（动物学专业论文）日本弓背蚁（大工蚁）脑中5羟色胺能神经元分布的研究.pdf

摘要 本实验采用树脂石蜡 c p 组织包埋切片技术和链霉菌抗生物素 蛋白一过氧化物酶 s p 免疫组织化学方法 研究了5 h t 能神经元在 日本弓背蚁 c a m p o n o t u sj a p o n i c u s 大工蚁脑中的分布情况 并与 g a b a 的分布进行了比较 初步探讨了5 h t 在各个脑区的分布规律 和特点 潞果发现 5 h t 分布很丰富 阳性纤维起源于少量的细胞体 但分布广泛 呈现明显的静脉曲张状 前脑的视叶和中央体阳性反应 最强 染色强度在三个视觉纤维网各不相同 并出现分层现象 视叶 包含三种神经元 无长突神经元 柱状神经元和切向神经元 其中只 有少数被标记 与前脑间的神经通路呈弱阳性反应 中央上体和下体 染色都很深 没有明显的差别 k e n y o n 细胞未被标记 在前脑后侧 靠近蕈形体冠的下方 有对称分布的两组大的抗原细胞 在食道孔上 方形成许多纤维束并且分枝向侧前脑 前脑下方扩展 形成大量的阳 性纤维 蕈形体的冠 柄都呈阳性反应 柄染色比冠深 n 叶染色比 b 叶深 靠近每个n 叶的内侧 有2 3 束较粗的5 一h t 阳性纤维 染 色较深 围成环状 嗅觉纤维球呈阳性反应 染色均匀 其中含有一 些阳性纤维 仅有一对神经元被标记 粗大的内触角脑通路和外触角 脑通路染色较浅 仅细小的中触角脑通路呈阳性反应 在食道下神经 节的周围 有十几个较大的5 h t 阳性神经元 在食道下神经节形成3 条粗大的阳性纤维 由它们发出无数细小的分枝 呈静脉曲张状 分 布于整个咽下神经节 一 结果表明 5 h t 是日本弓背蚁脑中一种重要的神经递质 主要参 与感觉 运动系统的调节及学习 记忆的调控 5 h t 阳性纤维起源于 相对少量的神经元 但在整个脑中分布广泛 因此5 h t 主要是在大面 积神经丛区域参与远距离的调节活动 本实验结果和分析为日本弓背蚁学习记忆和行为学的研究提供了 理论依据 并且为神经生物学的发展积累了基础资料 关键词 日本弓背蚁 脑 5 羟色胺 免疫组织化学 a b s t r a c t 5 h t i m m u n o r e a c t i v en e u r o n si nt h eb r a i no fc a m p o n o t u s j a p o n i c u s b i g w o r k e ra n t w e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n gc o l o p h o n y p a r a f f i n c p e m b e d d i n g t i s s u es e c t i o n t e c h n i q u e a n di m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t r e p t a l i d i n p e r o x i d a s e s p m e t h o d t h ei m r n u n o r e a c t i v i t yo f5 h tw e r e c o m p a r e d w i t hg a b aa n dt h ec h a r a c t e ro f5 h td i s t r i b u t i o nw a s d i s c u s s e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t5 h ti m m u n o r e a c t i v e p r o c e s s e s o r i g i n a t e df r o mar e l a t i v e l ys m a l ln u m b e ro f c e l lb o d i e sb u te a c hn e u r o n h a dp r o c e s s e so v e ral a r g ev o l u m eo ft h en e u r o p i lo ft h eb r a i n t h eo p t i c l o b sa n dt h ec e n t r a lb o d ya r es t a i n e dm o s td e e p l y a l ln e u r o p i lr e g i o n so f o p t i c 1 0 b e t h el u m i n a m e d u l l aa n d l o b u l a c o n t a i n e d5 一h t i m m u n o r e a c t i v ev a r i c o s ef i b e r s w h i c hw e r ed i s t i n c ti nm o r p h 0 1 0 9 ya n d d e g r e eo fs t a i n i n g t h e s ea l ls h o w e dp r o n o u n c e ds t r a t i f i c a t i o n t h e r ew e r e t h r e ek i n d so fn e u r o n sr e l a t e dt ot h eo p t i cl o b e s a m a c r i n ec e l l s c o l u m n a r n e u r o n sa n dt a n g e n t i a ln e u r o n s o n l yaf e wo fw h i c hw e r es t a i n e d 1 1 1 e l a b e l i n g o ft h ec e n t r a l b o d y w a sd e e p l y a n dt h e r ew a sn oo b v i o u s d i f f e r e n c ei nt h es t a i n i n gd e 掣e eb e t w e e nu p p e rc e n t r a lb o d ya n dl o w e r c e n t r a l b o d y k e n y o n c e l l sw e r en o tl a b e l e d i nt h eb a c k o ft h e p r o t o c e r e b r u m t h e r ew e r et w o 母 o u p s a b o u t2 0 o fl a r g ep o s i t i v en e u r o n s w h o s ea x o n sr a ni nb u n d l e s s o m et h i nb r a n c h e so fw h i c hi n v a d eal a r g e a r e ao ft h e p r o t o c e r e b r u m t h e m u s h r o o mb o d i e ss h o w e d5 h t i m m u n o r e a c t i v i t y w h o s ec o m p o n e n t sw e r ed i s t i n c ti nt h ed e g r e eo ft h e s t a i n i n g t h es t a i n i n g o ft h e c a l y c e s w e r e l i g h t e r t h a nt h a to ft h e p e d u n c u l u sa n d a l o b e sw e r ed e e p e rt h a nt h a n1 3 一l o b e s m o s to f t h e5 h tf i b e r so ft h e q l o b e sa p p a r e n t l yw e r em a i nb r a n c h e so ft h i c k f i b e r sw h i c hs u r r o u n d e dt h ea l o b e s a l lo l f a c t o r yg l o m e m l iw e r el a b e l e d a n d m a n y 5 h ti m m u n o r e a e t i v ev a r i c o s ef i b e r ss c a t t e r e dw i t h i nt h ec e n t e r r e g i o no ft h eo l f a c t o r yl o b e o n l yo n ep a i ro fn e u r o n sw e r el a b e l e di n i i i a n t e n n a ll o b e s n ea n t e n n a l c e r e b r a lt r a c t sa r es t a i n e dl i g h t e x c e p tf o rt h e m i d d l ea n t e r m a l c e r e b r a l t r a c tw h i c hs h o w e do b v i o u s5 h t i m m u n o r e a c t i v i t y o nt h ee d g eo ft h es u b o s o p h a g e a la b o u t 1 0n e u r o n s w h o s ef i b e r sf o r m e d3t h i c kb u n d l e sw e r el a b e l e d a n dt h ef i b e r sd i s 埘b u t e e x t e n s i v l yi nt h es u b o s o p h a g e a l t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t5 h ti sa 1 1 i m p o r t a n tn e u r n t r a n s m i t t e ri nt h e b r a i no fc a m p o n o t u s j a p o n i c u s 5 h tp l a y sar o l ei nm e d i a t i n gs e n s o r y s y s t e m l e a r na n dm e m o r ys y s t e m t h ea c t i v i t i e so f m o t o rs y s t e ma sw e l l 5 h ti si m p o r t a n ti nm e d i a t i n gd i s t a n tn e u r a li n t e r a c t i o n s t h e s er e s u l t sa n d a n a l y s e s o f f e r e da c a d e m i cf o u n d a t i o nt ot h e r e s e a r c hc o n c e r n i n gl e a r na n da c c u m u l a t e ds c i e n t i f i ci n f o r m a t i o nf o rt h e d e v e l o p m e n to f n e t t r o b i o l o g y k e yw o r d s c a m p o n o t u s j a p o n i c u s b r a i n5 h t i m m u n o h i s t o c h e r m i s t r y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方 外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为 获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意 学位论文作者签名 日期 呜 乒眵 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留 使用学位论文 的规定 即 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可 以采用影印 缩印或其它复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 日期 指导教师签名 日 期 1 前言 2 1 世纪是生命科学的世纪 而神经科学则是2 l 世纪的一颗璀璨 的明星 对动物神经系统的结构和生理功能的研究一直是人们关注的 热点 人脑是生物进化的最高级形式 研究和揭示人脑的奥秘是人类 迄今为止面临的最艰巨的挑战 也是最有意义的科学课题之一 对神 经系统结构 功能和生理机制的研究 长期以来人们主要集中在高等 动物 然而以昆虫为材料研究神经系统的基础理论问题 既经济 材 料易得 便于操作 神经结构集中 又利于实验观察 因此昆虫是 神经生物学基础理论研究的优秀生物模型 蚂蚁是世界上三大 社会性昆虫 之一 属节肢动物门 昆虫纲 膜翅目 蚁科 它们是群居性 完全变态 昆虫 有明显的社会分工 分为 雌蚁 雄蚁 兵蚁和工蚁 分工明确 各负其责 相互依存 雌蚁又称蚁后 发育完全 主要任务是产卵 繁殖后代 雄蚁又称蚁 王 主要任务是与雌蚁交配 工蚁是生殖系统发育不完全的雌蚁 专 门负责筑巢 饲育幼蚁 侍奉蚁后等 分大型工蚁和小型工蚁 兵蚁 为不育的雌性 上颚发达 头较大 其职能是保卫整个蚁群安全l 结构与功能相适应 蚂蚁的多态现象与社会分工 表明了其神经系统 在无脊椎动物中比较高等 此外 蚂蚁具有独特的信息交流方式 它 身上有六个主要的分泌化学通讯物质的腺体 化学物质起报警 性引 诱 定向 标迹等功能 蚂蚁能把天空中的偏振光当作 指南针 来 使用 还能利用自己身体内的天体定向器来保证正确的行动方向 2 所有这些复杂的行为与它们相对发达的脑神经结构是分不开的 日本 弓背蚁体形较大 各种蚁态差异明显 神经系统比较高等 结构相对 集中 易于操作和观察 并可直接进行活体生理行为的实验研究 是 研究昆虫整个神经系统结构与功能的优良实验材料 神经系统是我们感觉 运动 学习和记忆的基础 而神经递质又 是各种神经活动的物质基础 通过递质分子与突触后膜上的受体分子 的相互作用影响离子通透性 产生兴奋性或抑制性突触后电位 从而 实现神经细胞间的信息传递 3 1 当今昆虫研究的热点是昆虫感觉信息 的接受 传递 编码 整合 储存及产生动作的分子和生理机理问题 昆虫脑神经递质的研究为这些热点问题的解决开辟了新途径 同时也 为高等动物的神经生物学的研究提供了帮助 昆虫脑神经递质分为四 类 胆碱类 氨基酸类 单胺类和肽类 通过这些物质 使得各种神 经活动顺利而协调的进行 神经信号得以准确无误的表达 由于神经 组织的特殊结构和形态 通过免疫组化检测可清晰地显示出神经元的 胞体 轴突 树突及其分布和走向 彼此的相互联系和周围神经的神 经纤维和终末 从而进一步为受体和离子通道的研究奠定基础 人们对昆虫脑神经递质的研究是从二十世纪六十年代开始的 1 9 6 0 年 w e l s h 等人发表了5 羟色胺在无脊椎动物的定量分布的研究 4 1 1 9 7 2 年 k o s t o w s k i 等人研究了一些药物对蚂蚁中央神经系统中 5 羟色胺含量的影响 1 9 7 6 年s a n e s 等人研究了咽草蛾触角发育中已 酰胆碱和它的代谢酶1 6 他们当时主要采用生物化学 药物学方法和 放射自显影技术 后来 在免疫学 生物化学和显微镜技术进展的基 础上 免疫组织化学技术发展起来 它分为免疫荧光技术和免疫酶标 技术 基本原理是利用荧光素或辣根过氧化物酶对一抗或二抗进行标 记 再用标记的抗体作为探针检测细胞或组织内的相应抗原 从而对 抗原进行定位和定性1 7 这种技术敏感性高 特异性强并能将形态 代谢和机能密切结合在一起 大大推动了昆虫神经递质的研究 免疫 荧光技术是c o o n s 等在1 9 4 2 年首先建立的 到1 9 8 2 年这种技术发展 成熟 可以进行双重标记 这为神经递质共存现象的研究提供了条件 隅 免疫酶标技术又称过氧化物酶标技术 是由n a k a n e 1 9 6 6 发展起 来的 该技术所采用的酶是辣根过氧化物酶 h r p 经过酶标的抗体 和抗原极易形成复合物 该复合物在底物过氧化氢 h e 0 2 和供电子 体3 3 二氨基联苯胺 d a b 的作用下发生反应 生成褐色沉淀物 可以在普通的光学显微镜下对抗原的分布进行观察 该技术的发展经 历了直接法 间接法和双重标记法 最初适用范围只是冰冻切片 1 9 7 7 年s t e m b e r g 等又用桥抗过氧化物酶抗体复合物 建立了p a p 技术 从 而大大提高了免疫组织化学的特异性和敏感性 把这一技术推广到石 蜡切片 9 1 1 9 8 1 年许世明等将b a b 法加以改进 建立了a b c 技术 该 技术被认为是免疫组化方法学的一次重大突破 近几年来人们又从链 酶菌中分离出链酶菌抗生物素蛋白 s a 穿透力比a b c 和p a p 复合物 大 反应迅速 形成一种新的方法一链酶菌抗生物素蛋白一过氧化物 酶 s p 法 灵敏度高 适合于石蜡包埋组织中低含量的抗原检测 单克隆抗体技术的出现使免疫酶标技术得到广泛应用 由于免疫组化 技术的发展 人们在8 0 年代和9 0 年代对昆虫神经递质做了大量的研 究工作 涉及各种递质和许多昆虫的不同脑区 例如 s c h i f e r 等1 9 8 6 年研究了蜜蜂脑中g a b a 免疫阳性的分布情7 兄 j s c h u r m a n n1 9 8 9 年 研究了蜜蜂脑中多巴胺的阳性反应 1 l 1 9 9 4 年 徐智敏等进行了蜜蜂 脑中5 h t g a b a a c h 免疫阳性神经元分布的比较研究 l h o m b e r g 等1 9 9 5 年研究了烟草蛾中脑乙酰胆碱脂酶的活性 l 5 h t 是一种重要的神经递质 1 9 4 8 年r a p p o r t 等从血清中分离出 一种缩血管物质 命名为s e r o t o n i n 血清紧张素 次年即确定其结构 为5 羟色胺 5 h y d r o x y t r y p t a m i n e 5 h t 5 h t 在化学上属吲哚胺类 化合物 由吲哚和乙胺两部分构成 生物合成是以色氨酸为前体 经 过色氨酸羟化酶和5 羟色胺酸脱羧酶的作用生成的1 1 4 人们对5 h t 在昆虫脑中的分布做了大量的研究 1 9 8 3 年n i s s e l 研究了沙漠蝗 美 洲大蠊和红头丽蝇三种昆虫视叶中5 h t 的阳性反应 i 1 9 8 4 年 s c h a r f e r s 对蜜蜂脑中5 h t 能神经元的分布进行了研究 l q 1 9 8 9 年 h o m b e r g 研究了烟草蛾前脑中部和咽下神经节中5 h t 的阳性反应 1 7 同年n a s s e l 等人概括了昆虫神经系统5 h t 能神经元的分布 1 8 八十 年代末期 出现了免疫细胞化学技术 可以对单个神经元中神经递质 的分布进行研究 随着分子生物学的发展 膜片钳技术和d n a 重组技 术的应用 人们开始对5 h t 的受体和离子通道进行研究 5 h t 在昆 虫中与学习 唾腺分泌和控制昼夜节律有关 8 一种神经递质具有调 节多种效应的能力 说明存在不同类型的受体与信号转导途径相偶联 w i t z 等1 1 9 j 和s a u d o u 等 2 0 从果蝇中分离出编码三个不同的5 h t 受体 的基因 这三个受体在哺乳动物细胞中表达时 活化不同的细胞内效 应系统 其效应系统的多样性也能解释5 h t 如何能引起充分协调的行 为顺序 人们对昆虫脑中5 h t 的研究进展比较迅速 材料多为形体较大 的昆虫 1 9 9 9 年 暴学祥等发明的c p 包埋技术为各种昆虫的神经递 质的研究奠定了基础 2 本文把c p 切片技术和免疫组化方法结合起 来 观察工蚁脑中5 h t 能神经元的分布情况 并将其与g a b a 的分 布进行比较 试阐明5 h t 的分布特点 并探讨不同脑区的神经联系 建立一个5 h t 分布的中央神经系统模型 为其在昆虫脑中的生理功能 的分析提供直接而有力的证据 同时也可为神经生物学的研究提供基 础资料 4 2 材料与方法 2 1 实验材料 1 1 药品 自制c p 包埋剂 i i i i i i i v v v i 多聚甲醛 叔丁醇 兔抗5 一h t 一抗 s p 试剂盒 二抗 多聚赖氨酸 d a b h 2 0 2 显 色剂 p b s 苏木精及石蜡切片常规药品及柯达公司的b 5 胶卷和国 产的常规显影液和定影液 1 2 设备及用具 手摇切片机 1 0 个5 0 m l 烧杯 冰箱 孵育盒 石蜡切片所需的 其它设备及o l y m p u s 显微照相机 1 3 材料 日本弓背蚁大工蚁2 0 只 采集时间 2 0 0 1 年1 0 月中旬 采集地点 东北师范大学校园 2 2 实验方法 2 1 固定 将日本弓背蚁的头部切下 浸入4 多聚甲醛 o 1 m p b 固定液 中 4 c 固定8 h 2 2 漂洗 固定后的材料用p b s o 1 m 几 p h 7 4 漂洗1 h 将组织表面的多 聚甲醛充分洗干净 在此期间 更换3 次p b s 2 3 脱水 漂洗后的材料转移到系列酒精中进行梯度脱水 2 4 透明 脱水后的标本转移入叔丁醇中 3 0 3 6 h 换叔丁醇两次 2 5 浸透 标本逐级浸入c p 包埋剂中 5 3 c 温箱保存6 8 h 2 6 包埋和切片 将融化的c p 包埋剂到入叠好的纸盒中 再将标本放入 待包埋完 全凝固后 将蜡块修成长方形小块 用切片机进行连续切片 切片厚 为8u 2 7 展片 用展片台把切好的蜡带展平在涂有多聚赖氨酸的载玻片上 晾干 备用 2 8 脱蜡和复水 将带有标本的载玻片依次经过 二甲苯室温1 5 分钟 二甲苯室温1 5 分钟 1 2 二甲苯 1 2 无水酒精室温5 分钟 无水酒精室温5 分钟 9 5 酒精室温5 分钟 9 0 酒精室温5 分钟 8 0 酒精室温5 分钟 7 0 酒精室温5 分钟 5 0 酒精室温5 分钟 蒸馏水室温5 分钟 2 9 免疫组织化学染色过程 1 切片复水后入p b s o 1m o l l p h7 4 2 过氧化酶阻断溶 液室温孵育1 0m i n 3 非免疫性动物血清室温孵育5m i n 4 1 1 0 0 0 兔抗5 h t 4 c 过夜 5 次日生物素标记的第二抗体室温孵育1 0m i n 6 链亲和素一过氧化物酶溶液室温孵育1 0r a i n 7 d a b i 1 2 0 2 显 色5 1 0 m i n 以上除2 3 步p b s 洗5 m i n 9 1 其他步骤间p b s 洗1 5 m i n 3 次 2 1 0 复染 显色后的标本用蒸馏水洗去多余的显色液 转入e h r l i c h 苏木精中 6 复染2 分钟 自来水蓝化3 0 分钟 2 1 1 脱水 标本依次经过5 0 7 0 8 0 9 0 9 5 1 0 0 1 0 0 的酒精各5 分钟 2 1 2 透明 脱水后的标本再继续转入l 2 无水酒精 1 2 二甲苯 二甲苯 二甲苯 各5 分钟 2 1 3 封片 用加拿大中性树胶进行封片 贴好标签 晾干 保存在标本盒中 2 1 4 观察与照相 o l y m p u s 显微镜下观察照相 兔抗5 h t 由美国s i g m a 公司生产 经武汉博士德生物工程有限公 司分装后购置 s p 试剂盒由福州迈新生物技术开发公司提供 2 1 5 对照实验 用p b s 代替兔抗5 h t 同步进行上述免疫组织化学染色过程 结 果为阴性 2 结果 日本弓背蚁的脑非常发达 由前脑 中脑 后脑和食道下神经节 构成 前脑由前脑叶和视叶构成 前脑叶包括蕈形体 中央复合体和 其邻近的脑区 一对蕈形体以左右对称的形式位于脑的上方 由两个 杯状的髓质冠及通过冠的柄部向下延伸的根系构成 根系包括逆行的 叶和向下延伸的p 叶 中央体由上下两部分构成 中央上体和中 央下体 中央体的上方有连接左右两个半球的结构 前脑桥和脑后 桥 视叶是昆虫复眼的基本视觉中心 由神经节层 外髓和内髓三个 神经区域构成 中脑由嗅叶和背叶组成 其主要成分是嗅叶 后脑与 食道下神经节相连 食道下神经节再与两条腹神经索相连 本文主要从额方向 纵切 和水平方向 横切 进行脑的连续切 片 用5 h t 标记 从而来观察5 h t 能神经元的分布情况 结果发现 5 h t 能神经元数量比较少 但发出的纤维投射到脑的广泛区域 除 k e n y o n 细胞外 几乎整个脑都有5 h t 的分布 视叶 中央体和食道 下神经节分布尤为丰富 脑区之间的一些神经纤维通路 有的呈褐色 有的染色很浅 有的几乎不着色 3 1 前脑 p r o t o c e r e b r u m 5 h t 阳性纤维起源于少量的细胞体 但在不同纤维网中有广泛的 分布 呈现明显的静脉曲张状 染色强度在三个视觉纤维网各不相同 中央体阳性反应强烈 蕈形体的冠 柄 n 叶 b 叶也呈阳性反应 k e n y o n 细胞未被标记 3 1 1 视叶 o p t i cl o b e s 2 2 1 日本弓背蚁的视叶包括三个彼此相连的神经纤维网 由外向内为 神经节层 外髓和内髓 神经节层主要接受复眼感受器传来的信息 它分为细胞体层和神经纤维层 细胞体层主要为单极细胞的胞体 神 经纤维层又分为a b c 三层 从神经节层到外髓通过外交叉把神经 节层和外髓连接起来 外髓向内通过内交叉和内髓相连 从内髓到前 脑有纤维束相连 5 h t 阳性纤维呈现明显的静脉曲张状 并呈分层现 8 象 三个视神经纤维网的神经纤维都成柱状排列 与视网膜的柱状排 列一致 与层状结构相垂直 3 j 1 1 神经节层 1 a m i n a 依据神经节层的组织学特征 可将其分为外侧的细胞体层和内侧 的神经纤维层 前者宽度约是神经节层的1 2 大量的单极神经元5 h t 免疫反应皆为阴性 蓝色 后者可分为a 层 b 层和c 层 a 层最 宽 c 层次之 b 层最狭窄 约是c 层的1 3 a 层位于纤维层的外侧 与视网膜相连 主要接受感光细胞 无长突神经元 单极神经元的投 射 再发出纤维连接b 层和c 层 a 层阳性反应较弱 b 层纤维较稀 疏 阳性反应最弱 c 层位于纤维层的内侧 5 h t 免疫阳性反应最强 烈 图1 其中含有大量的阳性纤维分枝终末 染色深而均匀 细的 5 h t 神经纤维成柱状排列 这些柱状结构通过边缘的神经纤维相连 接 在神经节层和外髓之间 存在一个明显的视交叉 即外交叉 o u t e r c h i a s m a o c h 图2 沿外交叉两侧有许多神经元 染色皆为蓝色 在外交叉可看到来自前脑的一束粗大的阳性纤维 图2 投射到c 层 2 2 外髓 m e d u l l a 外髓体积最大 宽1 1 2 m 根据染色程度的不同 可以把它分为 9 层 其中第1 2 3 7 8 9 层染色浅 反应弱 中间的第4 5 6 层 阳性纤维分布最广 染色均匀 在向心方向呈规则的网孔排列 与外髓柱状细胞相垂直 这三层边界不明显 约占外髓的三分之一 图 3 外髓与内髓之间存在第二个视交叉一内交叉 i n n e r c h i a s m a i c h 阳性反应较弱 三种神经元与外髓有关 第一种是无长突神经元 a m a c r i n e c e i l s 胞体较小 位于外髓的两侧 突起深入髓的层状结 构并形成许多细小分支 它们中只有6 8 个被标记 第二种是柱状神 经元 连接外髓和内髓 胞体位于内交叉两侧 有3 4 个被标记 胞 体向外髓 内髓发出轴突 第三种是切向神经元 t a n g e n t i a l h e r r o p s 胞体较大 发出轴突到外髓和前脑 外髓和前脑之间有一群切向神经 元6 7 个 直径在5 6 9 8 p m 之间 染色很深 图4 2 3 内髓 i o b u l a 内髓是视叶的第三个神经纤维网 体积约为外髓的一半 通过内 交叉与外髓相连 5 h t 染色使内髓分为5 层 图5 第2 层染色最浅 第l 4 层染色均匀 没有明显的阳性纤维 第3 5 层阳性纤维细 染色深而清晰 这两层呈向心排列并且与外髓的阳性纤维层相垂直 第五层有少量阳性纤维呈不规则分散状分布 内髓与外髓之间的少量 柱状神经元被染色 发出纤维到内髓 内髓与前脑蕈形体冠之间有3 5 个胞体较大的切向神经元染色很深 它们发出纤维与前脑联系 在前 脑中部腹侧有两组非常大的阳性细胞 直径在1 1 2 1 6 8u m 发出的 纤维聚集成柬 其中许多细的分枝 扩展到前脑的大部分区域 它们 向边缘扩展的一部分分支侵入内髓 还有一部分纤维侵入外髓 图6 此外可看到清晰的弱阳性视觉通路 外髓 侧前脑通路 m e d u l l a l a t e r a l p r o t o c e r e b r u mf i b e rt r a c t 图7 内髓 侧前脑通路 1 0 b u l a 1 a t e r a l p r o t o c e r c b r u mf i b e rt r a c t 图8 内髓 内髓通路 1 0 b u l a 1 0 b u l af i b e r t r a c t 它们染色很浅 其中有些细的纤维染色较深 3 1 2 前脑叶 p r o t o c e r e b a ll o b e 蕈形体n 叶 1 3 叶 侧前脑和中央上体 中央下体的髓质区均呈 现5 一h t 阳性反应 染色强度柄比冠深 a 叶比1 3 叶深 中央上体和下 体反应强度没有明显的差别 前脑后侧 靠近蕈形体冠的下方 有对 称分布的两组 约2 0 个 大抗原细胞 在侧前脑与蕈形体之间有8 1 0 个神经元被标记 3 1 2 1 蕈形体 m u s h r o o mb o d y 蕈形体是前脑叶中最明显的两个对称的神经纤维区 每个蕈形体 由两个冠 柄及与柄相连的a 叶和b 叶组成 图9 图1 1 两个冠分 别称为中冠和侧冠 冠又分为唇 领和基环 图1 0 每个冠分别有 一个柄与它相连 这两个柄在下行过程中愈合 连接a 叶和1 3 叶 图 1 1 d 叶和1 3 叶在位置上互相垂直 在前脑后二分之一结构的额切片 中 n 叶在蕈形体冠下方呈两个对称的椭圆形结构 图1 2 在基底 由包绕它们的神经纤维分隔成四瓣 图1 2 图1 3 中央体上方两个 b 叶间有纤维通道相连 不呈阳性反应 图1 4 有许多密集的球形 细胞在冠外围并与其有一定距离的空边处规则地分布 这些细胞是 1 0 k e n y o n 细胞 图1 0 是蕈形体内部特有的细胞 它们发出的轴突形 成蕈形体最基本的结构 而蕈形体内部所有的阳性纤维都来自外部的 神经元 蕈形体的侧冠和中冠都呈现5 一h t 阳性反应 它们在基环部位通过 两束粗大的纤维交叉相连 这两束纤维呈现5 一h t 阳性反应 图1 0 两冠周围密集的k e n y o n 细胞数量大 直径小 形态相似 不呈阳性反 应 蕈形体的柄染色比冠深 图9 a 叶比1 3 叶深 图1 3 叶各 瓣之间神经纤维染色较浅 个别染色较深 它们大多属于外来的投射 纤维 有的来自侧前脑 有的来自嗅叶 靠近每个n 叶的内侧 有2 3 束较粗的5 一h t 阳性纤维 染色较深 围成环状 图1 5 在b 叶的周 围 也有少量的5 一h t 阳性纤维环绕 两个a 叶之间有纤维束相连 成 5 一h t 阳性反应 侧前脑两侧有8 1 0 个细胞 直径在3 0 8 和8 9 6 9 m 之 间 图1 6 它们发出纤维到达前脑与蕈形体 此外 前脑与中央体之 间有粗大的神经纤维通路 几乎不呈阳性反应 图1 7 图1 8 3 1 2 2 中央复合体 c e n t r a lc o m p l e x 中央复合体包括前脑桥 中央体和脑后桥和一对小结节 中央体 是中央复合体中最明显的神经纤维网区 包括中央上体和中央下体两 部分 前脑桥和脑后桥结构相似 它们位于中央体的上方 中央上体和中央下体均呈现明显的5 一h t 阳性反应 染色程度相差 不多 额切片中可看到它们被分隔成许多辐射状排列的柱状结构 呈 柱状染色模式 图1 9 5 h t 阳性纤维呈现明显的静脉曲张状 图2 0 前脑桥成5 h t 阳性反应 靠近中央体的中间部分阳性反应比两端弱 近中央体侧有束纤维染色较弱 后脑桥染色比前脑桥深 阳性纤维比 较粗 图2 1 小结节也呈阳性反应 在前脑后侧 靠近蕈形体冠的下方 有对称分布的两组大抗原细 胞 图2 2 每组1 0 个左右 它们向下发出轴突 在食道孔上方形成 许多树枝状的纤维束 图2 3 图2 4 这些纤维束的许多分枝向侧前 脑 前脑下方扩展 在前脑形成大量的阳性纤维 它们之中有的发出 轴突到中央体 图2 5 由下体发出6 8 条较粗的强阳性纤维 向下 延伸 在穿过两个b 叶汇合处成3 条 图2 6 一直延伸到前脑 水 平切片中a 叶 口叶垂直 其间 前脑被围成半圆形 上述纤维进入 前脑 沿前脑边缘也呈弧形分布 3 2 中脑 d e u t o c e r e b r u m 中脑由嗅叶和背叶两部分组成 嗅叶的纤维球是中脑的特征性结 构 呈阳性反应 染色程度与蕈形体冠相近 触角脑通路几乎不呈阳性 反应 在背叶5 h t 阳性纤维分布非常广泛 3 2 1 嗅叶 a n t e n n a ll o b e s 嗅叶是一对肾小球状的神经纤维网区 包括神经元 嗅觉纤维球 和几条神经纤维通路 5 h t 在日本弓背蚁嗅叶中有着广泛的分布 嗅 觉纤维球呈弱阳性反应 有一对细胞被标记 中触角脑通路呈阳性反 应 外触角脑通路和内触角脑通路几乎不呈阳性反应 3 2 1 1 神经元 n e u r o n s 日本弓背蚁的嗅叶主要受三种神经元的支配 局部神经元 1 0 c a l i n t e m e u r o n s 投射神经元 p r o j e c t i o nn e u r o n s 和传出神经元 c e n t r i f u g a ln e u r o n s 局部神经元属于无长突神经元 缺少轴突 在 许多或所有的嗅叶纤维球内有分枝 投射神经元不仅在一个或多个 纤维球中形成树突分枝 而且发出轴突通过触角脑通路投射到前脑的 不同区域 主要是蕈形体冠和侧脑角 传出神经元数量较少 在嗅 叶外的神经系统中树突分枝 发出轴突投射到嗅叶 嗅叶的神经元都 成群分布 主要集中在嗅叶的外侧和内侧 局部神经元主要位于嗅叶 外侧 个体较小 但很均匀 在嗅叶外侧有一对非常大的神经元 直 径为9 3 7 2 i t m 呈强阳性反应 图2 7 其余细胞没有明显的5 h t 阳 性反应 3 2 1 2 嗅觉纤维球 o l f a c t o r yg l o m e r u l i 嗅觉纤维球由嗅叶传入神经元 局部中间神经元和传出神经元的 突触连接构成 这些纤维球大小不一 染色程度与蕈形体冠差不多 密度均匀 球与球之间染色有些差异 这些大小不等的嗅觉纤维球通 过神经纤维网互相连接 几乎遍布于整个嗅叶 图2 8 在额切片中 可看到纤维球之间的髓质区有细而深的阳性纤维分布 在水平切片中 可看到嗅叶中分布一些静脉曲张状和小泡点状的阳性纤维 这些纤维 分布于中间的比周围的粗且染色深 图2 9 3 2 1 3 神经通路 n e r v et r a c t 嗅叶是昆虫嗅觉系统的中心 但不是最高级中心 它需要把接收 的信息传递给脑 在嗅叶与脑之间存在几条神经纤维通路 内触角脑 通路 i n n e ra n t e n n o c e r e b r a lt r a c t 中触角脑通路 m i d d l e a n t e n n o c e r e b r a lt r a c t 和外触角脑通路 o u t e ra n t e n n o c e r e b r a l t r a c t 内触角脑通路是最粗大的神经通路 直径在3 2 4 8 9 m 从中 脑的嗅叶纤维球开始 图3 0 沿靠近食管的 n 前行 把嗅叶与前 脑蕈形体冠连接起来 图3 1 通道内侧的纤维里弱阳性反应 在t 3 叶 处发生分枝 细小的纤维伸向侧前脑 主要的纤维从b 叶下侧穿过 经y 叶 中央体的外侧边缘一直到达蕈形体中冠附近 图3 2 图3 3 外触角脑通路也比较粗大 纤维粗为2 7 4 4 u m 由中脑发出 在前脑 外侧呈弧形 延伸到前脑蕈形体侧冠附近 外通路没有明显的阳性反 应 只有其中细的纤维染成褐色 图3 4 中通路比较细小 呈5 一h t 阳性反应 咽的上方有条神经通路把两个嗅叶连接起来 呈弱阳性反 应 此外 嗅叶和后脑之间有条纤维通路 比较粗大 染色较浅 只 有里面细小的纤维呈弱阳性反应 3 2 2 背叶 d o r s a ll o b e s 背叶位于嗅叶的后背方 与前脑和食道下神经节互相融合 没有 明显的界限 背叶中分布有大量的静脉曲张状的阳性纤维 图2 9 3 3 后脑和食道下神经节 后脑位于前脑的腹下方 食道孔的两旁 它们之间的连接纤维位 于食道孔的上方 图3 5 向后与食道下神经节相连 图3 6 后脑髓 质区呈阳性反应 有少量的阳性纤维分布 后脑上方有少量胞体较大 的阳性细胞 左右后脑之间的连接纤维染色较浅 后脑和中脑相连 图 3 7 它们之间有一条神经纤维通路 几乎不着色 此外 后脑与咽下 神经节之间的连接纤维呈弱阳性反应 食道下神经节位于脑的腹面 是头部腹面的神经节中心 由上额 节 下额节和下唇节的神经节和并而成 为近似方形结构 图3 8 和两条腹神经索相连 此外 还有一对大颚神经和它相连 食道下神 经节呈现明显的5 一h t 阳性反应 在其腹侧有十几个较大的5 h t 阳性 神经元 图3 8 它们发出轴突深入食道下神经节 在食道下神经节 形成3 条粗大的树枝状的5 h t 阳性纤维 染色很深 由这些纤维发出 无数细小的分支 分布于整个食道下神经节 图3 9 神经节有许多 左右连接 其中有些染色较深 有的染色较浅 图4 0 有许多神经 纤维垂直从它穿过 形成成对的纤维束 其中有两对很粗大 呈弱阳 性反应 4 讨论 5 h t 在许多动物中普遍存在 人们对其在无脊椎动物中的发生和 功能进行了大量的研究 但它在昆虫中枢神经系统中的功能了解的还 很少 它在昆虫脑中分布广泛 可能对其他类型的神经元从整体上起 调节作用 在蜜蜂嗅觉刺激的反应中 5 h t 抑制条件刺激的反应口 此外 5 h t 神经元与摄食行为及运动的调解和整合有关 可能调解或 激活中枢神经回路 2 4 11 2 5 1 因此 5 h t 是中枢神经系统中的一种重要 的神经递质 采用c p 切片技术和免疫组化方法对日本弓背蚁脑中 5 h t 能神经元的分布模式进行系统研究 可以清晰地观察到5 h t 分 布规律及其主要特征 因而可以进 步为其在中枢神经系统中的生理 功能的分析提供直接而有力的证据 从实验结果可以看出5 h t 能神经元在日本弓背蚁脑中的分布具 有两个明显的解剖学特征 1 阳性神经元的数量相对少 总计1 0 0 个左右 与其脑中神经元的总数相比 所占比例极小 2 少数的神 经元发出静脉曲张状的阳性突起 在整个脑中形成广泛的分枝 有的 神经元支配一个大的纤维网区域 有的则支配相互连接的几个区域 因此 5 h t 主要是在大面积神经丛区域 参与远距离神经活动的调节 4 1 视叶 5 一h t 可能参与调节昆虫视觉的精确性或视觉中间神经元的活性 并与昼夜节律的调整有关f l 引 5 h t 在视叶中分布非常丰富 尤其在神 经节层反应异常强烈 表明5 h t 在视觉信息的加工和调节过程中起重 要作用 我们对日本弓背蚁视叶中g a b a 的分布进行过研究1 2 6 g a b a 是一种抑制性神经递质 结果表明其视叶中g a b a 分布很丰富 与 5 h t 的分布模式有明显的不同 在神经节层 5 h t 主要分布于c 层 g a b a 主要分布于a 层 c 层 外髓中5 h t 主要分布于中间的第4 5 6 层 而g a b a 主要分布于第1 3 5 9 层 内髓中5 一h t 分5 层 第3 5 层染色深 g a b a 则在第1 3 5 层染色深 视叶中g a b a 阳性神经元的数量明显多于5 h t 能神经元 这进一步说明5 h t 是在 远距离神经丛区域起作用 而g a b a 则主要参与局部区域神经活动的 l5 调节 与沙漠蝗 美洲大蠊和红头丽蝇视叶中5 h t 的分布 l 5 j 相比 1 神经节层 日本弓背蚁与沙漠蝗和红头丽蝇的分布模式相同 染色显 著的阳性纤维层一层 而美洲大蠊两层 2 外髓 日本弓背蚁中间 的第4 5 6 层染色深 其余6 层反应较弱 沙漠蝗阳性纤维层六层 2 4 层较宽 每层又可分为两个亚层 美洲大蠊阳性纤维3 层 红头 丽蝇也分3 层 最外一层可分两个亚层 3 内髓 日本弓背蚁3 5 层染色深 呈向心排列 其余三层反应弱 沙漠蝗阳性纤维呈现较宽 的3 层 最里面一层围成没有阳性纤维的核心 美洲大蠊没有明显的 分布特征 红头丽蝇内髓和内髓板 l o b u l a p l a t e 阳性纤维呈弥散状 最内层阳性反应最强 5 h t 阳性神经元主要分布于沙漠蝗外髓背侧边缘 美洲大蠊的神 经节层与外髓之间 外髓 内髓及侧前脑的边缘 红头丽蝇的外髓及 侧前脑之间 日本弓背蚁则在上述部位均有分布 以上比较结果进一步说明昆虫视叶神经纤维网结构的复杂性及种 间的差异性 5 h t 在沙漠蝗视叶中的分布模式比美洲大蠊和红头丽蝇 复杂 而日本弓背蚁比沙漠蝗更复杂 这也说明了日本弓背蚁神经系 统相对发达 与其社会性生活相关 此外 5 h t 在日本弓背蚁视叶神 经节层中阳性反应异常强烈 这可能与其营穴居生活 经常出入蚁穴 对光线明暗急剧变化的适应有关 4 2 蕈形体 在蜜蜂脑中k e n y o n 细胞呈牛黄酸阳性反应 2 7 而日本弓背蚁脑中 k e n y o n 细胞不被5 一h t 和g a b a 标记 其递质类型有待于进一步证实 日本弓背蚁蕈形体冠和柄都呈现5 一h t 阳性反应 且柄染色比冠深 这 表明冠不仅接受k e n y o n 细胞的树突 而且还接受前脑的其它区域或其 它脑区纤维的投射 蕈形体是嗅