（发酵工程专业论文）赭曲霉毒素a和黄曲霉毒素b1的超微量免疫分析.pdf

摘要 目的 摘要 采用时间分辨荧光免疫分析 t r f i a 技术 建立赭曲霉毒素a o t a 和黄曲霉 毒素b l a f b 的高灵敏的t r f l a 的检测方法 并研制具有我国自主知识产权的快速 灵敏的0 t a t r f i a a f b 一t r f i a 检测试剂盒 提高我国在毒素超微量免疫检测的水 平 解决我国农产品安全检测方面的一些迫切要求 应对国际上技术壁垒的挑战 方法 1 0 t a 的t r f i a 研究 首先采用碳二亚胺法 制备人工抗原o t a k l h 以o t a k l h 免疫 大白兔制备多克隆抗体 以0 t a b s a 免疫b a l b c 鼠 制备抗o t a 单克隆抗体 选择包 被浓度 标记条件 反应步骤 反应方式 配制增强液 洗液 编制全自动操作软件 j 以稀土离子e u 标记的羊抗兔抗体进行示踪 建立多克隆抗体间接竞争0 t a t r f i a 以 稀土离子e u 标记的羊抗鼠抗体进行示踪 建立单克隆抗体间接竞争o t a t r f i a 组建 0 t a t r f i a 检测试剂盒 按照标记免疫试剂要求 分别对0 t a t r f i a 试剂盒进行灵敏度 精密度 准确度 回收率 特异性 稳定性考核 应用0 t a t r f i a 试剂盒检测国际质 控 并与进口的0 t a e l i s a 试剂盒进行对照 2 a f b 的t r f i a 研究 将a f b 一b s a 免疫新西兰大白兔得到抗a f b 多克隆抗体 用黄 曲霉毒素b 与辣根过氧化酶的联结物 a f b 一h r p 包被9 6 孔板为固相抗原 以稀土离 子e u 标记的羊抗兔抗体进行示踪 采用间接竞争免疫分析方法建立a f b 一t r f i a 组建 a f b 一t r f i a 检测试剂盒 对其进行考核 并与e l i s a 试剂盒进行对照 结果 1 制备了可以用于免疫和筛选的0 t a k l h 人工抗原 得到了抗o t a 多克隆抗体和单 克隆抗体 采用d t t a 法 制备了e u 一羊抗兔抗体和e u 一羊抗鼠抗体 配制了所有的 相关试剂 编制了全自动的分析软件 组建了o t a t r f i a a f b 一t r f i a 检测试剂盒 2 应用多克隆抗体建立的0 t a t r f i a 方法的灵敏度为o 0 2pg 几 测量范围为o 0 2 i lg 几一4 0 0ug 几 批内和批间变异分别为2 6 和5 2 平均回收率为9 5 8 0 t a t r f i a 的效应点值e d 8 0 e d 5 0 e d 2 0 分别为o 1 9 5 9 l 1 0 1 8 9 几和5 3 1 4 9 l 3 应用单克隆抗体建立的o t a t r f i a 方法的灵敏度为o 0 3ug l 测量范围为0 0 3ug 几一1 0 0 0ug l 批内和批间变异分别为3 7 和5 3 平均回收率为9 4 2 间接竞争 江南大学博士学位论文 0 t a t r f i a 的效应点均值e d 8 0 e d 5 0 e d 2 0 分别为o 3 3 o 0 2ug 几 1 4 4 o 0 8ug 几 和5 2 2 o 1 2 ug 几 样品经t r f i a 和进口的e l i s a 试剂盒同时检测o t a 两者的相关系 数为o 9 2 5 结果相符 4 0 t a t r f i a 试剂盒测定英国环境食品和农产品部中心科学实验室提供的o t a 质控 结 果为理论靶值的o 9 4 一1 1 4 符合0 5 6 一l 4 4 之间的要求 说明o t a t r f i a 可以用于谷物 中o t a 的检测 5 应用多克隆抗体建立的a f b 一t r f i a 方法的灵敏度达到o 0 0 3 9ug 几 a f b t r f i a 的 效应点均值e d 8 0 e d 5 0 e d 2 0 分别为o 0 3 4 o 0 0 4ug l o 1 6 0 0 o l lug l 1 0 4 8 o 1 7 0ug 几 方法的批内 批间变异系数平均为4 9 和8 9 平均回收率 为9 7 2 a f b 一t r f i a 和a f b 一e l i s a 试剂盒同时检测样品 两者的相关系数为0 9 1 7 说明结果相符 6 采用加速实验的方法考核o t a t r f i a a f b 一t r f i a 试剂盒 其有效期可在一年以上 而且可以耐受夏天高温的邮寄 结论 1 研究表明 国内外首先报导的o t a t r f i a 是目前o t a 检测中最灵敏的方法之一 该 分析方法稳定性好 可测范围宽 大大好于o t a e l i s a 商品化试剂盒 测定英国环境 食品和农产品部中心科学实验室提供的o t a 质控 结果高度符合 可以用于谷物中o t a 的实际检测 具有很好的应用前景 2 a f b 一t r f i a 是目前报导的a f b 检测中最灵敏的方法之一 该分析方法稳定性好 灵敏 度和测量范围都高于a f b 一e l i s a 商品化试剂盒一个数量级 将a f b 检测提高到一个新的 高度 3 研制的具有我国自主知识产权的高灵敏 快速o t a t r f i a a f b 一t r f i a 检测试剂盒 盒经过考核 各项指标符合标记免疫试剂的要求 完成了产业化转化的应用基础研究 进行了工艺设计 具有很好的应用前景 关键词赭曲霉毒素a 0 t a 黄曲霉毒素b a f b 时间分辨荧光免疫分析 t r f i a 真菌毒素 抗体 v l i i 摘要 a b s t r a c t p u r p o s e n ea i mo ft 1 1 i sw o r ki st op r 0 d ea1 1 i g h ys e n s i t i v et e s t i n gm e t h o df o r t h ed e t e n l l i n a t i o no f o c h r a t o x i na 0 t a a n da n a t o x i nb l a f b l b ya d o p t i n gt h et e c h n o l o g yo ft i m e r e s o l v e d n u o r o i m m u n o a s s a y t r f i a n l i sw o r kd e v e i o pr 印i da n ds e n s i t i v e0 t a t i u i aa 1 1 d a f b l t r f i ai m m u n o a s s a yl i t sm a th a v eo u ro w ni n d e p e n d e mi n t e l l e c t u a lp r o p e r t yr i g h t s s o 船t oe 1 1 l l a l l c et h el e v e lo f t o x i n si i i m u n o a s s a yo f o u rc o u n t 阱m e e t t h eu r g e n tn e e d sr e g 盯d i n g i n s p e c t i o no fa 鲥c u l n l r a lc o n l m o d i t i e sa n dc h a l l e n g em ei n t c m a t i o n a l t e c h n i c a lb 枷e r s m e t h o d 1 t h ei m m u n o g e n c o n j u g a t i o no fo t aw i t hk l hw e r ep r e p a r e d r a b b i t sw e r ei m m u i l i z e d l l s i n g0 t a k l ht op r o d u c ep o l y c l o n a l 卸t i b o d i e s m i c ew e r ei m m u n i z e du s i n go t a b s a t op r o d u c em o n o c l o n a l 姐t i b o d i e s o p t i m 哪o t a b s ac o n c e n t r a t i o nf o rc o a t i n gm i c r o p l a t c l a b e l l i n gc o n d i t i o n a s s a yp m c e d u r e sw e r es e e c t t h ee i l 王l a n c e m e n ts o l u t i o na n dw a s h i n g s o l u t i o nw e r ep r e p a r e d t h ef i l l l ya u t o m a t i cm a n i p u l a t i o ns o f h a r ew e r ec o m p i l e d i ni n d i r e c t 0 1 1 a t r f i af o r n l a tb yp o l y c l o n a ia n t i b o d i e s g o a ta n t ir a b b i ti g g e u c o n j u g a t ew a su s e dt o e n a b l ed e t e c t i o n i ni n d i r e c to t a t r f i af b 肌a tb ym o n o c l o n a la n t i b o d i e s g o a ta 1 1 t im i c e l g g e u 3 c o n j u g a t ew a su s e dt oe n a b l ed e t e c t i o n t h eo t a t r f i a t s v e r ed e v e l o p e d 1 1 1 e s e n s i t i v i 吼p r e c i s i o n a c c u m c y r c c o v e r yr a t e s p e c i f i c n ya n ds t a b i l i t yo fm eo t a t r f i ab t s w e r ee x 锄i n e di na c c o r d a n c ew i mt h er e q u i r e m e n t so fl a b e l l i n gi m m 岫o a s s a yr e a g e m t h e o t a t r f i al i t sw e r ec o m p a r e dw i t ht l l ei m p o r t e de l i s ak i t t h ek i t sw e r eu s e dt ov e r i f y m ev a l i d i t yo fi n t e m a lq u a l i t yc o n t m ls a m p l e s 2 r a b b i t s 牝r ei m m u n j z e du s i n ga f b i b s at op r o d u c ep o l y c l o n a la n t i b o d i e s i ni n d i r e c t a f b l t r f i af o m l a t a n a t o x i n sb l h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e a f b l h r p c o a t i n go nw e l l s a g o a ta n t i r a b b i ti g ge u j c o 巧u g a t ew a su s e dt oe n a b l ed e t e c t i o n t h ea f b l t r f i ak i tw a s d e v e l o p e d t h es e n s i t i v i 畎p r e c i s i o n a c c u r a c y r e c o v e r yr a t e s p e c i f i c i t ya n ds t a b i l i t yo ft h e a f b l t r f i ak j tw e r ee x a m i n e d t h ea f b l t r f i ak i tw a sc o m p a r e dw i t l lt h ee l i s a k i t r e s u l t s 1 t h ei m m u n o g e n o t a k l hw a sp r e p a r e d t h ep o l y c l o n a la i t i b o d i e sa 1 1 dm o n o c l o n a l a m i b o d i e sw e r eg o t ag o a ta i l t im i c ei g g e u j c o n j u g a t ea n dg o a ta n t ir a b b i ti g g e u w e r e p r 印a r e d b yd t t am e m o d af b j l ya u t o m a t i ca i l a l y s i ss o n w a r ew a sc o m p i l e d 0 t a t r f i a a n da f b l t r f i ak i t sw e r ed e v e l o p e da n de x a m i n e dr e s p e c t i v e l y 2 t h er e s l l i t ss h o wt i l a ti nt h eo t a t r f i ab yp o i y c i o n a ia i l t i b o d i e s t h e0 1 ad e t e c t i o ni i m i t w a s0 0 2 u g lf o ri n d i r e c tc o m p e t i t i v et r f i af o m l a t s t h ea s s a yr a n g e sf r o mo 0 2 肛 lt o 4 0 0 肛g l t h ew i m i n m na n db e t w e e n m nc v so ft h eo a t r f i aw e r e2 6 a 1 1 d5 2 l x 江南大学博士学位论文 r e s d e c t i v e l vt h em e a j lr e c o v e r i e sw e r e9 5 8 t h e8 0 5 0 2 0 i i l l l i b i t i o nb i n d i n ge 腩c t d o s e e d 8 0 e d 5 0 e d 2 0 o f o t aw e r eo 1 9 5 肛e l 1 0 18 肛g 几a n d5 31 4 p g l r e s p e c t i v e ly 3 i ni n d i r e c t0 t a t r f i ab ym o n o c l o n a la i l t i b o d i e s t h eo t ad e t e c t i o nl i m i tt ob e0 0 3 肛g l f o ri n d i r e c tc o m p e t i t i v et r f i af o m a t s t h ea s s a yr a n g ew a s0 0 3 g l 一1 0 0 0 g l t h e w i m i n r u na 1 1 db e t w e e n r u nc v so fm ec 1 a t r f i aw e r e3 7 a n d5 3 r e s p e c t i v e ly t h e m e a i lr e c o v e r i e sw e r e9 4 2 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i o n1 i m i tt ob e0 0 0 3 9 u g lf o ri n d i r e c t c o m p e t i t i v et r f i af o m a t s t h ee d 8 0 e d 5 0 e d 2 0o fa f b lw e r eo 0 3 4 士o 0 0 4 p g l 0 1 6 0 士o 0 1 1 g la n d1 0 4 8 土o 1 7 0 g l t h ew i t h i n r u na n db e t w e e n r u nc v so f t h ea f b l t r f i aw e r e4 9 a 1 1 d8 9 r e s p e c t i v e l y t h em e a nr e c o v e r i e so fs a m p l e sw e r e9 7 2 t h e c o r r c l a t i o nc o e m c i e n to fa f b l t r f i aa i l da f b l e l i s ak i t sw a so 9 1 7 w h i c hs h o w st h e c o n f b n l l i t vo f t e s tr e s u l t s 6 t h ea c c e l e r a t e dt e s t i n 2m e t h o ds h o wt h a tt 1 1 ev a l i d i t yp e r i o ds h o u l db eo v e r1y e a ra j l d c a nw i t h s t a n dt h eh i g ha m b i e n tt e m p e r a t u r eo fs u m m e rw h e nt h ek i ti sd e l i v e r e db ym a i l c o n c i u s i o n 1 t h es t u d i e ss h o wt h a t0 t a t r f i ai so n eo ft h em o s ts e n s i t i v em e t h o d sf o r0 t ad e t e c t i o n e v e rr e p o r t e ds of a lt h i sa p p m a c hi sf e a t u r e da si d e a li ns t a b i l i t y w i d ei nm e a s u r a b l es c o p e a 1 1 d a p p l i c a b l ef o r1 a r g eq u a j l t i t ya s s a yo p e r a t i o n t h u sm u c hb e t t e rt h a nt h es a m p l e so f c o m m e r c i a i i z e do t a e l i s ak i t s t h eo t a t r f i aa s s a yk i tw a su s e db o t hf o rc o m p a r i s o n w i t hi m p o r t e de l i s aa s s a yk i ta n dp r o o f t e s ta g a i n s tt h e0 7 i aq u a l i t yc o n t r o ls a m p i e sp r o v i d e d d e d a n m e n tf o re n v i r o 啪e n tf o o da n dm r a la f f a i r su k t h ec o n f o m i t yo fr e s u l t si nb o t hc a s e s d e m o n s t r a t e st h a tt h em e t h o di sa c c u r a t ea n dr e l i a b l e t h ei m p u r i t i e si ns a m p l e sb a s i c a l l yh a v e 1 i m ei n t e r f e r e n c eo nt h er e s u l t s t h i sa p p r o a c he n j o y st h eb r o a dp m s p e c to fb e i n ge m p l o y e d f o ra c t u a ld e t e c t i o no f0 1 ai n 乜r a i n s 2 a f b l t r f i ai sa l s oo n eo f t h em o s ts e n s i t i v em e t h o d sf o ra f b ld e t e c t i o ne v e rr e p o r t e ds o f a lt h i sa p p r o a c hi sm o r es t a b l e s e n s i t i v ea n dw i d e ri nm e a s u r e m e n ts c o p et h a nt h e c o m m e r c i a l i z e da f b i e l i s a a s s a yk i t s a n dh e l pt oe n h a n c et h ea f b la s s a yt oa n e w h e i g h t 3 t h er a p i da 1 1 dh i g h l ys e n s i t i v eo t a t r f l aa j l da f b l t r f i aa s s a yk i t so fo u ro v 1 1 i n d e p e n d e n ti n t e l l e c t u a lp r o p e r t yr i g h ta r et e s t e da n dp r o v e dt ob ei nc o n f b 门m i t yw i t hr e l e v a n t r e q u i r e m e n t so n1 a b e l l i n gi m m u n o a s s a ys o l u t i o n t h et h e s i sc o n d u c t e da p p l i c a t i o nr e s e a r c ho n x 摘要 i n d u s 试a l i z a t i o no f n e w l yd e v e l o p e da s s a yk i t s w o r k e do u tt l ep r o c e s sd e s i g n t h u sm a k i i l gm e k i t sh a v eb e t t e r 印p l i c a t i o np r o s p e c t k e yw o r d s o c l l r a t o x i na a n a t o x i nb l t i m e r e s o l v e dn u o r o i m m u n o a s s a y t r f i a m y c o t o x i n a n t i b o d i e s x i 江南大学博士学位论文 主要缩略词 黄曲霉毒素b 黄曲霉毒素b 一辣根过氧化物酶 黄曲霉毒素b 酶联免疫分析法 黄曲霉毒素b 时间分辨荧光免疫分析法 黄曲霉毒素 牛血清白蛋白 计数值 秒 变异系数 解离增强斓系离子荧光免疫分析 n 一 p 一异氰酸一苄基卜二乙烯三胺四乙酸 l 一乙基一3 一 3 一二甲基一氨丙基 碳二亚胺 酶联免疫分析法 三价稀土离子铕 高效液相色谱法 钥蓝蛋白 单克隆抗体 非特异吸附值 b 一萘甲酰三氟丙酮 赭曲霉毒素a 偶联牛血清白蛋白的赭曲霉毒素a 偶联钥蓝蛋白的赭曲霉毒素a 赭曲霉毒素a 酶联免疫分析法 赭曲霉毒素a 时间分辨荧光免疫分析法 多克隆抗体 磷酸盐缓冲液 展青霉素 放射免疫分析 标准偏差 薄层色谱法 三正辛基氧化磷 时问分辨荧光免疫分析法 世界卫生组织 v 弘n a a 氓 玎 a h 砖阱 一m 椰 m 驰 m 耋芦吼吼m 田m 阳阳昭盹耵趴陌 乩 叱u 儿叫卟姐卜n n m孙n以陷孔m o 比 盯 a a a a a b c c d d e e e h k m n o o o o o p p p r s t t t w 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地 方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 签名 垄蹩 日期 丑硝年4 月留日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留 使用学位论文的规 定 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 日期 妒6 年 月谚日 第一章绪论 1 1概述 第一章绪论 真菌毒素是农产品和食品中常见的污染物 黄曲霉毒素b a f l a t o x i nb a f b 赭曲霉毒素a o c h r a t o x i na 0 t a 是食品中最主要的真菌毒素 它们都是一种致癌物 质 为了发现其污染 在检测方面 各国不遗余力 并采用最新的检测方法 加大检测 力度 如我国食品出口到欧盟等市场 其检验检疫必须符合有关真菌毒素等食品安全规 定的要求 在这方面我国产品的出口已遭受了很多的损失 而且毒素限量也是贸易保护 的一种技术壁垒 有的国家利用检测污染物的技术优势 设置技术壁垒 此外欧盟委员 会不断严格农产品中a f b o t a 限量标准 其允许值常低于我国现有免疫学方法的检测限 如果我们跟在国外进行研究 就无法超越国外的标准 也就随时有被限制的可能 因此 尽快建立高灵敏 快速便捷的相关的检测 研制具有我国自主知识产权的试剂盒 超越 国外的技术壁垒是当务之急 针对这种情况 研究计划采用颖新 高灵敏的标记免疫技 术一高灵敏的时间分辨荧光免疫分析 t r f i a 技术 重点解决危害性最大的真菌毒素 f b 和0 t a 的免疫学检测 建立0 t a 和a f b 的高灵敏的t r f i a 的检测方法 在灵敏度和测 量范围超越目前市场上常用的进口或国产的酶联免疫检测方法 并研制相关的具有我国 自主知识产权的快速检测试剂盒 该方法在国内乃至国际上还未有报导 其应用可以大 大提高我国在真菌毒素检测方面的技术水平 1 2 真菌毒素的危害 a f b 0 t a 都是真菌毒素 真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物 目前研究较为深 入的对象集中在几种对人类危害大的真菌毒素 如a f b 0 t a 杂色 柄 曲霉毒素 t e r i g m a t o c y s t i n 展青霉素 p a t u l i n p t l 玉米赤霉烯酮 z e a r a l e n o n e z e n f 一2 串珠镰刀菌素 m o n i l i f o r m i n m f t 一2 毒素 t 一2t o x i n t 一2 脱氧雪腐镰刀菌 烯醇 呕吐毒素 d e o x y n i v a l e n o l d o n 二乙酰镳草镰刀菌烯醇 d i a c e t o x y s c i r p e n o l d a s 等 它们一般都具有毒性强和污染频率高的特点 由于真菌的寄生和真菌毒素的 产生 严重影响农作物的产量 降低农产品和饲料品质 造成巨大经济损失 如我国谷 物的霉变 就每年使粮食减产3 7 全世界每年由于霉变污染真菌毒索引起的农产品 和工业原料的损失达数百亿美元 除粮食 饲料以外 在油料作物种子 水果 干果 蔬菜 调味品 烟草 麻类 乳和乳制品 鱼虾 肉类 发酵产品等都发现了不同程度 的真菌毒素污染 人或动物摄入被真菌毒素污染的农 畜产品 或通过吸入及皮肤接触 真菌毒素可引发多种中毒症状 如致幻 催吐 出血症 皮炎 中枢神经受损 甚至死 亡 真菌毒素中毒往往表现为明显的地方性和季节性 临床表现较为复杂 许多真菌毒 江南大学博士学位论文 素还可在体内积累后产生致癌 致畸 致突变 类激素中毒 白细胞缺乏症等 对机体 造成永久性损害 真菌毒素对食品的污染近年来已受到有关权威组织的高度重视 w h 0 f a o u n e p 全球环境监测计划的食品部分列出的重点污染监测项目中包括a f b 0 t a p t l 等 同时还规定 用真菌发酵生产的各种酶制剂必须进行包括a f b 0 t a 等的检测 1 1 3 赭曲霉毒素a 概述 1 3 1 赭曲霉毒素a 的危害 赭曲霉毒素 0 c h r a t o x i n 是由曲霉菌属和青霉菌属几种菌产生的次生代谢产物 赭曲霉毒素分为赭曲霉素a b c3 种 其中以0 t a 毒性最大 结构见图1 1 这3 者的 差异在于赭曲霉毒素b 是赭曲霉a 的氯原子被氢原子取代 赭曲霉毒素c 是0 t a 的乙酯 化合物 1 o t a 的污染有地区性和时间性 1 动物试验表明它具有较强的肾 肝毒性 并 广泛地分布于饲料及饲料原料中 累积在家畜 禽体内 通过食物链对人类健康构成威 胁 c o o h l ch 2 c h n c h l o c i 图1 10 t a 的化学结构式 f i g 1 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fo c h r a t o x i na 赭曲霉是最早发现能够产生0 t a 的真菌 在热带和亚热带地区 农作物在田问或储 存过程中污染的0 t a 主要是由赭曲霉产生 纯绿青霉是继赭曲霉之后发现的另 o t a 产生 菌 在诸如加拿大和欧洲等寒冷地区 粮食及其制品中o t a 的产毒真菌主要为纯绿青霉 h o l m b e r g 等研究发现 污染0 t a 的猪饲料 内含大麦 燕麦或谷糠 中 纯绿青霉的检出 率高达6 0 且o t a 含量与纯绿青霉检出率有正的相关关系 1 j o n s s o n 等研究显示湿 度 温度和储存时间对冬储麦中o t a 的污染有影响 1 碳黑曲霉是近几年新发现的一种能 够产生0 t a 的真菌 以侵染水果为主 是新鲜葡萄 葡萄干 葡萄酒和咖啡中0 t a 的主要 产生菌n 0 1 由于0 t a 产生菌广泛分布于自然界 因此包括粮谷类 干果 葡萄及葡萄酒 咖啡 可可和巧克力 中草药 调味料 罐头食品 油 橄榄 豆制品 啤酒 茶叶等多种农 第一章绪论 作物和食品均可被o t a 污染 动物饲料中0 t a 的污染也非常严重 动物进食被0 t a 污染的 饲料后导致体内o t a 的蓄积 由于o t a 在动物体内非常稳定 不易被代谢降解 因此动物 性食品 尤其是肾脏 肝脏 肌肉 血液 奶和奶制品等中常有0 t a 检出 世界各国 均有从粮食中检出0 t a 的报道 克罗地亚1 9 9 6 和1 9 9 7 年对当地产玉米中0 t a 的污染水平进 行了检测 结果表明 o t a 的平均含量分别为3 6 1 和1 9 8 ug k g 最高污染水平分别为 2 2 4 和6 1 4 lg k g 芬兰对小麦样品的分析结果显示 o t a 的平均含量为1 8 2 ug k g 最 高达4 3 0ug k g 我国曾采用薄层色谱法分析了6 1 0 份小麦和7 9 6 份玉米 结果0 t a 阳性率 分别为2 和1 2 5 含量范围分别为8 2 2 和8 8 0 儿g k g 在有猪霉菌毒素肾病 流行的丹麦 对猪肾脏的分析结果显示阳性率为7 9 最高含量达1 4 7 2ug k g 咖 啡中o t a 的污染也不容忽视 m a n t l e 分析了8 0 份英国速溶咖啡 阳性率为8 0 而且 o t a 对热稳定 湿小麦1 0 0 经1 4 0 分钟方可破坏5 0 的o t a 1 0 t a 的毒性很强 如大白鼠经口服半数致死量为1 3 3 1 3 6 肚g k g 0 t a 对动物的毒 性主要为肾脏毒和肝脏毒 显微镜下中毒动物可见肾小管萎缩 问质纤维化 肾小球透 明变性 肾小管坏死等 许多欧洲国家都有与0 t a 有关的猪肾病发生 0 t a 对肾脏的特异 性毒性作用机理可能是降低近曲小管细胞的纤毛侧对有机阴离子的转运 除特异性肾 毒性作用以外 0 t a 还对免疫系统有毒性 并有致畸 致癌和致突变作用 在一致癌试 验中 2 0 只6 周龄的小鼠每日通过饲料摄人0 t a 结果受试小鼠全部患肾囊腺瘤 另有实 验证明0 t a 喂养大白鼠可引起肝癌和肾癌 5 1 许多研究还在人血中检出0 t a 在人地方性肾病流行区巴尔干半岛 病区食品中o t a 的污染率 1 8 是非病区 7 7 的近3 倍 而病区人血中o t a 的检出率 1 7 也为非病 区 6 的近3 倍 此外 母亲经膳食摄入的o t a 可分泌至乳汁中从而影响下 代 0 t a 对人也主要危害肾脏 造成肾肿大 也可造成肠炎 淋巴坏疽 肝肿大等 因 为膳食摄入0 t a 与人类的健康有关 鉴于o t a 的危害 各国对o t a 制定了很严格的限量标 准 1 3 2 国内外赭曲霉毒素a 限量标准进展 近年来关于赭曲霉毒素的危害已引起世界各国的极大关注 许多国家对其制定了最 高允许量 随着我国加入w t o 建立自己的质量标准 监控0 t a 是必要的 世界卫生组织 粮农组织食品添加剂联合专家委员会 j e c f a 第3 7 次会议提出 暂 定的o t a 每周容许摄人量 p r o v i s i o n a lt o l e r a b l e e e k l yi n t a k e p 删i 为1 1 2 n g k g b w 食品添加剂和污染物法典委员会也在其第3 1 次会议上 建议粮食及其制品中0 t a 的最高容许量为5 或2 0 ug k g 因此 减少膳食摄入o t a 不超过p t w i 的有效方法是降 低农产品和食品中o t a 的污染水平 到目前为止 全世界已有1 1 个国家制订了食品 0 3 5 0 ug k g 和动物饲料 1 0 0 1 0 0 0 ug k g 中o t a 的限量标准 2 欧盟于2 0 0 5 3 江南大学博士学位论文 年实施一项新法规 用于修补欧盟委员会第4 6 6 2 0 0 l 号法规 增设o t a 在烘焙咖啡豆 研磨烘焙咖啡 速溶咖啡 葡萄酒 葡萄汁和用于饮料制作的葡萄中的最大限量 烘焙 咖啡豆和研磨烘焙咖啡 5 oug k g 速溶咖啡 l o o g k g 葡萄酒 其他用于饮料 制作的葡萄酒以及 或者葡萄 2 o pg k g 葡萄汁和其他饮料中韵葡萄汁成分 2 o ug k g 在包括谷类食品在内的婴幼儿食品中 o t a 的最大限量为o 3 ug k g 在生 产过程中0 t a 的使用量不得超过o 5ug k g 可以看到发达国家o t a 的限量标准在不断 提高 部分食品中的要求已远高于国际通行的较严格的5ug k g 的标准 而我国目前还未有这方面的标准 因而作为国际食品安全评价机构的j e c f a 很少能 得到我国的污染监测和暴露量评估数据 使我们始终处于被动地位 1 3 3 国内外赭曲霉毒素a 的检测方法进展 限量标准的变化是与检测方法的提高密切相关的 o t a 的分析技术 涉及采样 提取 纯化 检测和特性证实 针对0 t a 的检测方法要有一定的灵敏度和专一性 由 于0 t a 在人体内浓度很低时 就足以产生毒性 因此方法必须有一定灵敏度 同时食 品或饲料等基质成分都很复杂 易对测定物产生干扰 所以方法的专一性很重要 方 法要简便实用 便于推广应用 还应有利于环境保护和对实验室工作人员无害 不能 造成新的污染 国际a o a c 和欧洲委员会推荐测定方法有薄层色谱法 t l c 高效液相 色谱法 h p l c 气相色谱法 g c 等色谱法及酶联免疫分析法 e l i s a 等免疫学方法测定 0 ta j 国际方法i s 0 1 5 1 4 卜l 1 9 9 8t c 3 4 s c 4 食品一谷物和谷物制品中赭曲霉毒素的 测定 第l 部分用硅胶柱净化 第2 部分用碳酸氢盐柱净化 均采用h p l c 法 美国公 定分析家协会 a o t a c 的大麦和鲜咖啡中o t a 分析方法采用t l c 法 o t a 的t l c 法是最 经典的筛选定性方法 因其对仪器设备无要求 易普及而被广泛采用 随着薄层色谱 扫描仪的应用 薄层板的商品化 t l c 法适用于定性 定量 h p l c 法具有更高的灵敏 度 可以精确地对样品中的0 t a 进行定性 定量分析 但存在着仪器贵 对样品的 前处理要求高 为了简化前处理步骤 近来固相提取柱和免疫亲合柱被广泛用于样品 的前处理 但是相对免疫学方法而言 其操作复杂且不适用于大批量样品的检测 在大批量样品筛查方面 免疫学方法有着独有的优势 国内外o t a 的免疫检测技术 发展也很快 如e l i s a 放射免疫分析法 r i a 等均已应用于o t a 的快速筛选分析 e l i s a 快速 灵敏 准确 可定量 操作简便 无需贵重仪器设备 特别适用于大批量样品的 筛选检测 在o t a 的免疫学检测中 研究主要注重于e l i s a 反应条件的优化和相关抗体 的制备 由于e l i s a 抗体效价的不同 不同报导e l i s a 的灵敏度在o 0 4 2 一1 0ug l 之间 而商品化的e l i s a 试剂盒的灵敏度一般在o 2ug l 左右 可测范围在o 2 2 5ug l 之 间 2 5 一 我国在0 t a 检测方面与国外存在着差距 目前国家标准是于1 9 9 1 年建立的谷物和 大豆中o t a 的t l c 测定方法 近年国内还陆续建立了0 t a 的单克隆抗体的e l i s a 法 第一章绪论 由于进出口的需要 我国又制定了进出口商品行业标准 出口粮谷中赭曲霉毒 素a 检验方法 采用t l c 方法 出口饲料中赭曲霉毒素a 检验方法 采用h p l c 法 宓晓黎汇总0 t a 各种检测方法 见表1 1 1 我国0 t a 的检测常采用t l c 国内建立 的e l i s a 方法由于灵敏度不高或其他原因 还没有一个国产的试剂盒面市 表1 10 t a 的检测方法 t a b l e1 1a n a l y t i c a l l e t h o d so fo t a h p l cc 1 8 拄 直动相 乙琦一束一乙醴 柚 5 8 辟 较量 倍捌鼍取 同o h k 5 雌 n i l h 打 2 荧光捡 嚣l h x 5 衄n 啦1 6 5 加 相拄萃取 h p l cc 1 8 柱 瘴动相 木一乙 一乙酸 9 9 t 9 玉米 大麦 提取 转相l0 i j k g n l n 5 7 2 黄光检舅嚣 c 棚帅 k m1 6 0 衄 藏一藏革取 c l b 拄挺蟪 h p l cc 1 8 挂 直动辐 乙膏一束一乙磕 舒 5 答钳和翻啡豆 免痤亲和n 略 b 一 一