重组质粒的转化.ppt

重组质粒的转化 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术 重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下 有Mg2 ATP存在的连接缓冲系统中 将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来 将重组质粒导入感受态细胞中 将转化后的细胞在选择性培养基中培养 可以通过各种方法筛选出重组子 并可通过酶切电泳进行重组子的鉴定 感受态 理化方法诱导细胞 使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态 它决定于受体菌的遗传特性 同时与菌龄 外界环境等因素有关 感受态细胞制备方法及原理 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法 制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15 的无菌甘油 70 可保存半年至一年 经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加 允许外源DNA分子进入 该方法简便 快速 稳定将快速生长的大肠杆菌置于经低温 0 预处理的低渗氯化钙溶液中 便会造成细胞膨胀 细胞膜通透性发生变化 CaCl2法制备感受态细胞 影响因素 细胞的生长状态 对数生长期试剂质量 分析纯杂菌和杂DNA污染 所用器皿 试剂均需灭菌温度 冰上操作 转化 是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象 在低温下 将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合 经过热激或电穿孔技术 使载体分子进入细胞 进入受体细胞的外源DNA分子通过复制 表达 使受体细胞出现新的遗传性状 将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养 即可筛选出重组子 转化过程所用的受体细胞一般是限制 修饰系统缺陷的变异株 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株 方法及原理 热激法 使用化学试剂 如CaCl 制备的感受态细胞 细胞膜通透性发生变化 极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基 磷酸钙复合物 此时 将该体系转移到42 下做短暂的热刺激 90s 细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动 并随机出现许多间隙 外源DNA就可能被细胞吸收 操作步骤 取100 l感受态细胞悬液 如是冷冻保存液 则需化冻后马上进行下面的操作 加入10 l重组质粒DNA 体积不超过10 l 100 l感受态细胞将以上样品轻轻摇匀 冰上放置20 30min 于42 水浴中保温1 2min 然后迅速冰上冷却2min立即向上述管中分别加入LB液体培养基 不需在冰上操作 摇匀后于37 振荡培养约45 60min 使受体菌恢复正常生长状态 并使转化体表达抗生素基因产物 提高转化效率的方法 感受态质量质粒DNA的相对分子质量和浓度防止杂菌和杂DNA污染 重组子的筛选 转化后的细胞在筛选培养基中培养 可筛选出转化子 蓝白斑筛选 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法 野生型大肠杆菌产生的 半乳糖苷酶可以将无色化合物X gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5 溴 4 靛蓝 有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化 而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法 筛选原理 IPTG可以激活lacz 中的 半乳糖苷酶的启动子 在含有X gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色 当外源DNA 即目的片段 与含lacz 的载体连接时 会插入进MCS 即靶基因 使 肽链读码框破坏 不产生活性 半乳糖苷酶 即不可分解培养基中的X gal产生蓝色 培养表型即呈现白色菌落 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入 MCS无插入时 互补 蓝菌斑 MCS有插入时 不互补 白菌斑 IPTG诱导的结果 抗生素抗性筛选 实验中 通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的 含X gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素 这样 一次筛选可以判断出 未转化的菌不具有抗性 不生长 转化了空载体 即未重组质粒的菌 长成蓝色菌落 转化了重组质粒的菌 长成白色菌落 转基因技术 什么是转基因技术 1983年 世界上第一例转基因植物在美国成功培植 当时就曾有人惊呼 人类开始有了一双创造新生物的 上帝之手 有人预言 21世纪将是转基因作物的一个转换期 科技含量将有很大的提高 转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中 由于导入基因的表达 引起生物体的性状的可遗传的修饰 人们常说的 遗传工程 基因工程 遗传转化 均为转基因的同义词 基因工程和选择性繁殖技术有什么不同 转基因技术与选择性繁殖都会改变生物的基因 转基因技术可以实现基因在不同物种之间的传递和流动 可以实现物种间的基因转移 转基因技术转移的基因更明确 更有目的性 选择性繁殖实验过程缓慢 基因工程技术筛选优良品种的周期更短 利用基因工程 可以很容易地进行物种的杂交 23 选择性繁殖 技术 24 植物转基因方法 直接基因转移方法 基因枪法 PEG介导的原生质体法 花粉管通道法 电激转化法等 其中基因枪转化法是代表 生物介导的转化方法 主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法 其中农杆菌介导的转化方法操作简便 成本低 转化率高 广泛应用于双子叶植物的遗传转化 26 花粉管通道 花粉管通道法是指在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液 利用植物在开花 受精过程中形成的花粉管通道 将外源DNA导入受精卵细胞 并进一步地被整合到受体细胞的基因组中 随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体 该方法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株 技术简单 不需要装备精良的实验室 常规育种工作者易于掌握 农杆菌介导的植物转基因技术 28 农杆菌介导的植物转基因技术 29 转基因和克隆技术 克隆是将一个体细胞的DNA移入一个已经被去掉细胞核的卵细胞中 然后刺激这个改造后的卵细胞 使它开始分裂并成为一个胚胎 这个胚胎的基因与体细胞提供者的基因完全一样 关于转基因 通常因有性生殖造成同种生物个体之间遗传物质的重组 克隆是对单体的复制 转基因技术可以保持生物基因的多样性 而克隆却没有什么帮助 反而有一定的威胁 30 克隆羊 多莉 的产生过程 32 转基因技术和传统育种技术有什么区别 本质都是通过获得优良基因进行遗传改良 基因转移的范围和效率上 两者有两点重要区别 第一 传统技术一般只能在生物种内个体间实现基因转移 转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制 就是说可以打破种的限制 第二 传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进行 操作对象是整个基因组 对后代的表现预见性较差 转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因 功能清楚 后代表现可准确预期 33 转基因食品 以转基因生物为原料加工生产的食品 根据原料来源 动物源 植物源 微生物源根据功能 增产型 控熟型 高营养型 保健型 新品种型 加工型最初目标 保护作物风险评估 环境和人类健康 1 对人类健康的直接影响 毒性 2 引起过敏反应的趋势 过敏性 3 被认为有营养特性或毒性的特殊成分 4 插入基因的安全性 5 与基因改良有关的营养效果 6 由基因插入产生的任何非预期影响 基因产品的开发现状 转基因食品的开发美国55 的大豆是转基因产品 40 50 玉米是经过基因工程改变过的 美国超市上有4000多种食品含有转基因成份 1996年 世界种植转基因农作物的面积为700万公顷 到1999年增加到7500万公顷 美国占了74 中国只占1 2000年美国基因农作物产品的销售额达950亿美元 植物基因工程源源创造新品种 转基因食品的增长是无限的 将不断推进经济增长 36 重组子的鉴定及基因表达产物的分析 琼脂糖凝胶电泳检测聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS PAGE核酸分子杂交 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大 直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆中分离质粒 电泳 比较其分子量 DNA电泳检测法 Marker 载体 重组子 根据重组DNA分子大小鉴定重组子原理 有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异 基本方法 提取转化子的DNA 经琼脂糖凝胶电泳分离 电泳迁移慢的带是重组DNA的带 此法是对重组子进行分析鉴定的最基本 最简单的方法 只适用于重组子的初步鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动 移动的速率主要取决于其分子量大小 链的长短 从而把不同分子量的肽链分开 电泳buffer 电泳buffer 点样 电泳方向 Dalton 凝胶中的蛋白质染色 考马斯亮蓝 灵敏度底 只能检出 0 3 1 g 带 但可褪色回收 硝酸银 灵敏度高 可检出2 5ng 带 2 转到膜上进行染色 1 直接染色 直接染色电泳结果 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列 已知核酸序列且已标记的DNA或RNA 称探针 杂交有固一液相杂交和液相杂交