【doc】MSMS测定腐竹和米粉中的乌洛托品.doc

ms-ms测定腐竹和米粉中的乌洛托品第11卷第1期2012年2月江南大学(自然科学版)journalofjiangnanuniversity(naturalscienceedition)vo1.11no.1feb.20l2uplc.ms/ms测定腐竹和米粉中的乌洛托口口n冼燕萍,陈立伟,罗东辉,罗海英,陈意光,吴玉銮(广州市质量监督检测研究院,国家加工食品质量监督检验中心(广州),广东广州5101lo)摘要:建立了腐竹和米粉中非食用物质乌洛托品的超高效液相色谱一串联质谱(uplcms/ms)检测方法.实验优化了提取溶剂和净化条件,考察了乌洛托品在不同流动相体系和不同小颗粒色谱柱(粒径1.7m)上的色谱行为,优选以乙腈超声提取样品,正己烷(乙腈饱和)液液萃取净化,乙腈一乙酸铵(浓度为10mmol/l,ph3.5)为流动相体系等度洗脱,hilic色谱柱分离,正离子电喷雾多反应监测(mrm)模式检测.实验结果表明:质量浓度在05ol范围内,线性方程为y=12617x一359,相关系数为0.9998,方法定量限为lg/kg(n>10),阴性样本添加水平在15g/kg时,平均回收率为91.0%96.6%,相对标准偏差(n=6)为2.6%5.2%.本方法操作简单,灵敏度高,重复性好,可为打击食品生产中违法添加非食用物质乌洛托品的行为提供检测方法.关键词:超高效液相色谱-串联质谱;腐竹;米粉;乌洛托品;测定中图分类号:0212.1文献标识码:a文章编号:16717147(2012)01007805determinationofurotropineresidueindriedbeancurdstickandriceflourbyultraperformanceliquidchromatographyelectrosprayionizationtandemmassspectrometryxianyanping,chenli-wei,luodonghui,(guangzhouqualitysupervisionandtestinginstitute,processedfood(guangzhou),guangzhou510110,china)luohai-ying,chenyiguang,wuyuluannationalcentreforqualitysupervisionandtestingofabstract:amethodbasedonultraperformanceliquidchromatographyelectrosprayionizationtandemmassspectrometry(uplcms/ms)wasdevelopedforthedeterminationofurotropineresidueindriedbeancurdstickandriceflour.theextractionsolventandpurificationconditionswereoptimized,andthechromatographicbehaviorofurotropinewerestudied.thesamplewasextractedwithacetonitrilebyultrasonicextraction(ue),andcleanedupbyliquidliquidextractionwithnhexane(saturatedwithacetonitrile).urotropinewasseparatedonahiliccolumn(50mmx2.1mmi.d.,1.7p,m)withacetonitrile一10mmol/lammoniumacetatesolution(ph3.5)(80:20,)asthemobilephaseataflowrateof0.25ml/min,thetandemmassspectralacquisitionwasdoneinthepositiveelectrosprayionizationutilizingmultiplereactionmonitoring(mrm).analysisofblankandfortifiedsamplesshowedthatattheconcentrationrange050l,thelinearequationwasy=12617一359,thecorrelationcoefficientwas0.9998,thelimitofquantificationwas1tlg/kg(s/n>10).atthespikinglevelsof15g/kg,theaveragerecoveriesofurotropinewereintherangeof91.0%一96.6%withrelativestandarddeviation(rsd,n=6)of2.6%5.2%.themethodissimple,sensitiveandreproducible,whichcouldmeettherequestofurotropineresiduetesting.keywords:uplcms/ms,driedbeancurdstick,riceflour,urotropine,determine收稿日期:20111114;修订日期:20111220.作者简介:冼燕萍(1975一),女,广东广州人,高级工程师.主要从事检测技术研究.通信作者:罗海英(1976一),女,广东清远人,高级工程师.主要从事检测技术研究.email:第1期冼燕萍等:uplc-ms/ms测定腐竹和米粉中的乌洛托品79乌洛托品(1,3,5,7.四氮杂三环癸烷,别名六亚甲基四胺)是卫生部公布的151种非食用物质之一,在弱酸条件下分解产生甲醛,具有杀菌,防腐的作用.卫生部报道可能有些生产腐竹,米线的不法厂家违法使用乌洛托品以替代吊白块,意在保持产品的色泽和延长保质期l1-3.然而,相应的检测方法和检测标准仍欠缺,因此,开展腐竹,米线等食品中乌洛托品残留量检测与控制的研究显得尤为重要.目前,关于食品中乌洛托品的检测,仅有标准方法sn/t2226-2008(进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的检测方法液相色谱.质谱/质谱法j,适用于鸡肉,鸡肝脏,鸡肾脏和猪肉中乌洛托品残留量的检测和确证.乌洛托品的检测主要有气相色谱法,分光光度法和离子电极法等,但所检测的样品多为乌洛托品药品和食品模拟物,不适用于食品样品中微量或痕量残留的检测.黄国春_5采用气相色谱法检测腐竹中乌洛托品残留量,该方法的最低检出限为0.7mg/kg,灵敏度不高,且不能确证,在基质干扰下,有可能造成假阴性或假阳性的判断.文中通过对不同的提取溶剂,净化条件进行比较和优化,考察了uplc色谱系统对乌洛托品色谱行为的影响,选择以乙腈为提取剂对样品进行超声提取,正己烷(乙腈饱和)液液分配净化,超高效液相色谱.串联质谱测定,建立了腐竹,米粉中乌洛托品残留的分析方法,该方法操作简单,灵敏,重现性好.1.2样品处理1.2.1提取称取粉碎混匀的试样2.00g至10ml具塞比色管中,加入5.0ml乙腈.涡漩振荡1min,超声提取30min,2500r/min离心3min,吸取2ml上清液于10ml试管中,待净化.1.2.2净化在1.2.1的试管中加入2ml正己烷(乙腈饱和),涡漩振荡1min,2500r/min离心3min,弃去上层正己烷溶液,重复用2ml正己烷(乙腈饱和)萃取净化1次,下层清液过0.22m滤膜,待测.1.3液质联用仪分析条件1.3.1色谱条件色谱柱:watersacquityuplcbehhilic液相柱50mm2.1mm(i.d.),1.7ixm;流动相:v(乙腈):(质量分数为10mmol的乙酸铵溶液(ph3.5)=80:20,等度洗脱;流速:0.25ml/min;柱温:30oc;进样量:5l.1.3.2质谱条件离子源:esi;毛细管电压:500v;离子源温度150;去溶剂温度:500;去溶剂气:氮气,800l/h;锥孔气:氮气,50l/h;碰撞气:氩气,0.2ml/min;检测模式:采用多反应监测(mrm)模式,具体监测条件见表1.表1乌洛托品的多反应监测条件tab.1multiplereactionmonitoringconditionsofurotropine1材料与方法2结果与讨论1.1试剂和仪器1.1.1试剂乌洛托品标准品,纯度>99.0%,sigma公司提供;乙腈,正己烷,乙酸铵,甲酸,均为色谱纯,皆由美国sigma公司提供.乌洛托品标准溶液:称取适量的乌洛托品标准品,用乙腈配制成标准储备液;乌洛托品标准工作溶液:准确吸取适量乌洛托品标准储备液,用乙腈稀释成质量浓度分别为0,1,2,5,20,50g/l的系列标准工作溶液.1.1.2仪器ms2minshaker漩涡振荡器,广州仪科实验室技术有限公司制造;kq.250dv型数控超声波清洗仪,昆山超声仪器有限公司制造;ld52a离心机,北京京立离心机有限公司制造;液质联用仪:watersacquityuplc色谱系统和xevotq三重四极杆质谱(esi电离源),waters公司提供.2.1提取溶剂的选择乌洛托品溶于水,乙醇等有机溶剂,不溶于乙醚,石油醚,芳烃.文中比较了水,体积分数为0.1%的甲酸,乙腈,体积分数为0.1%的甲酸乙腈,(乙腈):v(体积分数为0.1%的甲酸溶液)=4:1,(乙腈):(体积分数为0.1%的甲酸溶液)=1:4的6种提取溶剂.发现水,体积分数为0.1%的甲酸溶液,(乙腈):v(体积分数为0.1%的甲酸溶液)=1:4这3种溶剂的提取液非常浑浊,离心后也难以澄清,在过滤膜时发生堵塞;而其余3种提取溶剂中,乙腈的提取回收率稍高于其他2种溶剂,故选择乙腈为提取剂.2.2净化腐竹生产的原材料来源不同,其脂肪含量也不相同,一般约在10%25%之间l1j.如果不除去脂80江南大学(自然科学版)第1l卷溶性杂质,液质检测时就会产生极大的基质效应,致使回收率只有10%,严重干扰检测结果.首先以固相萃取小柱进行净化.根据乌洛托品的结构,参考sn/t2226-2008,乌洛托品在hlb和c18固相萃取小柱上没有保留,而mcx固相萃取小柱则可以通过离子作用对其有较强的保留.但是,同时发现过mcx小柱的空白实验会产生约5g/l的本底,未过小柱的相同量的洗脱溶液(体积分数为5%的氨化甲醇)氮吹干后也会产生约1g/l的本底,这种情况影响了方法的检出限和定量的准确性,导致有可能出现假阳性的结果.因此,根据乌洛托品不溶于乙醚,正己烷等脂溶性溶剂的特点,考虑用正己烷(乙腈饱和)进行液液萃取脱脂,操作简单,实验效果很好,回收率在90%112%.但如用分析纯的正己烷,仍会有约0.5g/l的本底,改用色谱纯的正己烷后,可解决此问题.图1为同一腐竹样液未经净化和采用正己烷净化的图谱比较.1008060嚼亲4o200141.1>112.2(wuokuotuopi1.32e:乙一1.52.02.53.03.54.04.55.0t/min(a)未净化mkm0tjhannelse+141.1>112.2(wuokuo111opin)101e60.11.,一一t/min(b)净化后图1同一样液未经净化与净化后的图谱比较fig.1comparisonbetweenpurificationandwithoutpurification由图i可以明显看到,样液经正己烷净化后图谱基线降低,响应提高约1个数量级.对于米粉样品,其脂肪含量很少,基质效应的干扰较少,但正己烷净化后的检测效果也比净化前稍好.2.3uplc色谱系统对乌洛托品色谱行为的影响uplc配合使用小颗粒色谱柱,更能充分表现其高分离度和高灵敏度等优点.由于乌洛托品在c18色谱柱上基本没有保留,在10cm的c18色谱柱上,其保留时间也只有0.9min(以体积分数为98%的水相等度洗脱),在实际样品检测时易受影响;而hilic色谱柱能够有效地提高极性化合物的保留,故采用hilic色谱柱(粒径1.7ixm).根据sn/t2226-2008,以体积分数为0.1%的甲酸水和乙腈作为流动相,对比了2组流动相体系:体积分数为0.1%的甲酸水+乙腈,浓度为10mmol/l的乙酸铵+乙腈,具体结果如图2所示.骥霞1008o6o鳗歪4o2o0t/min(a)浓度为10mmol/l的乙酸铵+乙腈mkmoij0llabnels+tic(wuokuotuopin)5.2le5.,._h_-_.一h0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0t/min(b)体积分数为0.1%的甲酸水+乙腈图22组流动相体系对乌洛托品色谱行为的比较fig.2comparisonbetween2groupsofmobilephase由图2可以看出,以体积分数为0.1%的甲酸水+乙腈为流动相体系时,乌洛托品的色谱行为很不稳定,出现了离子抑制现象(见图2(b)和保留时间不稳定的情况(逐针向前移,前后可相差0.6min);而以浓度为10mmol/l的乙酸铵+乙腈为流动相体系时,没有出现上述问题(见图2(a),而且半峰宽较窄,响应提高.这可能是因为采用的watersbehhilic色谱柱对待分析物产生次级的离子间作用而影响峰型和柱效,需要通过调节流动相中盐的浓度来降低这种作用,把分析物有效地洗脱出来.在esi模式下,流动相中高浓度的盐会影响目标化合物的离子化效率,加入酸度调节剂有助于提高离子化效率,文中对流动相的乙酸铵浓度和ph值分别进行了单因素实验.首先研究了乙酸铵浓度分别为2,5,10mmol/l时,乌洛托品在hilic色谱的加0骥靛罂第1期冼燕萍等:uplc.ms/ms测定腐竹和米粉中的乌洛托品81柱的色谱行为.结果表明在浓度为2mmol/l和5mmol/l乙酸铵中,虽然乌洛托品的响应值稍高,但其保留时间和响应会出现不稳定的情况,可能是乙酸铵的浓度未能很好地破坏hilic色谱柱固定相的静电作用;在浓度为10mmol/l的乙酸铵中,乌洛托品的色谱行为稳定.因此选用浓度为10mmol/l的乙酸铵溶液.用甲酸调节流动相的ph分别为3.5,4.0,4.5,进一步考察流动相的ph值对乌洛托品色谱行为的影响.实验结果表明,随着ph值的降低,保留时间缩短,响应提高,经对比,优选ph方法的线性关系,检出限取乌洛托品系列标准工作溶液进行检测.以峰面积y对浓度(g/l)作标准曲线,线性方程y=12617x一359,相关系数0.9998.图3为乌洛托品标准溶液的提取离子谱图.由图3可以及看出,乌洛托品浓度在050g/l范围内与峰面积具有良好的线性相关性.由样品前处理回收率和稀释倍数关系确定方法定量限1.0恤g/kg(s/n>10),优于sn/t2226-2008和相关文献.1oo8o6o嘿萎4o1411>112.2(wuokuoii10pirn940e5图3乌洛托品标准溶液提取的离子谱图fig.3extractedionchromatogramofurotropinestandardsolution2.5方法的回收率与精密度分别取阴性的腐竹和米粉样品进行3个水平(1,2和5g/kg)的加标回收实验,每个加标水平取6个平行样,实验结果见表2.由表2可见,样品的平均回收率为91.0%一96.6%,相对标准偏差为2.6%一5.2%.因此,该方法显示了较高的准确度和精密度.表2样品中乌洛托品的回收率与相对标准偏差(n=6)tab.2recoveriesandrelativestandarddeviationsofurotropineinspikedsample(n=6)2.6实际样品检测从市场上购买了10份腐竹和20份米粉样品进行分析,均未检出阳性样品.3结语文中建立了腐竹和米粉中乌洛托品残留的超高效液相色谱.串联质谱(uplc.ms/ms)分析方法,该方法前处理简单,回收率高,精密度好,方法定量限为1.0kg,可适用于腐竹和米粉中乌洛托品的确证检验,为进一步打击食品生产中违法添加非食用物质乌洛托品的行为提供检测方法.参考文献(references):1吴艳波.腐竹的营养功效及鉴别技巧j.现代农业科技,2011,(8):337,339.wuyan-bo.thenutritionalbenefitsandidentificationskillsofyubaj.modemagriculturalsciencesandtechnology,2011,(8):337,339.(inchinese)2wouterjmiddelhoven,wimvandoesburg.utilizationofhexamethyrlenetetramine(urotropine)bybacteriaandyeastsj.biomedicalandlifesciences,2007(91):191196.3刘晓毅,穆同娜,田艳玲,等.面粉,腐竹中甲醛本底的分析j.粮油加工与食品机械,2006(6):62-63,69.liuxiao-yi,mutong-na,tianyan?ling,eta1.analysisthebackgroundeffectoftheformaldehydeinflourandyubaj.maehingeryforcerealsoilandfoodprocessing,2006(6):62-63,69.(inchinese)4中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.sn/t2226-2008进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的检测方法液相色谱.质谱/质谱法s.北京:中国标准出版社,2009.5黄国春.气相色谱法测定腐竹中乌洛托品含量的研究j.广西轻工业,2008,6(6):26.27.82江南大学(自然科学版)第l1卷huangguochun.determinationoftheurotropinecontentindrybeancurdstickbygaschromatographyj.guangxijournaloflightindustry,2008,6(6):2627.(inchinese)6李薇,陈天科,徐辉,等.乌洛托品的气相色谱分析j.分析仪器,2007(3):2931.liwei,chentianke,xuhui,eta1.gaschromatographicanalysisofurotropinej.analyticalinstrumentation,2007(3):2931.(inchinese)7魏运金.粮食制品中雕(吊)白块六亚甲基甲四胺的检测j.福建轻纺,2004,183(8):1619,33.weiyun-jin.determinationofsodiumformaldehydesulfoxylateandhexamethylenetetramineinfoodproductsj.thelightandtextileindustriesoffujian,2004,183(8):1619,33.(inchinese)8中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国际标准化委员会.gb/t23296.26-2009食品接触材料高分子材料食品模拟物中甲醛和六亚甲基四胺的测定分光光度法s.北京:中国标准出版社,2009.9朱晓艳,陈少鸿,刘在美,等.乙酰丙酮分光光度法测定塑料中甲醛和六亚甲基四胺在食品模拟物中的迁移量j.食品科学,2009,30(12):172174.zhuxiaoyan,chenshaohong,liuzaimei,eta1.acetylacetonespectrophotometricdeterminationofmigrationofformaldehydeandhexamethylenetetraminefromplasticsintofoodsimulantsj.foodsciense,2009,30(12):172174.(inchinese)10陈少鸿,刘在美,朱晓艳,等.变色酸分光光度测定塑料中甲醛和六亚甲基四胺在食品模拟物中的迁移量的改进方法j.食品科技,2009,30(4):259-261.chenshaohong,liuzaimei,zhuxiaoyan,eta1.developedtestmethodofmigrationofformaldehydeandhexamethylenetetraminefromplaticsintofoodsimulantsbyspectr0ph0tometrywithchromotropicacidj.foodscienseandtechnology,2009,30(4):259261.(inchinese)11leonardopezza,matthieutubino,cristobmelios,eta1.rapidspottestanalysisforthedetectionofdipyroneinpharmaceuticalpreparationsj.analyticalsciences,2000(16):313.12马昌.非水滴定法测定乌洛托品含量的实验研究j.青海师范大学民族师范学院,2001(1):6667.machang.determinationofcontentofmethenaminebynon