（微生物学专业论文）fta滤膜用于基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的研究.pdf

摘要 通过不对称p c r 技术和基因芯片技术建立了一种准确 快速和高敏感性的检测肉 中常见食源性致病菌的方法 用f t a 滤膜从食品样品中直接提取模板d n a 用玻片作 基因芯片的固相载体 选择常见的引起食物中毒的1 5 株菌的1 6 s r d n a 基因的一个片 段作为目的基因 设计这段基因的一对通用引物 下游引物用c y 5 标记 对两轮不对 称p c r 反应体系中退火温度 m 9 2 浓度进行了优化 以确定适宜p c r 反应体系和p c r 扩增程序 第一轮适宜反应体系分别为 5 u l 的1 0 p c rb u f f e r 0 5 u l 的2 0 m m o l l d n t p 引物f 1 r 2 各1 u l 2 5 u m o l l o 5 u l 的t a q 酶 2 5 u 含有基因组d n a 模板的 滤膜 用去离子水补足到5 0u l 循环的条件为 9 4 变性5 m i n 从9 4 变性3 0 s 5 8 8 退火1m i n 到7 2 延伸3 0 s 共2 5 个循环 最后7 2 延伸5m i n 第二轮适宜反应体 系为 5 u l 的1 0 p c rb u f f e r 0 5 u l 的2 0m m o l ld n t p 引物r 2l u l 2 5 u m o l l 0 5 u l 的t a q 酶 2 5 u 第一轮的p c r 产物1 5 u l 用去离子水补足至l j 5 0 u l 循环的条件为 9 4 变性5m i n 从9 4 变性3 0 s 5 5 6 退火3 0 s 至u 7 2 延 f 3 0 s 共3 0 个循环 最后7 2 延伸5 r a i n 设计二十五条种属的特异性探针 将它们氨基化修饰并点到玻片上 将 不对称p c r 的1 5 种扩增产物与制作好的基因芯片杂交 用g e n e p i x 4 对杂交结果进行分 析 结果表明1 0 株食源性致病菌 金黄色葡萄球菌 肉毒梭状芽孢杆菌 产气荚膜梭 菌 宋内氏志贺氏菌 霍乱弧菌 普通变形杆菌 拟态弧菌 单核增生李斯特菌 小 肠结肠炎耶尔森氏菌 腊样芽孢杆菌 的检测具有高敏感性和特异性 副溶血性弧 菌的敏感性相对较低 河流弧菌同副溶血性弧菌存在很弱的错杂交 乙型溶血性链球 菌的检测同单核增生李斯特菌和腊样芽孢杆菌存在很弱的错杂交 但是均不影响检测 结果 大肠杆菌0 1 5 7 h 7 和沙门氏菌由于同源性非常高 可以通过多重p c r 方法检测 出来 整个样品的检测过程耗时6 h 本方法检测灵敏度是1 0 2 c f u m l 针对在线b l a s t 的不足 建立了1 6 s r d n a 基因核苷酸序列本地数据库 并在此 基础上进行寡核苷酸探针的本地b l a s t 以确保其特异性 通过与在线b l a s t 比较 本地b l a s t 在准确性 冗余信息的去除以及使用简便性等方面要优于在线b l a s t 基因芯片相比较其它检测方法有很大的优势 它不仅准确 快速 高效 而且高 通量 可广泛应用于食源性致病菌感染的诊断 应对和控制 关键词 基因芯片 不对称p c r 检测 肉 致病菌 f t a 滤膜 s t u d yo nd n am i c r o a r r a yd e t e c t i o no fc o m m o nf o o d b o r n ep a t h o g e ni nm e a ts a m p l e u s i n gf t af i l t e r i n gt e c h n i q u e a u t h o r z h o uw e i m a j o r p r i m a r yp r o d u c tp r o c e s s i n ga n ds t o r a g ee n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r z h a n gw e ip r o f e s s o r a b s t r a c t aa c c u r a t e r a p i d a n ds e n s i t i v em e t h o df o rd e t e c t i o nf o rc o m m o nf o o d b o r n e p a t h o g e n i ci nf o o ds a m p l e s w a se s t a b l i s h e db yu s i n ga s y p c ra n dd n a m i c r o a r r a y t e c h n o l o g y f t af i l t e rw a su s e da st e m p l a t ep r e p a r a t i o nf o ra s y p c r g l a s sw a su s e da s t h ea r r a y s u p p o r t am u t a t i o nr e g i o n o ft h e16 s r d n ag e n ew a ss e l e c t e da st h e d i s c r i m i n a t i o nt a r g e tf r o m15s p e c i e so fb a c t e r i ac a u s i n gf o o d b o r n ei n f e c t i o n s ap a i ro f u n i v e r s a ip r i m e r sw a sd e s i g n e df o ra s y p c ra m p l i f i c a t i o no ft h e16 s r d n ag e n e t h e b a c k w a r dp r i m e rw a sl a b e l e db yc y 5 t h ep c r s y s t e mw a so p t i m i z e di n c l u d i n ga n n e a l i n g t e m p e r a t u r ea n dt h eq u a n t i t i e so ft h em g 计 t h ef i r s tr e a c t i o nm i x t u r ec o n s i s t e do f5 u ll0 p c rb u 舭r 0 5 u l2 0 m m o l ld n t p l u lo fp r i m e rf 1 r 2 2 5 u m o l l 0 5 u lt a q 2 5 u t a k a r a f t af i l t e r i n g 4 2 i t lo fd o u b l e d i s t i l l e dw a t e r t h ew h o l es y s t e mw a s 5 0 l t h er e a c t i o nw a s r u nu n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s d n ap r e d e n a t u r a t i o na t9 4 f o r5m i n d n ad e n a t u r a t i o na t9 4 f o r3 0s p r i m e ra n n e a l i n ga t5 8 8 f o r1 m i n e x t e n s i o na t7 2 f o r3 0 s f o r2 5c y c l e s a n de x t e n s i o na t7 2 f o r5 m i n t h es e c o n d r e a c t i o nm i x t u r ec o n s i s t e do f5 u l10xp c rb u 虢r 0 5 u l2 0 m m o l l i n t p 1u lo fp r i m e r r 2 2 5 u m o l l 0 5 u lt a q 2 5 u t a k a r a 1 5 u lp r o d u c to ft h ef i r s tp c rr e a c t i o n 4 3 p lo fd o u b l e d i s t i l l e dw a t e r t h ew h o l es y s t e mw a s5 0 9 l 刀 er e a c t i o nw a sr u nu n d e r t h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s d n ap r e d e n a t u r a t i o na t9 4 f o r5m i n d n ad e n a t u r a t i o na t 9 4 f o r3 0s p r i m e ra n n e a l i n ga t5 5 6 f o rl m i n e x t e n s i o na t7 2 f o r3 0 s f o r2 5c y c l e s a n de x t e n s i o na t7 2 f o r5 m i n t w e n t y f i v es p e c i e s g e n e r a s p e c i f i co l i g o n u c l e o t i d e d e t e c t i o np r o b e sw e r es y n t h e s i z e da n ds p o r e do n t ot h e g l a s s t h e i6 s r d n ag e n e a m p l i f i c a t i o np r o d u c t so f15s p e c i e so fp a t h o g e n i cb a c t e r i a w e r eh y b r i d i z e dt ot h e o l i g o n u c l e o t i d ea r r a y h y b r i d i z a t i o nr e s u l t sw e r ea n a l y z e dw i t hg e n e p i x 4 r e s u l t si n d i c a t et h a tt e ns p e c i e so fp a t h o g e n i cb a c t e r i a s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s c l o s t r i d i u mb o t u l i n u m c l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n s s h i g e 砌s o n n e i h b r i oc h o l e r a e p r o t e u s v u l g a r i s h b r i om i m i c u s l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a b a c i l l u sc e r e u s s h o w h i g hs e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y f o rt h e o l i g o n u c l e o t i d ea r r a y f i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u ss h o w e dl o ws e n s i t i v i t yf o rt h eo l i g o n u c l e o t i d ea r r a y 所打i of l u v i a l i s g a v ew e a kc r o s s r e a c t i o nw i t h 打i op a r a h a e m o l y t i c u s s t r e p t o c o c c u sh e m o l y t i c bg a v e w e a kc r o s s r e a c t i o nw i t h 三i s t e r i am o n o c y t o g e n e sa n db a c i l l u sc e r e u s b u tt h er e a c t i o nd i d n o ta f f e c tt h e i rd e t e c t i o n t h e r ei sh i g hi d e n t i t yb e t w e e ne s c h e r i c h i ac o l i0 15 7 h 7 a n d s a l m o n e l l a t h e yc a nb ed e t e c t e dt h r o u g hm u l t i p l e xp c r t h ep r o c e s so ft h ed e t e c t i o n t o o ks i xh o u r sf r o mt e m p l a t ep r e p a r a t i o nt ot h er e s u l to b t a i n e d t h es e n s i t i v i t yo ft h e s t u d yw a s10 c f u m l t oo v e r c o m et h es h o r t a g e so fo n 1 i n eb l a st t h el o c a ln u c l e o t i d ed a t a b a s eo fc r y g e n e sf r o mb tw a se s t a b l i s h e d a n dl o c a lb l a s tw a sr u nb a s e do ni tt oe n s u r et h e b yc o m p a r i n gl o c a lb l a s t w i t h r e d u n d a n ta n dc o n v e n i e n c ew e r e k e y w r d s d n a m i c r o a r r a y a s y p c r d e t e c t i o n m e a t p a t h g e n f t a f i l t e r r a p i d i t y 暇鸥黜 北佗 以钒唑 毗 v 甜毗 s s m 骼 萨唱 叫啪出甜 l 硒a 时砒m 堇 咿泔 眦 i 骶缸阻 置 硫眦 的怒 州dl 鼋叫砌兰 呼 l 以弘 勰缸渤 b m m 蒜驰 m 言i 肌鬣 曲 撒 f t a 滤膜用于基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的研究 4 5 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其它人已经 发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得塑皇堡盛些盘堂或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 触 签字日期 m 而髟年多7 月f p 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垒盔些盘堂有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借 阅 本人授权塑皇垦盛些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 同捣 导师签名 谌德 签字日期 伽拶年乡月l 日 签字日期 年月 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 f t a 滤膜用于基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的研究 第一章引言 1 食品中致病菌及其常规检测技术 1 1 食源性致病菌危害的严重性 随着食品安全问题的愈来愈被重视 由细菌导致的食源性疾病成为了人们关注的焦点 食 品安全性问题己被世界上大多数国家重视起来 各国都采取了相应的措施控制和检测食源性致 病菌 并以立法的形式来确保食品安全 近年来 在世界范围内食品安全方面的恶性 突发性 事件屡屡发生 继大规模发生于日本 欧洲 美国的大肠杆菌0 1 5 7 h 7 食物中毒后 欧洲和日 本又出现了牛海绵状脑病 b s e 俗称疯牛病 法国出现了李斯特氏菌的疾病幢1 香港出现了禽 流感 比利时出现了二嗯英 以及具有多重抗药性的鼠伤寒沙门氏菌在多国的流行等啼1 其中 有的引起大量急性发病乃至死亡 据不完全统计 1 9 9 9 年美国暴发了由冰激凌污染造成的沙门 氏菌疾病估计有2 2 4 0 0 人患病 2 0 0 0 年全球有2 1 0 万人死于腹泻 大部分归因于食物和饮用水 中致病菌的污染 全球每年约有1 4 0 0 0 例志贺氏菌病 估计发病人数达3 0 万 1 9 7 6 年在美 国纽约暴发过一起耶尔森氏菌导致的疾病 有2 1 7 名学生感染 据f d a 统计 1 9 9 7 年美国加州 等5 个州食源性疾病共为8 0 5 1 例 其中志贺氏菌引起的为1 2 6 3 例 自从1 8 1 7 年至今 在南亚 地区 霍乱弧菌引起的食源性疾病大暴发己达七次 工业化国家每年患食源性疾病者高达3 0 例如 美国每年约有7 6 0 0 万例食源性致病菌所导致的疾病 其中有3 2 5 0 0 人住院治疗 5 0 0 0 人死亡 包括我国境内的江苏 浙江 安徽 山东等地在内暴发的大肠杆菌0 1 5 7 h 7 食物中毒 至今也导致近万人发病嵋 2 0 0 1 年1 月7 日 法国卫生部宣布 由于受到单核细胞增生李斯特 氏菌的污染 法国已有9 名食用受污染肉制品的消费者发病 其中两名死亡 其他人昏迷不醒 m 而且据世界卫生组织 w h o 统计报告表明 食源性疾病的实际发病率要比报告的病例数多 3 0 0 一5 0 0 倍 全世界的患病者以达数亿 并且每年的统计数值都居高不下 消耗了人量的人力 和物力 在美国 由7 种特定的食源性致病菌引起的疾病花费和生产损失每年高达3 5 0 亿美元 沙门氏菌 特别是对几种抗生素有耐药性的伤寒沙门氏菌的感染人群1 3 以上需要住院治疗 约3 的病例死亡 1 1 9 9 1 年秘鲁出现的霍乱弧菌污染 导致鱼和鱼产品年出口损失达5 亿美元 陋1 细菌污染造成的食源性疾病 食物中毒 也仍是我国食品安全中最突出的问题 在我国 食 源性致病菌如大肠杆菌0 1 5 7 h 7 志贺氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌 副溶血 性弧菌 耶尔森氏菌 创伤弧菌等被公认为主要的食源性致病菌 据卫生部统计 2 0 0 0 年共收 到重大食物中毒报告达1 5 0 起 中毒6 2 3 7 人 死亡1 3 5 人旧 2 0 0 1 年共发生重大食物中毒事 件1 8 5 起 1 5 7 1 5 人中毒 1 4 6 人死亡 引 这些由于各种因素导致的食源性疾病影响的国家范 围之广 危急健康人群之多都是其他原因引起疾病所不及的 而且还给国家之间相关的食品贸 易带来危机 这使得食品安全问题受到了空前的关注 这些事实也可以充分说明尽管现代科技 已经发展到了相当高的水平 但食源性致病菌导致的疾病不论在发达国家还是在发展中国家 都没有很好的被控制 仍然危害着人民的健康 食品安全问题面临着严峻的挑战 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 1 2 部分常见的食源性致病菌 目前 常见的食源性致病菌很多 下面就本研究涉及到的部分致病菌进行简单的介绍 志贺氏菌属于志贺氏菌属 其形态与一般肠道杆菌无明显区别 为革兰氏阴性杆菌 不形 成芽抱 无英膜 无鞭毛 有菌毛 主要分为福氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌 人和灵长类是志 贺氏菌的适宜寄主 营养不良的幼儿 老人及免疫缺陷者更易感染 志贺氏菌主要是经过水和 食物传播 只需少量病菌 至少1 0 个细菌 进入体内 就可引起细菌性痢疾 严重时可导致毒血 症 1 金黄色葡萄球菌是葡萄球菌中毒力最强的细菌 广泛分布于空气 土壤 水及食具 人和 动物具有较高的带菌率 健康人的咽喉 鼻腔 皮肤 头发等常带有产肠毒素的菌株 故易于 经手或空气污染食品u 典型的金黄色葡萄球菌为球型 直径0 8 u m 左右 显微镜下排列成葡 萄球串状 无芽抱及鞭毛 大多数无荚膜 革兰氏染色阳性 平板菌落后 有光泽 圆形凸起 直径1 2 r a m 左右 刳 金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素 分为a b c d e 及f 五种血清型 它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻 单核细胞增生李斯特氏菌 以下简称单增李氏菌 属 t 李斯特氏菌属 致病菌株的血清型一 般根据菌体 0 分为1 z b 1 z e 3 a 3 b 3 e 4 a 5 1 z a 和4 b 后两型尤多 是一种人畜 共患病的病原菌 它能引起人畜李氏菌病 感染后主要表现为败血症 脑膜炎和单核细胞增多 它广泛存在于自然界中 该菌在4 的环境中仍然可以生长繁殖 是冷藏食品威胁人类健康的 主要病原菌之一 沙门氏菌属于肠杆菌科 嗜温性细菌 在常温 中性h p 低盐和高水活度条件下生长最佳 在伯杰细菌分类手册 第8 版 中对该属细菌作如下描述 革兰氏阴性直杆菌 大小0 7 一1 5 x 2 0 5 o u m 扪 沙门氏菌属含有许多种 主要分为肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌等 沙门氏 菌病潜伏期一般6 h 7 2 h 主要症状为恶心 呕吐 腹绞痛 腹泻 发热寒颤 头痛 病程一般 1 2 天或者更长 感染剂量为1 5 2 0 个菌 死亡率达1 4 最易感人群是年幼儿童 虚弱者 年长老人 免疫缺陷者等 引 耶尔森氏菌属包括1 1 个种 其中小肠耶尔森氏菌和与它关系十分密切的3 个同源群被作为 耶尔森氏菌 该菌为革兰氏 钟胜杆菌或球杆菌 大小为 卜3 5 u m 0 5 1 3 t j m 多单个散在 无荚膜 不形成芽袍 有周鞭毛 在3 0 以下有动力 而3 5 以上则无动力 该菌分布很广 猪的带菌率较高 日本报告检出率为4 加拿大为3 6 丹麦为1 0 一1 7 是导致肠胃炎的 土要病原菌 副溶血性弧菌属于弧菌属中致病菌之一 是近2 0 年才被发现和重视的 其土要污染的食品 有鱼类和贝类 尤其在夏秋季节的沿海地区常会出现含有副溶血性弧菌的海产品引起的暴发性 食物中毒 主要能引起胃肠炎 常出现恶心 腹泻 腹部痉挛 呕吐 头痛等症状 空肠弯曲菌属于弯曲菌属 是7 0 年代命名的一群革兰氏阴性微需氧菌 螺旋形 弯曲杆状 大小为 0 2 0 8 u m x 0 5 5 u l l l 有一个以上螺旋可长达8 u m 也可出现s 形或似飞翔的海鸥 形 菌体一端或二端有单根鞭毛 长度约为菌体的2 3 倍 有活泼的动力或不产生动力 该菌 感染称为弯曲杆菌病 可引起腹泻 是人类急性胃肠炎的常见病的致病菌u 制 肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 h 7 是1 9 8 2 年美国疾病控制中心和预防中心 c d c 在对密西根州和 2 f t a 滤膜用于基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的研究 俄勒冈州因食用汉堡包快餐而暴发的两宗溶血性腹泻进行流行病学调查时分离出来的 该菌具 有菌体抗原 o 抗原 和鞭毛抗原h 抗原 1 6 1 故称肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 h 7 该菌属于肠杆科 埃希氏菌属 革兰氏阴性 无芽抱 有鞭毛 可产生大量的v e r o 毒素 v t 是主要的致病因子 肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 h 7 感染剂最低 潜伏期为3 1 0 天 病程2 9 天 通常是突然发生剧烈 腹痛和水样腹泻 数天后出现出血性腹泻 部分患者可发展为h u s t t p 等 严重者可导致死亡 传播途径为牛肉 生奶 鸡肉及其制品和蔬菜等 牛肉为主要的传播载体n 美国和加拿大的 研究显示 肠出血性人肠杆菌0 1 5 7 h 7 感染致病比志贺氏菌更普遍 7 1 8 1 据资料显示 美国每年 约有2 0 0 0 0 入染上肠出血性大肠杆菌 引 霍乱弧菌在伯杰细菌分类手册 第8 版 中作如卜描述 该菌属革兰氏阴性 兼性厌氧杆菌 弧菌科 弧菌属中的一种 霍乱弧菌导致的疾病称为霍乱 是流传时间长 影响范围广的一种 食源性疾病 由于该菌在繁殖过程中产生霍乱肠毒素 系外毒素 它促使肠黏膜细胞大量分泌 肠液 导致严重呕吐 腹泻 严重时出现脱水 腹部痉挛甚至死亡u 引 1 3 食源性致病菌检测技术应用的现状 目前在实际的检验检疫工作中常用于检测和鉴定食源性致病菌的方法土要有p c r s o u t h e r nb l o t 杂交 酶联免疫i 吸附法 e l i s a 等一些简单的分子生物学和免疫学方法 质检 总局动植物检疫研究所的朱水芳等运用p c r e l i s a 亲和诱扑方法检测击番茄环斑病毒啪 青岛 局的寇运同等用p c r 技术检测食品中的单增李氏菌曙 上海局的韩伟等运用p c r 和v i d a s 的方 法检测食品中的弯曲菌属心到 覃文等运用v i a d s 法和a p il i s t e r i a 法对食品中李斯特菌进行 检测和分类乜驯 曹泽虹等用p c r 法检测肠出血性人肠杆菌0 1 5 7 h 7 沙门氏菌 肠炎弧菌 金 黄色葡萄球菌乜扪 w i l l i a mp c e ta l 运用d n a 探针杂交法检测食品中的沙门氏菌皿5 2 6 1 t o r t o r a g j 等运用细胞计量术对牛奶中的单核增生李斯特氏菌进行检测 晗 2 引周帼萍等用基因重组方 法对志贺氏菌进行检测心引 白薇等运用p c r r d b 方法以1 6 s r d n a 为引物检测空肠弯曲菌和沙门 氏菌 1 谢晓红等运用p c r 技术检测食品中的副溶血性弧菌啪1 此外有报道称细菌的检测和鉴 定还有使用物理和化学的方法 如电阻抗测量法 放射测量法 生物发光法 直接外荧光过滤 技术和色谱的方法 1 4 上述的检测技术应用的不足 我国目前对于食源性疾病的病原菌检测 鉴定手段仍停留在培养 血清和生化水平 检测 的周期相当长 一般达到7 1 0 天 有些难培养的致病菌如单增李氏菌的检测流程要达到2 0 天 左右 在相当大的程度上限制了对食源性疾病病源食品的快速检测鉴定能力 并且在判断是否 为阳性时只靠实验人员的肉眼观察 没有足够可靠的依据 降低实验结果 运用寡核普酸芯片 技未鉴定检侧食源性致病菌技术的研究的准确性 一些简单的分子生物学的方法如p c r 和e l i s a 都有较高的假阳性结果出现 并且运用p c r 和e l i s a 得出的结果都不能作为最终的检测依据 目前丹麦 澳人利亚等一些欧洲和澳洲国家食源性病原菌的检测结果综合了实时荧光p c r 和 e l i s a 两种技术在d n a 和蛋白质两种水平上检测的结果砌了判断 并且实验操作只有1 h 左右 3 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 因此我国有必要建立起食源性致病菌的高通量 快速 准确的监测体系 以确保在相对较短的 时间内正确判定食品的安全性 这是有效地预防和控制食源性疾病的重要前提 只有这样才能 在一定程度上提前消除由于食品中的致病菌所造成的危害 提高我国食源性疾病的检测和控制 能力 2 基因芯片技术及其应用 2 1 芯片技术简介 随着人类基因组计划的完成 人类3 0 亿对碱基的序列的获得 人类基因组计划也由此进 入后基因组时代 研究的重点也由发现基因转向发现基因的功能 人们将逐步阐明从基因到蛋 白再到生命现象这一过程的奥秘 如何大规模研究人类约l o 万条基因的功能 特别是基因相互 作用和调控关系 迫切需要一种新的方法能以大规模 高通量的方式进行表达模式的研究 传 统的n o r t h e r nb l o t 或点杂交方法 及以电泳为基础的基因表达 序列测定 突变和多态性分析 等研究方法显然不能适应上述的要求 基因芯片技术应运而生 基因芯片的概念来自计算机芯片 至今不过几年时间 但发展迅速 迄今已有近百家公司 从事生物芯片相关工艺 检测手段及软件的开发 基因芯片 d n ac h i p g e n ec h i p d n a m i c r o a r r a y 像计算机上的微处理器一样 能快速地解读遗传基因的碱基排列 使瞬间破译碱 基序列成为现实 基因芯片实质是一种高密度的核酸阵列 将大量特定序列的d n a 片段 探针 如基因 p c r 产物 人工合成的寡核苷酸等有序地 高密度地 点与点之间的距离一般小于5 0 0 i lm 同定在玻片或硅片等载体表面 形成储存有大量信息的高密度d n a 微阵列 将待测样品 用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交 杂交信号用激光扫描仪检测 计算机分析检测结果 可获得类似于传统的点杂交 d o tb l o th y b r i d i z a t i o n 等的分子杂交数据 比较各组间靶基因信 号的差异 以达到快速 高效 高通量及平行性地分析生物信息的目的 目前基因芯片现已广 泛地用于基因功能研究 药物筛选 疾病诊断 突变体与多态性研究 d n a 测序等诸多方面p 卜那j 基因芯片按照应用范围的不同可以分为表达谱芯片和检测芯片 其中检测芯片又分为生物 群落鉴定芯片 种类鉴定芯片 功能基因检测芯片等 按照固定探针来源的不同 可以分为p c r 产物芯片和寡核苷酸芯片 表l 显示了这几种芯片的区别 寡核苷酸芯片的制备方法较多 但 基本上可分为两大类 一类是原位合成 i ns i t us y n t h e s i s 代表技术有a f f y m e t r i x 公司开发的光 控合成 1 i g h t d i r e c t e ds y n t h e s i s 它是利用固相化学 光敏保护基 p h o t o l i a b i l ep r o t e c t i n gg r o u p s 及光刻技术 p h o t o l i t h o g r a p h y 在硅片上制备位置确定 高度多样性的寡核苷酸探针 是目前制 造高密度寡核苷酸芯片较为成功的方法 3 4 3 5 l 另一类是合成后交联 p o s t s y n t h e t i ca t t a c h m e n t 法 代表性的有s t a n f o r d 大学开发的点样技术 这种方法适用于高 中 低密度寡核苷酸芯片 的制作 3 6 1 4 f t a 滤膜用于基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的研究 表lp c r 产物芯片 寡核苷酸芯片和基因组芯片的比较 t a b l e1 t h ec o m p a r i s o no f p c rp r o d u c tm i c r o a r r a y o l i g o n u c l e o t i d em i c r o a r r a ya n dg c n o m em i c r o a r r a y 2 2 基因芯片技术的技术难点 尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展 得到人们的瞩目 但仍存在不足l j 一个最大 的潜在的问题是在杂交中探针与目标d n a 接触的问题 3 8 目前不清楚在杂交中探针可以多大 程度地与目标d n a 接触 因为芯片上的杂交不是简单的液相反应 在液相中d n a 之间可充分 接触 这一点将依赖于目标d n a 和探针的d n a 序列以及d n a 链内的二级和三级结构 因此 特定类型的芯片的杂交特性 特异性 灵敏度和定量特性 都依赖于实验确定 目前主要存在的问题主要表现在样品的制备 探针合成与固定 分子的标记 数据的读取 与分析等几个方面 2 2 1 样品制备 当前 在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高检测的灵敏度 或者直接 以p c r 扩增产物为探针进行检测 但这两种方法在特异性与灵敏度上无法实现统一 2 2 2 探针的合成与固定 探针的合成与固定比较复杂 特别是对于制作高密度的探针阵列 使用光导聚合技术每步 产率不高 9 5 难于保证好的聚合效果 应运而生的其它方法 如压电打压 微量喷涂等多 项技术 虽然技术难度较低 方法也比较灵活 但问题是难以形成高密度的探针阵列 所以只 能在较小规模上使用 最近我国学者已成功地将分子印章技术应用探针的原位合成而且取得了 比较满意的结果 2 2 3 目标分子的标记 目标分子的标记也是一个关键步骤 目标分子与探针的杂交会出现一些问题 首先 由于 5 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 杂交位于固相表面 所以有一定程度的空间阻碍作用 有必要设法减少这种不利因素的影响 其次 探针分子的g c 含量 长度以及浓度等都会对杂交产生一定的影响 另外不同标记方法 适合于不同的杂交反应 标记效率也有所不同 这些都需要在具体研究中进行实验确定 2 2 4 信号的获取与分析 当前多数方法使用荧光法进行检测和分析 重复性较好 但灵敏度不高 正在发展的方法 有多种 如质谱法 化学发光法等 基因芯片上成千上万的寡核苷酸探针由于序列本身有一定 程度的重叠因而产生了大量的丰余信息 这一方面可以为样品的检测提供大量的验证机会 但 同时 要对如此大量的信息进行解读 目前仍是一个艰巨的技术问题 2 2 5 灵敏度 提高灵敏度即如何检测低丰度表达基因仍是目前一个重要问题 3 9 j 基因芯片要保证其特 异性 但又要保证能检测低丰度表达的基因 目前尚未解决这一问题 因为许多低丰度表达的 基因 也可能表达出主要执行效应功能的蛋白质 因为基因表达与蛋白质生成并不成比例 由 于在芯片实验中杂交体积较小 因而人们通常认为芯片的灵敏度比传统的建立在膜上的杂交要 高得多 然而建立在玻片上的芯片杂交不仅比p c r 扩增的灵敏度要低1 0 0 到1 0 0 0 0 倍 还比建 立在膜上的杂交低1 0 到1 0 0 倍 4 0 1 建立在玻片上比建立在膜上杂交的灵敏度低的一个主要原 因是玻片上的探针结合效率比膜上的要低的多 为解决这一不足 研究人员在扩大信号方面做 了相关的研究 目前液相反应中较为常用的多重标记技术是值得借鉴的一种有效的信号放大技 术 多重标记技术是通过增加单个分子上标记的荧光分子数目使荧光信号得到增强 用来提高 对特定分子 如抗体 抗原 基因等 的检测灵敏度 例如 分支d n a b r a n c h e dd n a b d n a 探针技术利用多检测位点探针的预放大和b d n a 探针再放大1 4 1j 可以通过化学发光的方法检测 出5 0 0 拷贝h i v 病毒 滚环放大免疫分析法 i m m u n o r c a i m m u n o a s s a y sw i t hr o l l i n gc i r c l e a m p l i f i c a t i o n 通过特异性延长单链d n a 增加检测位点 再与标记探针杂交实现多重标记 能在芯片上检测出l p g m l 的p s a l 4 引 上述问题不仅是当前和今后一段时期内国内外基因芯片技术研究的焦点 同时也是基因芯 片能否从实验室研究推向临床应用的关键问题 2 3 基因芯片技术在微生物检测中的应用 目前基因芯片被广泛应用于基因表达谱研究的同时 在微生物检测中也扮演着越来越重要 的角色 2 3 1p c r 产物芯片 6 p c r 产物芯片是指以通过p c r 反应获得的产物为探针的芯片 这些p c r 产物包括e s t 表 f t a 滤膜用于基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的研究 达序列标签 c d n a o r f 开放阅读框 1 6 sr r n a 等 由于此类芯片的探针来源于p c r 反 应 因而研究人员可以非常容易地获得所需的探针 又由于作为探针的p c r 产物大小在几百至 2 k b 左右 芯片具有灵敏度高的特点 对于样品的标记也可以使用多种方法 如t a q 酶聚合掺 入法 随机引物法 切刻转移法以及化学标记法等等 由于以上特点 p c r 产物芯片目前已广 泛应用于分子生物学的各项研究中 尤其是在微生物功能基因检测 微生物病原体检测以及微 生物种类的鉴定 基因组差异性检测等方面 4 3 舶l 2 3 1 1 功能基因检测 目前对微生物功能基因的检测方法有许多种 比如建立在p c r 基础之上的e x c i u s i v ep c r r f l p m u l t i p l e xp c r s s c p f o o t p r i n t i n g r e a lt i m er t q p c r 和建立在蛋白质基础之上的 t r y p s i nd i g e s t i o n p u r i f y i n g 等方法能够进行功能基因的检测 但是这些技术并不能满足基因组 时代大规模 平行化 高通量检测功能基因的需求 为此 科学家们研究了应用基因芯片技术 进行微生物功能基因检测等工作并取得了较好的进展 w u2 0 0 1 年构建了一种含有分解性含铁或含铜的亚硝酸还原酶基因 n i r s 和n i r k 铵单 加氧酶基因 a m o a 及在系统进化上与之相联系的甲烷单加氧酶基因 p m o a 基因等1 0 0 个 功能基因的芯片 47 1 这些基因分别是编码细菌反硝化作用 硝化作用 甲烷还原作用等生物过 程的关键酶的基因 他们以通过p c r 反应得到的几百b p 到1 4 k b 的d n a 片段为探针 应用随 机引物法标记染色体d n a 检测了来自土壤 海洋沉积物等自然环境的样品中所含有的上述基 因 并对检测灵敏度 杂交定量以及信号强度的影响因素等进行了研究 j a e2 0 0 2 年以入d n a 为参考基因 定量检测了土壤 沉积物等环境中的n i r s n a h a 和大 肠杆菌的0 a n t i g e n 生物合成等基刚4 引 他们分别将经p c r 反应得到的这几种基因的片段 5 0 0 b p 9 0 0 b p 与入d n a 片段 5 0 0 b p 等量混合溶于点样液中并打印在芯片上 将用随机引 物法c y 5 标记的九d n a 与c y 3 标记的样品d n a 与芯片杂交从而得到信号比 结果发现 在检 测灵敏度以上 信号比的对数值与d n a 浓度比的对数值之间存在着良好的线性关系 2 3 1 2 病原体检测及种类鉴定 如上所述 目前常用的病原微生物检测与鉴定的方法有很多 在临床诊断中也发挥了巨大 的作用 但由于本身各自的缺陷与不足使它们无法简单 快速 灵敏 高通量地检测病原体 更无法测定病原体是否产生耐药性 对哪种抗生素产生耐药性 对哪种抗生素敏感等 而随着 病原微生物基因组计划的进展 微生物检测基因芯片技术就成为能够实现上述目的进行病原体 检测的一种强有力的手段 2 3 1 2 1 病毒检测 l e e2 0 0 3 年设计了一种芯片可以检测和区别四种感染葫芦科植物的t o b a m o v i r u s e s 他们 将这些病毒的外壳蛋白基因克隆到载体中并用通用的引物进行p c r 扩增 把得到的 5 0 0 b p 7 0 0 b p 的产物作为探针点在玻片上制成芯片 同时从植物中提取总r n a 通过反转录进行 7 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 荧光标记 杂交结果显示此芯片较好地检测了葫芦科植物所感染的不同病毒 并且表明杂交信 号强度和探针与靶序列之间的相似程度有关 4 纠 b o o n h a m2 0 0 3 年将病毒的r t p c r 产物克隆到载体中 并用特异性的引物进行扩增从而 产生7 1 l b p 1 2 0 1 b p 的基因片段 以此为探针与经过反转录荧光标记的c d n a 杂交 5 0 i 他们成 功地检测了单一病毒和混合病毒感染的样本并与e l i s a 检测方法比较了检测灵敏度 k a w a g u c h i2 0 0 3 年用了与上述两种相似的方法成功检测了病人血清中的h b v 5 1 2 0 0 1 年 吴海等以h b v h c v 高度保守的基因片段为探针制备乙 丙型肝炎病毒双检基因芯片 5 2 l 检 测时提取患者血清中的病毒核酸进行r t p c r 扩增及荧光标记 检测结果表明 此芯片能有效 检测区分不同的血清 可望用于临床 2 3 1 2 2 细菌检测 b e k a l2 0 0 3 年设计了一种快速检测大肠杆菌病变型的芯片 5 3 1 这个芯片以大肠杆菌的1 0 5 个毒性基因 如h t y p a p s f a a g g 等 的p c r 产物为探针 这些探针大小在1 1 7b p 到2 1 2 1 b p 之间 他们用化学方法将荧光染料c y 3 共价结合到被限制性内切酶消化后待检测的大肠杆菌 基因组d n a 上 杂交结果显示应用此芯片能够快速高效地鉴定大肠杆菌的毒力属性和致病群 并可以对大肠杆菌进行定量和分型 j a e2 0 0 1 年将四种荧光假单胞菌基因组d n a 随机片段化 耜 选取6 0 到9 6 个大小在l 2 k b 的片段连接到载体中 p c r 扩增后将产物作为探针制成芯片 他们用此芯片与用随机引物法进 行荧光标记的待测样品基因组d n a 进行杂交 通过对结果进行聚类分析从而可以鉴定细菌并 测定细菌之间的遗传距离 w u2 0 0 3 年应用p c r 扩增了大肠杆菌的致病性菌株0 1 5 7 h 7 特异性基因 非致病性菌株 k 1 2 的特异性基因以及普通大肠杆菌的基因1 4 7 1 并将这些产物作为探针制成芯片 与经过随机 引物标记的基因组d n a 杂交 结果他们成功地确认了所检测样本的基因型并且证明此芯片还 能检测出菌株的抗菌素抗性 2 0 0 2 年翟俊辉等将2 0 种细菌1 6 sr d n a 用通用引物扩增后与芯片上的探针杂交用以检测 临床常见的感染性细菌并与寡核苷酸探针作了比较 5 5 1 结果发现 基因芯片能够用于细菌的检 测 与寡核苷酸探针相比 p c r 产物探针具有广泛和灵敏的特点 但是交叉反应明显 2 3 1 3 基因组差异性检测 许多亲缘关系比较近的微生物或同种微生物的不同菌株在表型上显示出比较大的差异 获 得所有的微生物基因组序列是了解造成这些不同表型的遗传信息的方法之一 但是 对所有相 近的基因组进行测序既费用昂贵 耗时 而目前利用建立在p c r 基础之上的已知微生物基因组 全o i 强芯片技术可以较好地进行基因组之间的差异性检测 m u r r a y2 0 0 1 年成功地发展了一种检测几种金属还原细菌差异性和相互关系的芯片p 酬 此 芯片以s