（生物医学工程专业论文）基于聚乙烯二氨基三嗪的氢键型转基因载体.pdf

a bs t r a c t an o v e lg e n et r a n s f e rs y s t e mc a p a b l eo fc o m p l e x i n gp l a s m i dd n a p d n a t h r o u g hc o m p l e m e n t a r yh y d r o g e nb o n d i n go fg u e s t sw i t hb a s ep a i r sw a sc o n s t r u c t e d i n t h i sw o r k p o l y v i n y l d i a m i n o t r i a z i n e p v d t h o m o p o l y m e ra n di t sc o p o l y m e r s w i t hp o l y 1 v i n y l 2 p y r r o l i d o n e w e r es y n t h e s i z e dv i ac o n v e n t i o n a lr a d i c a lr a n d o m p o l y m e r i z a t i o n a n dw a t e r s o l u b l ef r a c t i o n sw e r ec o l l e c t e d t h e s ep b b 部e d p o l y m e r sw e r es h o w nt oe f f i c i e n t l yc o m p l e xp d n aa n dd i s p l a c ee t h i d i u mb r o m i d e f e b i ne b i n t e r c a l a t e dp d n as o l u t i o n sb e c a u s eo ft h eh y d r o g e n b o n d i n g i n d u c e d c o n s t r a i n e ds t a t eo fp d n a i tw a sa l s of o u n dt h a tu p o nc o m p l e x a t i o n p d n as e e m e d t ou n d e r g ob cc o n f o r m a t i o nc h a n g ea n dc i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r aa s s u m e da p o l y m e r a n d s a l t i n d u c e d p s i t y p ep a t t e r nt h a tw a sr a t i o n a l l ya s c r i b e dt oac e r t a i n c h a n g ei nt h eh i g h o r d e r s t r u c t u r eo fd n ac o n d e n s a t e s t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p yp r e s e n t e ds e v e r a lm o r p h o l o g i e so fs p h e r e sa n dt o r o i d sw i t h i na g g r e g a t e s 芝10 0n l i l r e s e m b l i n gd n ac o n d e n s a t i o ni n d u c e db yc a t i o n i c s i nt r a n s f e c t i o ns t u d i e s u s i n gp d n a e n c o d i n gl u c i f e r a s eo re n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n t h i ss y s t e m c o u l de f f i c i e n t l yt r a n s f e c tc o s l c e l l s c o m p a r e dt ot h ec o m m e r c i a lp o l y c a t i o n s y s t e m e x g e n5 0 0 t h e s eh b o n d i n gv e c t o r sd i s p l a y e ds e v e r a lm e r i t ss u c l ia sh i g h e r t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y l o w e rc y t o t o x i c i t y b e t t e rs e r u l nc o m p a t i b i l i t y a n ds t a b i l i t yi n t h ep r e s e n c eo fb o v i n es e r u ma l b u m i n b s a t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tp v d t b a s e d p o l y m e r sa r es u p e r i o rt op o l y c a t i o nc o u n t e r p a r t sw i t hr e g a r dt ot h e i rp o t e n t i a li nv i v o a p p l i c a t i o n s k e yw o r d s p o l y v i n y l d i a m i n o t r i a z i n e p v d t h y d r o g e nb o n d i n g d n a c o n d e n s a t i o n g e n et r a n s f e c t i o n n o n v i r a lv e c t o r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果 除了文中特别加以标注和致谢之处外 论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果 也不包含为获得墨鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意 黝文作 嘲均 期 砷年cm 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘堂有关保留 使用学位论文的规定 特授权苤洼苤堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索 并采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编以供查阅和借阅 同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 保密的学位论文在解密后适用本授权说明 学位论文作者签名 锄溺 签字日期 1 年1 月 i r 新躲扫j 7 谚 签字日期 g 年f 足蜉日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 有关基因治疗的概念最早兴起在1 9 6 6 年 开始构思未来的分子药物 憧憬 用基因治疗的方式从有关基因疾病的病根上纠正人类细胞中编码功能的遗传信 息 迄今为止 该领域已在临床应用上取得了很大进步 但仍然面临着巨大挑 战 在过去三十多年中 病毒与非病毒转基因系统都已经在临床实验中有所应 用 目前病毒型载体系统在体内外实验中使用较多 但其缺点在于潜在的致癌 性 自身免疫原性或造成细胞病理改变等 而非病毒载体具有低毒 低免疫反 应 无基因插入片段大小限制 以及使用简单 制备方便 便于保存和检验等 优势 鉴于非病毒载体在实验与治疗方面潜在的优越性 很多研究者选择了非病 毒载体基因递送系统作为研究方向 图1 1 所示的是非病毒载体一d n a 复合物 在细胞中的转运过程 为了更有效的进行这一转运 需要系统地开发基因释放 体系 使载体满足一系列苛刻的条件 首先要能较好的缩合d n a 并形成载体一 d n a 复合物 具有低的细胞毒性且与细胞或带电分子的相互作用较弱 这些要 求在体内应用时更为严格 其次 对载体一d n a 复合物的尺寸也有一定要求 须形成纳米级复合物 如复合物尺寸小于1 0 0 纳米将有利于血流内扩散和帘式 内皮膜的外渗 再次 载体一d n a 复合物应具有较好的细胞靶向性以减小非特 异的基因释放 或与细胞膜表面特种蛋白结合以增强细胞包吞内在化 利于提 高转染效率 最后 d n a 复合物要有能力从内涵体中逃逸出来 并有效释放d n a 使之在细胞核内得以表达 另外 如果能更好的保护d n a 免受d n a 酶的降解 促进d n a 从内涵体和载体的释放与解离 增大d n a 的进核量 无疑会进一步 的完善了转基因载体 对于体内应用的载体 载体一d n a 复合物还需具备穿透 组织 避免激活补体系统的能力 目前 还没有能够同时满足诸多功能要求的 普适载体 在开发安全高效的转染体系过程中 研究人员仍任重而道远 在1 2 节 将综述各类基因治疗中的非病毒载体 在1 3 节 将简要概述基于氢键与 d n a 作用的非病毒载体进展 1 4 节 为本工作课题的研究方向 第一章绪论 o m p i e i a t i o n 图1 1 以阳离子载体为例 非病毒载体 d n a 复合物在细胞中转运示意图 1 2 非病毒载体 1 2 1 脂质体 2 0 世纪6 0 年代b a n g h a m 等将磷脂分散在水中 经电镜观察发现 磷脂在 水中自然形成多层囊泡结构 每一层均为脂质双分子层 厚度约为4 纳米 囊 泡中央和各层之间是水相 这种具有类似于生物膜结构的小囊称为脂质体 又 称为人工生物膜 脂质体早在1 9 7 2 年就用于包载药物 发展至今已有了广阔的 临床应用前景 在非病毒载体领域 阳离子脂质体最为常见 如i n v i t r o g e n 公司 商品化的l i p o f e c t a m i n e 在体外可有效转染多种细胞系 阳离子脂质体包含三 个基本部分 图1 2 带正电荷的极性头部 疏水锚着区和连接极性与非极性区 域的连接键 图1 2 所示的酯键 0 罩从三汶允揪 邑 l c 躺n i c l m k j 一l j p j d j c j o u p 图1 2 脂质体的一般结构 第一章绪论 脂质体的极性头部带正电荷 与d n a 带负电的磷酸根静电相互作用复合在 一起 这一正电头部同时有助于复合物与负电的细胞膜等相结合 为复合物的 胞吞作足准备 脂质体的极性头部通常包含胺类基团 脒基等 如果在头部区 域引入羟基等极性基团 将显著提高体内对肺部的转染率 1 1 f l o e h t 2 在研究中发 现将极性头部中的氮原子用砷替代后提高了在培养的细胞及鼠肺中的转染率 阳离子脂质体的锚着区域亦对转染率和细胞毒性有影响 连接键关系到阳离子 脂质体的化学稳定性和生物降解能力 i 对转染活性和细胞毒性也有影响 研究 表明带有酰胺键的31 3 i n n n 二甲基氨基乙烷 甲酰胺 胆固醇 d c e h 0 1 对体外转染活性较低 带有酯键的阳离子脂质体 如l 2 二油酰 3 三甲基胺丙 烷 d o t a p 具有良好的生物降解性 低细胞毒性 但化学稳定性较差 阳 离子脂质体间差异较大 微小的变动即可导致转染效率和细胞毒性的差异 因 此 阳离子脂质体介导基因转染的依赖因素很多 特别是在体内应用时 不确 定性很大 阳离子脂质体转导基因进入细胞的机制通常被认为是所形成的正电荷复合 物与带负电的细胞膜质膜融合的结果 使脂质体一d n a 复合物直接进入细胞质 同时 细胞包吞作用也被认为参与了这一过程 实验表明氯喹可以提高阳离子 脂质体复合物的转基因效率 这是由于氯喹提高了内涵体的p h 值 并有效抑制 了内涵体与溶酶体的融合 促进复合物从内涵体中释放出来 同样 p k c 活性与 转染率的反向关系也暗示了胞吞作用参与了这一转导过程 多数阳离子脂质体 中都用到中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺 d o p e d o p e 在形成稳定的单脂双 层阳离子脂质体时是必不可少的 有利于细胞膜融合作用 增加内涵体膜的不 稳定性 促进复合物从内涵体中逃逸 并释放到胞浆 目前脂质体一d n a 复合物已经广泛临床应用 如通过气雾胶法转染肺或鼻粘 膜的上皮细胞 通过动脉内皮的导管术 脑和肿瘤的直接注射和局部组织给药 等方式进行基因治疗 1 2 2 聚乙烯亚胺 1 2 2 1 聚乙烯亚胺 p e i 聚乙烯亚胺 p e i 主要有线性以及支化两种结构形式 如图1 3 在支 化p e i 中 伯胺 仲胺和叔胺氮的含量分别为2 5 5 0 和2 5 三种形式的 氨基都可能被质子化 和聚赖氨酸相比 p e i 在几乎整个p h 值范围内都有很强 的缓冲能力 带正电的p e i 很容易与d n a 带负电的磷酸基团相互作用 并有效 缩合d n a 形成p e i d n a 复合物 复合程度的好坏可通过调节p e i 与d n a 第一章绪论 的复合比例 经凝胶电泳分析得出 h j c c i i 小融 i c i l c l i n i 睁c h 2 h r n h 图1 3 线性和支化p e i 一般来讲 为了提高载体一d n a 复合物的跨细胞膜能力 研究人员使用了 许多种辅助分子 如腺病毒 氯喹 甘油及融合肽等等 然而p e i 在不使用这 些辅助措施的时候也可以很有效的转染细胞 对p e i 的高转染效率的经典解释 是p e i 自身具有强大的p h 缓冲能力 在内涵体中的时候 随着氯离子流入引起 大量的质子积累 产生渗透溶胀或内涵体破裂 使内涵体中的物质得以逃逸出 来 这一解释的化学基础是 考虑到p e i 的氨基基团的p k 值 以及细胞外与溶 酶体内p h 值的差异 p e i 中被质子化的氮原子比例将从2 0 增加到4 5 大量 质子的接收 提高了内涵体的p h 值 影响到内涵体内蛋白的折叠 造成酶降解 失活 为d n a 的逃逸争取到了时间 d n a 降解延缓 和空间 内涵体溶胀破 裂 1 2 2 2p e i 一半乳糖载体 由于p e i 自身存有大量的氨基 使得化学改性较容易实施 z a n t a 等 3 将半 乳糖残基接枝到分子量2 5 k d a 的p e i 上 通过不同氨基取代度的大量转染实验 发现 5 氨基取代度的p e i 最适于体外靶向肝细胞 同时实验表明 电中性的 p e i 一半乳糖 d n a 复合物在转染人肝癌细胞h e p g 2 和老鼠肝细胞过程中 受 a s g p r 的调节 传统p e i d n a 复合物需整体上带正电来促进膜融合 进而增 加转染效率 而p e i 一半乳糖 d n a 复合物粒子则无需非要荷正电才能有效转染细 4 7 勺 矗 广 0 尹 n 1 一 肇蟹 董 r4 k y 弋 k b黻跫2 第一章绪论 胞 这与靶向性有助于细胞可跨膜有关 这一优点使之在体内可减少与细胞外 的阴离子蛋白聚糖结合 增加了复合物在血液中的循环时间 使其有着良好的 应用前景 但是p e i 半乳糖载体仍存在一些问题 如p e i 半乳糖 d n a 复合物形成较大 的1 0 0 4 0 0 纳米的粒子 期待进一步减小粒子尺寸 另外 吞噬细胞 特别是 肝巨噬细胞上具有能识别半乳糖残基的膜凝集素 同时半乳糖不只在一种类型 细胞上存在受体 这些都是在具体应用中亟待解决的问题 1 2 2 3p e i r g d 载体 r g d 指a r g g l y a s p 多肽序列 存在于细胞外基质蛋白中 事实上r g d 已 经用于寡赖氨酸的转染中 通过细胞表面整合子的调控 使包载的d n a 自然进 入细胞内部 成功的体内转染上皮细胞和内皮细胞 这些整合子 如a51 3l 和 大多数含有av 的蛋白可有效识别细胞粘着物 血清或者细胞外基质蛋白质中的 r g d 序列 选用c y g g r g d t p 肽 通过二硫键使之桥接于2 5 k d ap e i 的巯基衍 生物 制备p e i r g d 转基因载体 p e i r g d 可将质粒d n a 缩合成3 0 1 0 0 纳米单分散的球形粒子 由于两性离子肽残基的屏蔽效应 粒子表面接近电中 性 在血清存在条件下 转染上皮细胞和成纤维细胞的效率要较p e i 高十倍到 一百倍 但是当c y g g r g d t p 肽序列中的天冬氨酸被谷氨酸替换后 转染效率 不再提高 证明整合子与r g d 多肽的特意性识别参与了转染过程 p e i r g d d n a 复合物与腺病毒有相似的组成特性 如尺寸大小 被保护的d n a 内核 利用整合子调控进入细胞和酸引发从内涵体中逃逸 近年来 以老鼠为 模型将r g d 肽序用于靶向释放毒素至肿瘤血管 p e i r g d 在肿瘤血管中选择 表达qvb3 整合子 实现了靶向基因释放 有望用于癌症的基因治疗 1 2 3 壳聚糖 1 2 3 1 壳聚糖 c s 壳聚糖 c s 是甲壳素脱乙酰基的产物 由许多2 氨基 2 脱氧 d 葡萄糖和 2 乙酰氨基 2 脱氧 d 葡萄糖的重复单元无规排列组成的线性多糖 见图l 4 具有良好的生物相容性 可降解性 低细胞毒性 壳聚糖有增强生物大分子药 物的透膜能力 有一定的生物粘附性和降解性 有助于药物在体内的吸收 因 此在生物大分子药物投递体系中有良好的应用前景 壳聚糖亦被用作酶抑制剂 载体 用于制备微粒制剂 混合胶体和包衣制剂等 这些药剂可适当避免肠胃 道p h 环境和酶对生物药物的降解 鉴于壳聚糖的诸多特点 已广泛用于非病毒 5 第一章绪论 载体领域 h 图1 4 壳聚糖结构 m u m p e rr j 等首次将壳聚糖与d n a 混合 制备出壳聚糖 d n a 复合物 该 复合物颗粒尺寸与壳聚糖的分子量有关 其他研究组发现 复合物粒子尺寸也 取决于壳聚糖与d n a 的配比 常表示为氮一磷比 u p 在5 5 p h 5 5 的硫酸钠溶液中进行壳聚 d n a 的复合 发现硫酸钠的浓度变化不影响复合物尺 寸大小 氮一磷比为3 8 时 复合物粒径在1 5 0 2 5 0 纳米之间 质粒d n a 片 段的多少 5 1 11 9 k b 不影响复合物尺寸 4 研究表明壳聚糖 d n a 复合物可有效 保护d n a 不受核酸酶的降解 用分子量低于1 0 5 d a 的壳聚糖与d n a 复合 形 成1 0 0 2 0 0 纳米复合物 在有血清的条件下 有效转染c o s 1 细胞 壳聚糖 d n a 复合物也用于口服转染小鼠肠道上皮细胞 表达a r a b 2 蛋白 同时 壳聚糖 d n a 复合物也可用于人胚胎肾细胞 h e k 2 9 3 和肝癌细胞 h e p g 2 的转染 1 2 3 2 脱氧胆酸改性壳聚糖衍生物 脱氧胆酸是胆汁酸的主要成分 在水中可以自缔合形成胶束 l e e 等将胆酸 引入 对壳聚糖进行改性 研究发现当脱氧胆酸改性的壳聚糖浓度超过临界缔 合浓度 c a c 时 呈现自缔合体 l e e 使用脱氧胆酸改性壳聚糖包载阿霉素 a d r 进行药物释放研究 1 5 a d r 物理包埋于自缔合体内 冻干后由原子力显微镜观 察包载a d r 的自缔合体呈球状 通过荧光实验发现 a d r 的释放非常缓慢 这 是因为脱氧胆酸构成自缔合体内疏水的刚性内核 限制了包载的a d r 的移动 导致释放缓慢 l e e 等将脱氧胆酸疏水改性的壳聚糖用作非病毒载体 白缔合体的外壳带正 电 与带负电的d n a 结合 经琼脂糖凝胶电泳阻滞条带实验证实可形成复合物 m 该复合物可有效转染c o s 1 细胞 转染效率高于裸d n a 高的转染效率很可 能是由于壳聚糖疏水性的提高扰动了细胞膜磷脂层 易于基因的转运 6 第一章绪论 1 2 3 3 棕榈酰化改性壳聚糖衍生物 同脱氧胆酸改性类似 棕榈酰化改性亦增加了壳聚糖的疏水性 u c h e g b u t 7 等将棕榈酰基引入水溶性的乙二醇化壳聚糖中 由于棕榈酰基间的疏水作用 冷冻干燥后可形成非共价键交联水凝胶 所形成的产物凝胶有较大的孔隙度 和很好的水合能力 可以吸收相当于自身质量2 0 倍的水分而不产生明显体积变 化 这些特性使得这一软湿材料适用于口腔内用药 在药物释放方面 由于水 凝胶是物理交联 可以控制其疏水程度来改变凝胶的微结构 网眼尺寸 控制 药物的释放 其另一优点是释放完药物后 可以逐渐消蚀降解 不用再次取出 载体 u c h e g b u 等又将棕榈酰化乙二醇壳聚糖 g c p 季铵盐化 8 得到聚皂一 季铵盐化棕榈酰乙二醇壳聚糖 g c p q 用甲基橙和芘研究g c p q 聚合物水溶 液中胶束的疏水微区 疏水缔合使得g c p q 在高浓度下会形成凝胶 此时芘溶 解于分子链内胶束的疏水区域里 将g c p q 稀释到溶液状态且保持胶束形态 芘也仍处于溶解状态 研究还表明g c p q 具有良好的血液相容性及无细胞毒性 使其在体内药物和基因释放应用方面有着广阔的应用前景 1 2 3 4 烷基化壳聚糖 a c s 衍生物 刘文广等 9 将壳聚糖烷基化 使得不同长度的烷基侧链 丁基 辛基 十二 烷基 十六烷基 引入壳聚糖 荧光光谱研究发现 丁基壳聚糖 4 c s 和十 二烷基化壳聚糖 1 2 c s 在酸性条件下均发生自缔合 临界自缔合浓度c a c 分别 为7 2 4 1 0 刁毫克每毫升和2 3 4 x1 0 3 毫克每毫升 而脱乙酰度接近1 0 0 的壳 聚糖并未发生自缔合 由于1 2 c s 的烷基侧链疏水性更强 其c a c 值略低 自 缔合更容易在低浓度下发生 烷基化壳聚糖被应用于转基因中 l o 刘文广等通 过酶解实验发现十二烷基化壳聚糖与d n a 复合后有效保护d n a 不受核酸酶降 解 而裸d n a 则被酶解成碎片 见图1 5 这可能是由于长链疏水烷基的引 入对d n a s e 的渗透有阻碍作用 通过琼脂糖凝胶电泳证实了烷基化壳聚糖与质 粒d n a 作用形成复合物 当壳聚糖与d n a 的电荷比大于l l 时 复合物条带 不再迁移 表明复合物充分形成 而烷基化壳聚糖与d n a 正负电荷比大于l 4 时 条带即滞留于孔中 说明烷基化壳聚糖与d n a 的复合更为有效 可用更少 的烷基化壳聚糖充分复合住d n a 第一章绪论 o 8 0 7 0 6 8 0 5 o 4 0 3 o 2 0 1 o1 02 03 04 05 06 0 t i m e m i n 图1 5 在含有d n a s e 的p b s 溶液中 d n a 在2 6 0 纳米处吸光度的变化与时间的关系 用烷基化壳聚糖同质粒d n a 含氯霉素乙酰转移酶报告基因 复合 并转 染c 2 c 1 2 细胞 小鼠成肌细胞 壳聚糖基载体的转染率比裸d n a 转染率高4 倍左右 而烷基化壳聚糖的转染率随着烷基链长度的增加进一步提高 直到烷 基侧链碳原子数为8 时趋于稳定 推测疏水烷基的引入有助于形成复合物 同 时减弱了壳聚糖与d n a 复合物的静电相互作用 使得复合物在细胞内更容易解 离 增加基因的表达 1 2 3 5 壳聚糖其他衍生物 t h a n o um l2 等用季铵化的壳聚糖 三甲基壳聚糖 寡聚体 d n a 复合物转染 c o s 1 细胞 荧光素酶表达水平高于未修饰的壳聚糖 d n a 复合物 且在含血清 的培养液中依然有稳定的表达能力 细胞毒比脂质体低很多 将半乳糖连接到壳聚糖上 可靶向转染肝细胞 该细胞表达脱唾液酸糖蛋白 受体 p a r k 掣1 3 将半乳糖改性的壳聚糖 接枝 葡聚糖 d n a 复合物应用于肝细胞 的基因转染中 结果表明葡聚糖的接枝提高了复合物在水中的稳定性 并且有 效的转染肝细胞 有望用于肿瘤治疗 聚乙二醇 p e g 是常用的改性剂 用于增加亲水性 将p e g 引入壳聚糖 8 第一章绪论 中可有效延长复合物的体内血液循环滞留时间 p e g 改性的壳聚糖也同样具有 高的转染效率 1 2 4 温敏性转基因载体 1 2 4 1 热敏脂质体 热敏脂质体又叫温度敏感脂质体 当温度高于生理温度时实现药物释放于 靶向部位 其原理是脂质体中的磷脂具有相转变特性 存在相变温度f i e 温度 低于t c 时 脂质体保持稳定 温度达到并超过t c 时 磷脂分子由原来排列紧密 的全反式构象变为结构疏松的歪扭构象 脂质膜由 凝胶态 转到 液晶态 结构 膜的流动性和通透性增加 利于药物释放 利用这一原理 可在肿瘤或 局部感染病灶部位升温 温度高于相变温度导致局部包载的药物快速释放 制备热敏脂质体的材料有合成磷脂 高分子聚合物和天然磷脂 合成磷脂 一般以二棕榈酰磷脂酰胆碱 d p p c 为主 通过加入其他不同碳链长度的磷脂来 调节脂质体膜的释放特性 d p p c t i n 4 1 通常与二棕榈酰磷脂酰甘油 d p o g t m 4 1 按一定比例混合以得到不同的t m 由于合成磷脂的纯度高 脂酰基的烃链长度基本一致 受热时分子运动规律相近 因此有比较固定的相 变温度 但合成磷脂的制备工艺复杂 成本高 由此限制了热敏脂质体在临床 上的推广应用 为此 科学家试图用合成的廉价高分子材料替代合成磷脂 制 备具有热敏性的类脂泡囊 体外试验表明这类高分子类脂小囊具有良好的热敏 性 但生物相容性和生物可降解性稍差 天然磷脂也可作为制备热敏脂质体的 材料 但是组成天然磷脂的脂酰基的烃链长短不一 形成脂质体时这些烃链容 易互相嵌合 亦会排列成致密整齐的磷脂双分子膜 阻碍内水相中小分子物质 的跨膜扩散 天然磷脂亦没有固定的相交温度 仅有一个较宽的 相变矩 可以 选择在脂质体膜中加入一些烃链长度适宜的合成高分子材料 改善脂质体膜的 通透性 调节整体的相变温度 使热敏脂质体膜 相变矩 的最低点高于体温 以 保证热敏脂质体的靶向释药 热敏脂质体目前已被尝试用于包载大分子物质 抗生素以及抗肿瘤药物等 其缺陷在于当注入体内时易被网状内皮系统 r e s 捕 获 病变部位的聚集很被动 特异性很有限 一旦加热时间过长将造成组织损 伤 脂质体的稳定性和包载效率也不尽如人意 近年来出现的新型热敏脂质体在以上方面作了改进 m a r u y a m ak 等将神经 节苷脂 g m i 引入阿霉素热敏脂质体表面 明显增加了药物的血循环时间 同时 使药物在体内的分布变化 傅希彭等开发出可脱水贮存的热敏脂质体并定量的 研究其药物包载率 t c 及脂质体脱水处理后的结构完整性 v i r o o n c h a t a p a ne 等 9 第一章绪论 制各了磁性热敏脂质体 通过电磁加热使脂质体在外水相3 7 的条件下本身达 到t c 而迅速释放药物 这种方法有效减轻了对正常组织的热损伤 1 2 4 2 聚异丙基丙烯酰胺 p p m 基载体 聚异丙基丙烯酰胺 p n i p a a m 是典型的温敏性聚合物 在其低临界溶解 温度 l c s t 在3 2 3 4 以下溶于水 高分子链段呈无规线团状结构 温度 高于l c s t 时 p n i p a a m 发生溶胶一凝胶转变 分子链段呈密实小球结构 利 用这一特性 可有效的利用温度调控p n i p a a m 的分子链 达到包载一释放的目 的 p n i p a a m 已被广泛地应用于温敏性药物释放体系 温度控制调控细胞吸附 和分离 以及温敏性分离膜等t 将p n i p a a m 引入可与d n a 相互作用的大分子载体 如阳离子聚合物等 即可构建温敏性转基因载体 h e n n i n k 掣1 4 将异丙基丙烯酰胺与n n 甲基 胺乙基 甲基丙烯酸酯的共聚物 p n i p a a m c o d m a e m a 作为温度和p h 值 响应的基因治疗载体 d m a e m a 负责与d n a 静电作用相结合 的含量虽然 只有1 5 常温时共聚物仍然可以与d n a 复合良好 光散射实验证实复合物形 成了沉淀 合理的解释是共聚物l c s t 较p n i p a a m 降低 常温时更容易疏水聚 集 复合物的转染效率低于p e i 实验发现复合物的粒径尺寸和z e t a 电位对转 染结果影响很大 形成稳定的粒径2 0 0 纳米的复合物对成功转染是很必要的 降低复合物的z e t a 电位使得转染效率和细胞毒性都减小 y o k o y a m a 等 1 5 将疏水 共聚单元甲基丙烯酸丁酯 b m a 引入到p n i p a a m c o d m a e m a 体系 提高 了与d n a 的结合力 琼脂糖凝胶电泳显示 当温度高于l c s t 时 复合物中的 d n a 完全滞留在孔中 当温度低于l c s t 时 d n a 部分解离 应用不同的控温 路线研究复合物对c o s 1 细胞的转染 温度的变化可有效调控基因的释放与表 达 其他研究组将异丙基丙烯酰胺引入阳离子聚合物体系 均发现适当地降低 细胞的温度可使p n i p a a m 链段呈松散的线团状 使得d n a 从载体中解离或暴 露 并提高转基因效率 p i s k i n 等 1 6 将羧基封端的p n i p a a m 与分子量2 k d a 的 p e 偶连 使得总体l c s t 升高到3 7 左右 z e t a 电位 3 1n 2 1 3 之间 比 纯p e i 降低许多 使用支化的高分子量p e i 制备时 复合物拥有更高的z e t a 电 位 a l e x a n d e r 等旧通过荧光光谱 凝胶电泳 动态光散射及原子力显微镜等手 段 发现共聚物及复合物的尺寸与形态随温度在l c s t 上下变化而变化 用了共 聚焦显微镜研究复合物d n a 进入细胞核的情况 发现绿色荧光蛋白报告基因的 表达并不高 l o 第一章绪论 1 2 4 3 壳聚糖一异丙基丙烯酰胺 月桂酸乙烯酯 p n v l c s 共聚物载体 刘文广等 埽 通过化学合成方法合成两亲性壳聚糖一接枝一异丙基丙烯酰胺 月桂酸乙烯酯 p n c s 共聚物 结构式见图1 6 并考察p n v l c s 共聚物 的温度敏感性 通过多种物理化学方法探讨温度敏感p n v l c s 共聚物 d n a 复 合物的形成和演变 研究复合物中d n a 的构象变化和复合物的稳定性以及温度 对其的影响 d n a 在与共聚物载体p n v l c s 形成聚电解质复合物时 d n a 由b 型构象转变为c 型构象 p n v l c s 倾向与d n a 的小沟区域结合 p n v l c s 与 d n a 形成的复合物的粒径因电荷比的不同而异 在较低p n v l c s d n a 电荷比 时存在裸露d n a 在高电荷比下形成小尺寸纳米颗粒 形态为均一小球状 温 度变化可引起共聚物载体的相转变 并影响到与d n a 的结合程度 当温度低于 l c s t 2 0 时 载体高分子网络亲水 呈松散结构 载体与d n a 之间的作 用相对较弱 当温度高于l c s t 3 7 时 共聚物载体链段变得疏水 紧密 包裹并保护d n a c h 2 一 i 一 c m l i o c 弋 sc i 1 2 图1 6p n v l c s 化学结构式 o p n v l c s 成功地将p t r a c e r t m c m v b s d i a c zv e c t o r 质粒转入c 2 c 1 2 细胞内 转染效率受复合物质量比影响 单纯壳聚糖载体的转染效率比裸质粒d n a 的转 染效率高4 5 倍 而温度敏感p n v l c s 共聚物载体的转染效率可由温度控制进 一步提高 当基因转入细胞后 降低温度至l c s t 以下 载体网络形成松散的线 团结构 有助于d n a 从复合物中解离 u n p a c k i n g 并促进基因的表达 o j 矗 e b 8 2 2 2 3 h h h h h j l o iicii cilc 上ylc 第一章绪论 1 2 4 4 聚异丙基丙烯酰胺 p n i p a a m 一聚精氨酸 p a r g 载体 刘文广掣1 9 通过自由基聚合反应和偶联反应制备了聚异丙基丙烯酰胺一聚 精氨酸缀合物 p n i p a r g 通过f t i r 和1 3 cn m r 实验证实了偶联产物 由浊 度法测定了缀合物水溶液的l c s t 为3 5 2 小于3 7 聚异丙基丙烯酰胺 的l c s t 为5 2 左右 引入亲水性聚精氨酸明显提高其相转变温度 p n i p a r g 缀合物与质粒d n a 通过静电作用形成复合物 呈现均一球状形态 复合物粒径 受复合质量比的影响 当质量比 p n i p a r g d n a 为1 0 1 时 粒径最小 载 体与d n a 的作用对其构象影响较小 圆二色谱观察到d n a 的构象无明显变化 当温度低于l c s t 3 5 2 时 载体链段与水分子形成氢键 结构松散 不能 紧密地包裹d n a 当温度高于l c s t 如3 7 时 载体和水分子之间的氢键 断裂 高分子链段发生聚集 形成密实的疏水网络 将d n a 紧密包裹使其不受 核酸酶降解 提高了复合物的稳定性 以绿猴肾c o s 1 细胞为宿主细胞 利用 聚精氨酸和温度敏感p n i p a r g 为载体 对含有可表达荧光素酶 1 u c i f e r a s e 和 绿色荧光蛋白 g f p 的质粒p g l 3 和p e g f p c 1 进行了成功的体外转染实验 其转染效率明显高于裸d n a 同脂质体相当 同时改变温度可以调控基因的表 达 转染后 培养温度短暂低于l c s t 时的转染效率优于恒温 3 7 培养的 细胞的转染效率 见图1 7 同时m t t 比色实验发现p n i p a r g 载体在适当的浓 度下对细胞有增殖作用 o 叫 州o mp k g lp a r e 2 州p 吲州脚2 附p r i p p 岍 r 口 雕p 喝5 蹦p 帅 p 岍椰一 v e c t o r s 一 e 3厂i笛一m 时 io 州u l 第 章绪论 图l 7p a r g 和p n i p a r g 载体在不同控温路线下对c 2 c 1 2 细胞的转染效率 其中p a r g l p a r 9 2 分别代表p a r g 和d n a 复合的质量比为1 1 2 1 p n i p a r g l 7 代表p n i p a r g 和d n a 复合 的质量比为2 l 3 1 5 l 6 l 8 1 1 0 1 2 0 1 1 2 4 5 聚异丙基丙烯酰胺 p n i p a a m 丙烯胺共聚物 p n i a a m 及其胍基 化衍生物 p n i a a m g 载体 刘文广等 2 0 制备了异丙基丙烯酰胺一丙烯胺共聚物 p n i a a m 及其胍基 化衍生物p n i a a m g 胍基化过程如图1 8 所示 核磁检测证明了共聚物的生 成和胍基的引入 p n i a a m 和p n i a a m g 共聚物溶液具有温敏特性 l c s t 随a a m 含量及胍基化程度的增大而升高 最低l c s t 为3 8 进一步研究表 明 这些载体可有效复合d n a 复合比较大时呈纳米球状 尺寸在5 0 2 5 0 纳 米之间 增加a a m 组分含量使载体与d n a 作用增强 胍基衍生物复合效果弱 于母体共聚物 各载体复合d n a 的能力为 p n i a a m 1 3 p n i a a m g1 3 p n i a a m1 一l p n i a a m g1 1 这里1 3 1 2 代表异丙基丙烯酰胺与丙烯胺的 加料摩尔比 温度升高对于l c s t 相对较低的1 1 系列聚合物的复合效果影响 较为明显 这与分子内部链段的塌陷使复合物变得更加密实有关 斗扯阁 h 3 c c h c 卜b c h 3 睇毋 脒0 3 h n 乒 n h 2 塑王 斗字一7 l f 士 匕 6 o6 h 3 7 c h h h 3 c c h c h 3 n h i n 卜i 图1 8p n i a a m 中氨基的胍基化反应 在体外的转染实验中 p n i a a g gl 3 共聚物载体成功地将p g l 3 质粒转入 c o s 1 细胞内 转染率比裸d n a 高1 0 0 4 0 0 倍 比p e i 高l 一5 倍 具备良好 的耐血清能力 血清条件下转染甚至优于无血清情况 有望通过调控l c s t 进一 步提高其体外转染率 第一章绪论 1 2 5 其它非病毒载体 除以上典型的非病毒转基因载体外 聚一l 赖氨酸 p l l 介导的基因释放系统 树状高分子载体 以及基于抗体的靶向基因传递系统均可用于非病毒载体的基 因治疗当中 再此不再详述 1 3 基于氢键与d n a 作用的非病毒载体 随着近年来非病毒载体 特别是阳离子型载体的深入研究 科学家发现阳 离子载体并不一定对基因转染起到正面作用 阳离子载体容易与血液成分和非 靶向组织相互作用 导致在血液中循环能力差 低的靶向性 甚至是细胞毒性 1 2 1 2 4 1 同时又有报道称聚电解质复合物包载d n a 过于紧密以至于复合物进入细 胞后d n a 不能顺利的逃逸出来 导致低的转染效率 1 8 2 5 2 6 基于这些阳离子 转基因载体的缺陷 近凡年萌发了设计并合成基于非静电作用的转基因载体的 新思路 即抛弃传统的类阳离子载体的电荷作用复合d n a 机制 设计新型的非 电荷作用的转基因载体 关于这方面的研究与阳离子载体进展相比相对较少 2 7 1 3 1 裂皱菌多糖 s p g 转基因载体 迄今为止 在非电荷作用转基因载体领域中最为重要的尝试是采用裂皱菌 多糖 s p g z 8 3 0 作为聚核苷酸的载体 见图1 9 通过表征 s p g 在水中呈 现三螺旋结构 而在二甲基亚砜中螺旋解开 单链 s s p g 呈无规线团结构 研究表明 s s p g 可以与p o l y c p o l y a p o l y u p o l y d a 和p o l y d t 等d n a 链通过氢键形成大分子复合物 3 l 3 2 利用这些性质 单链裂皱菌多糖 s s p g 鳓和侧链修饰的s s p g 3 4 3 5 成功的将反义寡聚核苷酸转入了细胞 但是s p g 有 着其固有的缺陷 即不能与双链d n a d s d n a 形成氢键 因此无法用于d s d n a 的转染中 为了拓展裂皱菌在转基因中的应用 n a g a s a k i 等采用阳离子修饰的 s p g 来复合双链质粒d n a 但这里面的d n a 复合机制是基于电荷作用的 1 3 6 a n a d a 等在编码有s i r n a 的双链d n a 两端引入环状p o l y d a 8 0 来模拟病毒的基 因组 并用转移活化蛋白修饰过的s p g 与环状p o l y d a 8 0 复合 并有效的提高 了r n a 干扰效应 3 7 这里面的复合机制是电荷作用与氢键作用协同进行 1 4 第一章绪论 r 0 c 1 d c h 及其 b 三螺旋结构 盥0 铽o h 链o h 一h s 敞ho h 镰 圈 0 太环糖类结构 另一项重要的尝试来自于对具有大环结构糖类纳米粒子的探索 其结构如 婷 第一章绪论 图1 1 0 研究表明 这一类粒子在水中形成糖一磷酸氢键作用 3 8 3 9 1 并可以牢 牢复合双链d n a l 4 0 1 这些纳米粒子可以有效的将质粒d n a 沉淀为类病毒的 紧密包裹的粒子 具有单核结构 良好的电荷屏蔽作用 并成功的转染了h e l a 细膨4 1 1 和h e p g 2 细胞 4 2 1 事实上 这是真正意义上基于非电荷作用的基因转染 的开端 1 4 论文工作的提出 d n a 碱基中富含氢键供体和受体 可有效的通过氢键作用识别并作用于目 标分子 这一特性启发我们设计一种新型非病毒转基因载体 该载体通过非电 荷作用 氢键作用 与d n a 的碱基对结合 达到复合d n a 的目的 k o m i y a m a 等报道聚 2 乙烯基 4 6 二氨基 1 3 5 三嗪 p t 可在水中有效识别 核酸碱基及其衍生物 v d t 单体可与尿嘧啶和胸腺嘧啶形成三氢键作用 与腺 嘌呤形成二氢键 与鸟嘌呤形成单氢键作用 用v d t 制各的聚合物可以增大水 中的非极性微环境 有利于氢键的形成 t 4 3 近年来 p v d t 被用于高分子印记 领域 研究表明v d t 残基和d n a 的腺嘌呤一胸腺嘧啶 a t 碱基对形成三氢键作 用 如图1 1 1 所示 目前还没有基于p v d t 的非病毒载体的报道 很可能是 由于其不易溶于水和有机溶剂的原因 nv d t l n 公n a d e n i n e t h y m i n e 图l l1v d t 单体与d n a 的腺嘌呤一胸腺嘧啶 a t 碱基对形成三氢键作用 本论文的主要工作将从以下几个方面展开 将p v d t 应用于基因治疗领域 以开辟基于氢键作用的非病毒载体研究新领域 1 6 第一章绪论 1 首先要改进p v d t 的水溶性 使之既能有效的复合d n a 又具有一定的水溶 性来支持体外的细胞转染 为此采用生物相容性好的乙烯基吡咯烷酮 v p 作为共聚单体与v d t 共聚 对产物进行分子量和共聚比等表征 2 通过多种物理化学方法探究p v d t 基载体 d n a 复合物的形成和演变 如最 佳复合比 p v d t 对d n a 的作用 复合物形态 尺寸 稳定性 对d n a 的 保护作用等 3 将p v d t 基载体 d n a 复合物用于对c o s 1 细胞的转染中 采用荧光素酶 l u c i f e r a s e 和增强绿色荧光蛋白e g f p 两种报告基因 考察转染效率及细胞 毒性 第二章p v d t 基非病毒转基因载体的制备和表征 第二章p v d t 基非病毒转基因载体的制备和表征 2 1 引言 本章的主要目的是合成水溶性好的p v d t 基转基因载体 为此 将乙烯基 吡咯烷酮 v p 作为共聚单体与v d t 通过自由基无规共聚的方法合成高分子共 聚物 以增加其亲水性 为了便于比较 亦合成了水溶性p v d t 和p v p 均聚物 2 2 实验部分 2 2 1 实验药品 2 一乙烯基一4 6 一二氨基一l 3 5 一三嗪 v d t t o k y ok a s e ik o g y o 公司 l 一乙烯基一2 一吡咯烷酮 v p m e r c ks c h u c h a r d t 公司 偶氮二异丁睛 a j b n f l u k a 公司 二甲基亚砜 d m s o 分析纯