众多药物对映体。 2 大环抗生素类c s p 大环抗生素类物质的分子结构具有多种官能团和不对称中心的特点，其糖肽 型还含有孔穴结构，可与被分离物质产生多种作用，如疏水作用、包合作用、氢 键形成、立体排斥、范德华相互作用等。在大环抗生素类分子中，除含疏水部位 外，通常还具有亲水基和可离子化的基团，因而其具有良好的水溶性。目前，用 于对映体分离的大环类抗生素根据其结构特点可分为糖肽类柄状霉菌素类、多肽 与氨基糖苷类3 类，由此提示抗生素类c s p 具有应用范围广、柱容量较高等特点。 3 分子烙印c s p 分子烙印技术是一种在模拟生物体内抗原与抗体相互作用时利用“锁匙” 原理的基础上发展起来的新技术，利用该技术制得的分子烙印聚合物对烙印分子 具有“预定”选择性，解决了针对具体手性分子的c s p 设计问题，为其设计提供 了崭新、有效的解决方法，在h p l c 手性分离和制备方面受到人们的广泛关注。 4 环糊精类c s p 环糊精( c y c l o d e x t r i n ，c d ) 类最初应用于薄层色谱固定相中，对h p l c 而言， 6 c d 具有较好的光学纯度且不干扰紫外光谱对化合物的检测，因此可将其键合到合 适的载体上制备c s p ，也可用于流动相添加剂。目前，采用环糊精类作为c s p 拆分 对映体的研究已有报道“7 一。 5 蛋白质c s p 将a 。一酸性糖蛋白化学键合至微粒硅胶上制备得到蛋白质c s p 。a l - 酸性糖蛋白 是天然蛋白质，分子中具有部分特殊的结合位点，对药物对映体具有高度立体选 择性，故可固化为c s p 。蛋白质是一类复杂的高分子聚合物，所含亚单位l 一氨基 酸具有手性特异性，能特异性地键合小分子，对手性分子具有很强的识别能力， 因其独到的手性选择性而备受人们青睐，但同时也存在柱效和柱容量低、柱强度 差等缺点。 6 聚合物c s p 目前，部分常用的c s p 包括环糊精类、氨基酸类等，多由小分子物质制成， 因其易受流动相极性，酸、碱性及温度等因素的影响，所以能分离的药物对映体 有限，且分离效果通常不尽人意。而另外一部分聚合物c s p ，如聚硅氧烷类、聚 多糖类等，则在较大程度上克服了上述不足，并能良好拆分许多小分子c s p 无法 分离或分离效果差的对映体“”。聚合物c s p 能拆分大量的对映体，包括轴向和平 面非对称化合物、含金属化合物、含手性硫和磷原子的化合物及其衍生物。由于 外消旋体主要差异仅在于其立体化学构型，因此h p l c 的聚合物c s p 对其手性识别 能力也直接与对映体自身的几何构型有关，对映体除了与聚合物c s p 形成不稳定 的复合物外，c s p 的手性空间也是其重要因素，此外，操作温度等多种因素均可 对手性识别能力产生极大影响嘲。 7 配体交换型c s p 配体交换型c s p 与手性配体流动相的拆分机制相同，均为手性配体键合到固 定相基质成为c s p 。配体交换型c s p 主要用于拆分氨基酸。目前，该色谱模式已成 为拆分未衍生化d l - 氨基酸的最简便且有效的方法。其可分为c s p 配体交换色谱法 ( c s p - - l e c ) 和手性流动相配体交换色谱法( c m p l e c ) ，前者因具有使用方便、分 离样品种类多的优点备受人们关注。 8 小结 c s p 具有较高的手性拆分能力和良好的耐用性，可对较多药物对映体进行快 7 速、高效的分离，具有广泛的临床应用前景。手性识别能力除与对映体自身结构 特征有关以外，还与溶液p h 值、操作温度等有关。目前，虽然c s p 还存有一些不 足，但笔者认为，通过对c s p 结构和手性拆分能力的关系研究，人们必将寻找到 更为高效的c s p ，从而推动药物对映体分析工作的深入开展。c s p 的研究为拓宽 h p l c 的应用范围奠定了基础，并推动其发展。 四、手性分析研究选题思想 1 研究项目背景分析和选题意义 手性药物的研究近二十年来发展速度较快，成为药学领域的一个研究热点， 因此也引起各国政府甚至各国药政管理部门的极大重视，许多国家对手性药物的 研究、申请和注册等都提出了相应的规定和要求。浙江华海药业股份有限公司是 一家以仿制药为主的出口型制药企业，大部分原料药和中间体都具有手性成分， 在产品的质量控制中手性分析成为公司生产、注册、销售的瓶颈，急需攻克手性 分析难题。项目完成后将产生可观的经济和社会价值，首先公司目前就有二十多 个待解决的手性分析问题，这些问题不能有效解决将严重影响产品的注册和销 售。 其次在产品开发中存在大量的手性分析问题，这些问题不能有效解决将严重 影响产品的开发速度，影响公司未来的发展。圆满解决将提高公司的研发水平和 企业认可度，为公司产品进入国际规范市场打好基础。 最后，产品和中间体手性分析方法的建立将为人们安全用药提供保障，造福 人类。 根据目前手性分析技术发展水平，结合各国药典对药品分析方法的要求，以 及国际药物注册和国内注册的技术要求，开发的手性分析方法必需满足实用性和 国际通用性的特点。目前在各国药典中h p l c 方法已成为含量和有关物质的主要 分析手段，手性固定相已有较多国际品牌，广泛应用于药品、原料药和中间体的 手性分析，方法较成熟，浙江华海药业股份有限公司有大量先进的气相和液相色 谱仪，具有一定的条件，按手性固定相法一定可以解决大部分的手性分析难题。 3 研究项目内容 目前亟待解决的研究项目：氯吡格雷、福幸普利、培垛普利、西酞普兰等原 料药及关键中间体的手性分析方法。 本人要对工艺路线进行分析研究，确定关键手性分析目标，展开文献调研， 建立可行的手性分析方法，对方法进行优化，并进行验证，起草质量控制标准。 进度安排：第一年完成福幸普利、培垛普利、西酞普兰的手性分析难题；第 二年完成另外三个品种的手性分析难题。 参考文献 【1 j i r a g ek b ，m a r t i ncr jt r e n d sb i o t e e h n o l ，1 9 9 9 ，1 7 ( 5 ) ：1 9 7 2 0 0 2 m a i e rn m ，f r a n c od jc h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 1 ，9 0 6 ：3 3 3 3 b o m m ns jc h e m & e n gn e w s ，1 9 9 0 ，6 8 ( 2 8 ) ：9 - 1 4 4 c a n n a r s amj m b o s t o n ：2 0 0 0 5 5 陈亿新，刘天穗，刘汝峰，等广州大学学报，2 0 0 2 ( 1 ) ：3 9 _ _ 4 3 【6 r o s ah h ，p i l a rcf jc h r o m a t o g rb ，2 0 0 0 ，7 4 0 ：6 9 1 7 7 7 a b o l f a z ism ，r o b e r ttf ji n t e r n a ljp h a r m ，2 0 0 0 ，2 2 ：9 7 一1 0 2 【8 m i c h a e lj jc h e m i s t r y & i n d u s t r y ，1 9 9 6 ，2 0 ( 5 ) ：3 7 4 3 7 8 【9 t a n a k ay ，t e r a b es jc h r o m a t o g r a p h i s ，1 9 9 9 ，4 9 ( 9 一1 0 ) ：4 8 9 4 9 5 【1 0 b l a s e h k eg ，k r a f th p ，f i c k e n t s c h e rk ，e t c ja t z n e i m - f o r s c h ，1 9 7 9 ，2 9 ( 2 ) ： 1 6 4 m 一1 6 4 2 1 1 m y u n g h h ，g u a n g h u i t j i n y x ，j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 5 ，1 0 9 7 ：1 8 8 1 9 1 【1 2 c h r i s t o p h c , p a v l a p ，w o l f g a n g l ，j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 5 ，1 0 9 3 ：8 1 8 8 【1 3 y a r u s , m i n g s ，s h u l i n z ，e r e j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 5 ，1 0 9 1 ：1 0 2 - 1 0 9 1 4 s a l v a t o r ec ，g i o v a n n as , s a l v a t o r eb ，e t c ，jc h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 6 ， 11 2 9 ：1 4 0 - 1 4 4 1 5 g i o r g i on ，f r a n c e s c od , a l e s s a n d r oi n ，e t c ，jc h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 6 ， 11 2 6 ：3 5 7 3 6 4 1 6 j i n g z ，x i n z ，h u z ，e t c ，j c h r o m a t o g r a p h y b ，2 0 0 6 ，8 4 0 ：1 2 4 - 1 3 1 1 7 s e r a ps , y i l m a z t ，m e l e k m ，e t e ，j t e t r a h e d r o n a s y m m e t r y ，2 0 0 6 ，1 7 ：1 7 0 0 - 1 7 0 4 1 8 r o l a n d t , r o b e r t b ，a n t a l p ，j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 6 ，1 1 2 0 ：6 1 - 6 8 【1 9 w e n j i a n l ，j a y g ，j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 6 ，1 1 1 7 ：1 8 4 - 1 9 3 9 【2 0 s o n i amz ，i s a b e l d e lh ，m a r i 锄of ，e t c ja n a l y t i c ac h i m i c a a c t a 2 0 0 6 ，5 6 6 ：1 8 5 - 1 9 2 【2 1 z h a n s h e n gg ，h a lw , y t m s h e n gz jp h a r m a n db i o m e d i c a l a n a l y s i s ，2 0 0 6 , 4 1 ：3 1 0 - 3 1 4 2 2 b o e s t e njmm ，b e r l d a e i jm ，s c h o e m a k e rhe ，c t e ，jc h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 6 ， 1 1 0 8 ：2 6 3 0 【2 3 r o d g e r ws , y u n k y ，j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 6 ，1 1 0 1 ：8 6 - 9 3 2 4 l u i s arb ，l o u r d e sr ，m a r i ajg jc h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 6 ，11 2 5 ：2 2 0 2 2 8 2 5 1 m i nw ，p h i l i pjm ，w i n g - h o n gc ，e t e ，jc h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 6 ，111 2 ：3 6 1 3 6 8 2 6 k a r e nw p ，l a n ecs ，s t e p h e naw ，ja n a l c h e m ，1 9 9 8 ，7 0 ：2 3 3 1 - 2 3 3 5 【2 7 q i a ns ，s u s a nvo ，ja n a l c h e m ，1 9 9 9 ，7 1 ：2 1 3 9 2 1 4 5 2 8 y i w e ny ，b a o g e ns ，q u a n h o n gy ，e t c ，jp h a r m a n db i o m e d i c a l a n a l y s i s ，2 0 0 5 ，3 9 ：8 1 5 - 8 1 8 【2 9 t o r i b i o l , n o z a l mj ，b e m a lj l ，e t c ，j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 6 ，1 1 2 1 ：2 6 8 2 7 3 【3 0 1 l i s amn ，c h a r l e swm ，w i l l i a ml ，e t c ，jp h a r m a n db i o m e d i c a l a n a l y s i s ，2 0 0 6 a 0 ：9 0 1 9 0 9 【3 1 p h a m t t h ，j o s h ，a n n vs ，j p h a r m a n d b i o m e d i c a l a n a l y s i s ，2 0 0 6 ，4 1 ：1 - 1 1 3 2 黎艳，刘虎威毛细管电色谱手性分离进展色谱，2 0 0 0 ，1 8 ( 3 ) ：2 1 2 _ - 2 1 7 3 3 a p r y l lms , k y u n ghc m i c h e l l eb ，ja n a l c h e m , 1 9 9 6 ，6 8 ：2 2 4 8 - 2 2 5 0 3 4 l e n n i d a ，g e o r g e sg ，jc h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 5 ，1 0 9 1 ：1 1 - 2 0 3 5 b r e t o n d ，b u r e t d ，c l a i r p , e t e ，j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 5 ，1 0 8 8 ：1 0 4 - 1 0 9 【3 6 m o u g a n g h ，p i n g h ，y o n g c ，e t c ，j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 6 ，1 1 2 9 ：4 7 5 3 3 7 r a orn ，r a j ua n ，n a g a 曲a j ud ，jp h a r m a n db i o m e d i c a la n a l y s i s ，2 0 0 6 ，4 2 ： 3 4 7 3 5 3 【3 8 s u n c k , h e e s u n c ，s a n g k l ，e t c ，f o r e n s i c s c i e n c e i n t e r n a t i o n a l ，2 0 0 6 ，1 6 1 ：1 8 5 1 8 8 【3 9 m a r i alc ，d a n i e l ar ，s i l v a n at , e t c ，jc h r o m a t o g r a p h yb ，2 0 0 6 ，8 3 8 ：5 6 - 6 2 4 0 j a n eas ，b e r n a r dao ，p a u lko ，e t c ，jp h a r m a n db i o m e d i c a l a n a l y s i s ，2 0 0 6 ，4 1 ：1 0 8 8 1 0 9 4 4 1 i m r a na ，l a h o u c i n en ，a s h r a f g ，e t c ，t a l a n t a , 2 0 0 6 ，6 9 ：1 0 1 3 - 1 0 1 7 1 0 4 2 r a orn , n a g a r a j ud ，r 面ua n ，jp h a r m a n db i o m e d i c a i a n a l y s i s ，2 0 0 6 , 4 h 7 6 6 - 7 7 3 4 3 n e l em ，m o h a m e dm , y v a nv h ，jc h r o m a t o g r a p h ya ，2 0 0 6 ，1111 ：4 8 6 1 4 4 s a j o n z p , n a t i s h a n t k , a n t i a f d ，e t c ，j c h r o m a t o g r a p h y a ，2 0 0 5 ，1 0 8 9 ：1 3 5 1 4 1 4 5 】孙毓庆主编现代色谱法及其在医药中的应用【m 】北京：人民卫生出版社， 1 9 9 8 ：1 1 【4 6 】邹汉法编著高效液相色谱法 m 北京：科学出版社，1 9 9 8 ：1 1 【4 7 】b i e l e j e w s k aa ，d u s z c z y kk ，k w a t e r c z a k a ，e ta 1 jc h r o m a t o 罩a ，2 0 0 2 ， 9 7 7 ( 2 ) ：2 2 5 4 8 h eh ，l i uy ，s u nc ，e ta 1 j c h r o m a t o g rs c i ，2 0 0 4 ，4 2 ( 2 ) ：6 2 【4 9 】o k a m o t o y ，k a i d a y j c h r o m a t o g r a ，1 9 9 4 ，6 6 6 ( 1 2 ) ：4 0 3 5 0 w a t tap ，h i e ll ，m o r t i s h i r e - - - s m i t hr j jb i o c h e mb i o p h y sm e t h o d s ，2 0 0 2 。 5 4 ( i 3 1 ：2 7 5 第二章氯吡格雷原料药中手性对映体的 h p l c 分析方法的开发 氯吡格雷( c l o p i d o g r e l ) 是由日本第一制药和法国山诺菲( s a n o f i ) 公司 共同开发，1 9 9 8 年在美国上市，为血小板集聚抑制剂，用于粥样硬化症“棚。药 用氯吡格雷为s 构型，为单一对映体药物，它有r 的对映体存在，对产品中r 构型对映体的质量控制是现代药品质量的必然要求枷。虽然美国药典2 9 版已正 式收载了氯吡格雷硫氢酸盐原料和片剂的质量标准和检测方法，但在实际的操作 中还存在一些难以克服的含量和有关物质测定的困难，为了保证产品质量，我们 开发了此方法。 氯吡格雷与其对映异构体的结构式： c l o p i d o g r e l ( s - e n a n t i o m e r ) c l o p i d o g r e l ( r - e n a n t i o m e r ) 本文利用手性固定相高效液相色谱( h p l c ) 方法，通过分析方法优化和验证， 建立了氯吡格雷原料药中手性对映异构体的h p l c 分析方法，并对实际样品进行 分析，方法准确、可靠、通用。 1 实验部分 1 1 仪器和试剂 w a t e r s 2 6 9 5 型液相色谱仪，w a t e r s 2 9 9 6 二极管阵列检测器。 c h i r a l p a ka d - h 手性色谱柱，2 5 0 m 4 6 m ，粒径5 pm ( d a i c e lc h e m i c a l i n d u s t r i e s ，l t d ) 正己烷、异丙醇为色谱纯，二乙胺为分析纯。 s 一氯吡格雷手性对映体工作标准品( 浙江华海药业股份有限公司产品研发部 提供) ，手性纯度 9 9 。用异丙醇溶剂配制l m g m 1 的贮备液，再根据实验需要 用超纯水稀释成相应的浓度。 氯吡格雷混旋工作标准品( 浙江华海药业股份有限公司提供产品研发部) 。 1 2 色谱条件和实验方法 液相色谱采用c h i r a l p a ka d - h 手性色谱柱，2 5 0 m 4 6 m m ，粒度5um 波长选 用2 3 0 h m 。 2 结果与讨论 2 1 分析条件优化 2 1 1 流动相中二乙胺的浓度影响 由于氯毗格雷显碱性，根据手性分离原理应加入碱性试剂改善色谱分离。采 用混旋的氯吡格雷工作标准品，用异丙醇配成0 5 m g m l 的测试样品，改变流动 相中二乙胺的浓度，综合考察理论塔板数、分离度和拖尾因子等指标的影响( 见 表1 ) ，从实验结果看流动相中二乙胺浓度为0 2 时效果最好。在以下的实验中， 流动相中二乙胺浓度选用0 2 。 表1 流动相中不同量的二乙胺对分离指标的影响 流动相中二乙胺塔板数分离度拖尾因子 的浓度 os 一6 8 8 62 6 9s 一0 9 4 5 4 r - 4 8 3 6r - o 8 6 8 4 o 1 s - 1 6 7 7 54 8 2s - 1 1 7 3 5 r 一1 7 2 9 4r - 1 1 3 9 0 o 2 s 一1 8 5 2 64 7 3s - 1 1 4 2 1 r - 1 8 2 6 6l 卜1 1 4 5 3 0 3 s - 1 8 0 5 64 9 1s - 1 1 2 6 6 r - 1 7 7 1 7r 1 1 1 0 7 0 4 s - 7 4 0 22 6 4s - 1 0 0 9 4 r - 5 4 9 8r - o 9 6 7 3 条件：流动相：正己烷：异丙醇= 9 5 ：5 ；流速：0 5 m l m i m 浓度：0 5 m g m l ； 柱温；2 5 2 1 - 2 流动相配比改变对分离指标的影响 采用混旋的氯吡格雷工作标准品，用异丙醇配成0 5 m g m 1 的测试样品，改 变流动相中正己烷和异丙醇的配比，考察分离指标的影响( 见表2 ) ，从实验结 果看流动相中正己烷和异丙醇的配比为9 5 ：5 时分离度最大，柱效最高，对称性 较好且一致。在以下的实验中，流动相中正己烷和异丙醇的配比选用9 5 ：5 。 表2 流动相配比改变对分离指标的影响 流动相配比( 正己 塔板数分离度拖尾因子 烷：异丙醇) 8 5 ：1 5s - 1 1 1 4 52 5 7s - o 8 7 4 0 r - 9 2 4 7r - o 7 9 6 9 9 0 ：1 0s - 7 0 6 52 1 3s 一1 0 2 5 6 r - 4 9 3 7r - o 9 7 3 6 9 5 ：58 - 1 8 5 2 64 7 3s 一1 1 4 2 1 r - 1 8 2 6 6r 一1 1 4 5 3 条件：流动相中二乙胺浓度：0 2 ；流速：0 5 m l m i ns 浓度：0 5 m g m l ；柱温： 2 5 2 1 3 流动相流速变化 采用混旋的氯吡格雷工作标准品，用异丙醇配成0 5 m g m 1 的测试样品，改 变流动相流速，考察分离指标的影响( 见表3 ) ，从实验结果看流动相流速为 0 5 m l m i n 时对称性较好且一致。在以下的实验中，流动相中流速选用 0 5 m l m i n 。 表3 流动相流速改变对分离指标的影响 流动相流速塔板数分离度拖尾因子 0 4 m l m i ns 一2 0 9 0 4 5 4 5s 一1 1 0 2 0 r 一2 0 9 4 3 r - 1 - 1 2 0 6 0 5 m l m i n s - 1 8 5 2 64 7 3s - 1 1 4 2 1 r - 1 8 2 6 6 r - 1 1 4 5 3 1 4 0 6 m l m i n s - 1 9 1 9 55 1 6s - i 1 0 2 1 r - 1 9 0 8 2r 一1 1 1 7 7 0 7 m l m i ns - 1 7 9