（茶学专业论文）油茶总皂苷分离与纯化研究.pdf

摘要 本论文是存前人研究的基础上进行油茶总皂苷的分离与纯化工艺的研究 论文分 四部分进行 如下 第一部分 采用干柱层析制备油茶皂苷刑照品 将样品干法上样并用乙酸乙酯 甲醇一j 卜i 丁醇一水 3 2 5 1 0 的上栩展层 根据可值取出相应的条带并用甲醇淋洗收集蒸 十 薄层及理化性质检测 结果表明 该方法所制样品由薄层色谱为一点 纯度较高 该方法简便 实用且制备量大 j u 作为油茶总皂苷对照品 第二部分 利用高效液相色谱及质谱 电唢雾 e s i 对于壮层析法所制备的油茶总 皂苷 s q s 进分离及质量分析 结果表明 通过液相色潜及e s i 质谱图 二f 二柱层析所 得的油茶皂苷为一混合物 可能为含有二至三糖的皂苷 分子量在8 0 0d a l t o n 12 0 0 d a l t o n 范围内 与文献报道相符合 第三部分 通过陶瓷膜微滤去除油茶籽饼粗提液中的杂质 以提高油茶籽籽饼q j 主要活性成份油茶皂营的得率与纯度 实验结果表明 以5 0 乙醇超声提取油茶皂 昔 拙滤厉 以3 浓度的油茶皂苷进行o5um 微滤 压力控制在0lm p a 0 i5m p a 温度控制在4 0 左右 油茶总皂营的转移宰约达8 9 2 5 除杂率约1 4 5 纯度相 对较好 过滤后的透过液清彻 黄亮 作为前处理微滤 应用于j f 业化 具有定的 可行性 笫四部分 通过选用的吸附活性炭纯化油茶皂苷 以总皂昔的得率及纯度为考察 指标 确定活性炭吸附富集油茶总皂苷的性能 洗脱参数及再生使用情况 结果表明 水洗之后再以9 0 乙醇洗脱较好 香草醛一浓硫酸为检测方法检测一f 总皂苷解吸 得率为6 2 9 纯度为8 7 1 以l 该类活 生炭在分离纯化及脱色方面作川较显著 关键词 油茶皂苷 干柱层析 颗粒活性炭 陶瓷膜 微滤 a b s t r a c t y u n f e it u f h ed i s c i p l i n eo ft e as c i e n c e d i r e c t e db yp r o f x i a n f e n gd u t h i sd i s s e r t a t i o ns t u d i e st h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fs q sb a s e do nt h ep r e v i o u s r e s e a r c h i n g f o u rp a r t sd i v i d e di nt h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s p a r ti t oe s t a b l i s hap r e p a r a t i v em e t h o df o rt o t a lo i lt e a s a p o n i n sa sr e f e r e n c e s u b s t a n c ef r o mt h es e e d so fc a m e l l i a0 把娩r a la b e lb yd r yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya f t e r r a wm a t e r i a lb e i n ge x t r a c t e dw i t h6 0 e t h a n o l t h ee t h a n o le x t r a c t sw e r ee v a p o r a t e dt o a l c o h o l e s si nv a c u u ma n dt h es o l u t i o nw a se x t r a c t e db yp e t r o l e u mb e n z i n e t h e nt a k i n g o f ft h eu p p e rs o l u t i o n a n da d d i n gt h r e et i m e sv o l u m eo fb u o hf o re x t r a c t i n g a n dt h i s t i m et h e t i p p e rs o l u t i o nw a se v a p o r a t e dt od r y n e s si nv a c u u m t h ed r yp o w d e rw a s f r a c t i o n a t e db yd r yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yo ns i l i c ag e l 1 0 0 2 0 0m e s h u s i n gt h eu p p e r s o l u t i o no fe t o a c m e o h b u o i i h 2 0 3 2 5 1 0 1a st h ee l u e n tt h ec o l l e c t e df r a c t i o nw a s t a k e no u tb yt h e 可v a l u e a n dt h e np u tt l mf i a c t i o ni n t og l a s sc o l u m nt oc o l l e c t i n gt h e s o i n t i o nb yu s i n gm e o ha se l u e n t a f t e re v a p o r a t i n gm e o hw i t ht h es o l u t i o nt o g e tt h e t o t a lo i lt e a s a p o n i n s a n dd e t e c t i n gt h es a p o n i n sb yt l c t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y a n d p h y s i c a l c h e m i c a lp r o p e r t i e s t h ep u r i t yo f t h ep r o d u c tq u a n t i z e db yt i cw a so v e r9 8 t h e r e f o r e t h ed e v e l o p e dm e t h o di ss i m p l e r a p i da n dt h eq u a n t i t yo fo i lt e as a p o n i n sa l s o i sm o r et h a nn o r m a lp r e p a r a t i o nm e t h o d s a l lt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r e p a r a t i o n s u b s t a n c eo fa l lt h eo i l t e as a p o n i n ss h o u l db ea sr e f e r e n c es u b s t a n c e p a r ti i u s e dt h eh p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a n dh p l c m s m a s ss p e c t r o m e t r y 一e s l e l e c t r o n i cs p r a yi o n i z a t i o n t os e p a r a t ea n da n a l y s i st h e s a s a n q u a s a p o n i n w h i c h g o t f r o mt h e d r y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h yt h r o u g h t h e c h r o m a t o g r a mo fh p l ca n dt h es p e c t r o m e t r yo fe s i a sar e s u l t t h es a s a n q u a s a p o n i nw a s am i x t u r ew h i c hm i g h tb ec o n t a i n i n gt w oo rt h r e em o n o g l y c o s i d e sa n dt h em o l e c u l a r w e i g h to ft h es a s a n q u a s a p o n i nw a sf r o m8 0 0 m 2 0 0d a l t o n w h i c hi na c c o r dw i t ht h e l i t e r a t u r e s p a r t l i i u s e dt h ec e r a m i cm e m b r a n et or e m o v et h er e s i d u e so fc r u d ee x t r a c t sf r o mt h e c a k eo fco l e q e r na b e ts e e d sf o r i m p r o v i n gt h ep r o d u c t a n d p u r i t y o ft h e s a s a n q u a s a p o n i n t h eu l t r a s o n i ce x t r a c t i o nw i t ht h ea l c o h o lo f5 0 w a st r e a t e db yt h e m e m b r a n eo f0 5t tm p o r e s t h ef e e dc o n c e n t r a t i o nw a s 3 w v t h eo p e r a t i o np r e s s u r e w a sa b o u t0 1 m p a 0 1 5m p a a n dt h et e m p e r a t u r ew a sa b o u t4 04 c u n d e rt h o s e c o n d i t i o n s w ea c q u i r e dab e t t e rc o n c l u s i o nt h a tt h em e t a s t a s i sr a t eo ft h et o t a l s a s a n q u a s a p o n i nw a sa b o u t8 9 2 5 a n dt h ee l i m i n a t i o nr a t ew a sa b o u t145 a 1 s ot t l e p e r m e a t i o nl i q u i do ft h em i c r o f i l g a t i o nw a sc l a r i f i c a t i o n s ot h ec c r q t l 2 1 cm e m b r a n cu a sa p r o m i s i n gf i e l di nt h ep r e t r e a t m e n to ft h ec r u d ee x t r a c t i o no ft h es a s a n q u a s a p o n i na n da p o s s i b i l i t y i nt h el n d u s t d a l i z a t i o n p a r t l v s e l e c t e das p e c i a lg r a n u l a ra c t i v a t e dc a r b o nt op u r i f ys a s a n q u a s a p o n i n u s i n g t h ep l e d u c t i o n p u r i t ya si n d e xo fe x a m i n a t i o nt h r o u g ha l lt h ee x p e r i m e n t sa n dt h e v a n i l l i n 一 2 8 0 4c o l o r i m e t r yv v a su s e dt oa n a l y z et h ec o n t e n to ft o t a ls a p o n i n s a n dt h e a d s o r p t i o np e r b r m a n c ea n dt h ee l u t i o np a r a m e t e r sa n dt h er e g e n e r a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee f f e c to f9 0 e t h a n o lw l maf i e wr a t eo f10b v hw a sb e t t e r a n dt h ee l u t i o nr a t i oo fs u s a n q u a s a p o n i nw a s9 24 i n c l u d i n gw a t e rc l u t i o na n dt h e r e c o v e r yo ft h es a p o n i n sw a s6 2 9 w i t h o u tw a t e re l u t i o n t h ep u r i t yo fs a p o n i n sw a s m o r et h a n8 7 1 a sar e s u h t h i sg r a n u l a ra c t i v a t e dc a r b o nc a l lb eu s e dt or e f i n et h e s a s a n q u a s a p o n i ni nt h ec a k eo fco l e i r e p aa b e l s e e d sf o ri t ss i m p l ea p p l i c a t i o np r o c e s s l o w p r i c ea n ds oo n k e yw o r d s s a s a n q u a s a p o n i n d r yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y g r a n u l a ra c t i v a t e d c a r b o nc e r a m i cm e m b r a n e m i c r o f i l t r a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料 与我一同 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文r 1 作了明 确的说明并表示了谢意 研究生签名j 乞生垒 关于论文使用授权的说明 6 月d 胡 本人完全了解安徽农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 町以采用影印 缩印或扫描等复 制手段保存 汇编学位论文 同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名 笔蔓垡 第一导师签名触 嗍 7 孵胪日 时间 扩7 年莎月锣同 年 汐 文献综述 o 1 油荼总皂苷的研究现状 0 1 1 油茶籽中皂苷的结构与总皂苷的药理功能研究进展 油茶 co l e i f e r a a b e l 属山茶科 t h e a c e a 山茶属 c a m e l l i a 植物 为多年生乔木 或灌木 l 为我国南方重要的木本油料作物 广泛分布于江西 湖南 福建 广东 广西 等十几个省 我国油茶林面积约为6 0 0 0 多万亩 一亩约为o 0 6 6 7 公顷 茶 油年产量约为1 5 亿千克 茶籽饼则在5 6 亿千克 油茶籽中总皂苷的含量随产地 榨油方法不同 在99 扣1 3 g 之间 因此资源极其丰富 油茶籽富含茶油和油茶皂 苷 油茶皂苷在干茶籽中的含量约为1 0 2 分子量较大 极性较强 是一种性能 优良的非离子型天然表面活性剂1 3 l 1 9 3 1 年日本学者青山新次郎 4 l 首次从茶树种子 中分离得到皂苛 至今的科学研究已从油茶籽中分离出3 种油茶皂苷元的化合物1 5 油茶皂苷为五环三萜类皂昔 由配基 糖体 有机酸所组成 配基为 一a m w i n 衍 生物 基本碳架为齐墩果烷 o l e a n a n e 具有多氢蒎的五环f 6 油茶皂苷的结构式f 7 见图一所示 当c 连着羟基时 为山茶皂苷c c a m e l l i a s a p o n i nc 当c 2 3 连若丙酰基时 为油茶皂苷a o l e i f e r a s a p o n i na 圉一油茶皂苷结构式 f i g 1s t r u c t u r e so f t h es a s a n q u a s a p o n i n 最近的科学研究表明 油茶总皂苷除具有皂苷所具有的对软体及鱼的溶血和鱼 毒作用 8 1 外 还具有抗菌作用 朱恒英 9 1 等选用几种常用造成皮肤浅表感染的真菌 用油茶皂苷做体外抗菌试验 证明油茶皂萤的抑菌作用较好 对玫瑰色毛癣菌作用 最强 与克癣唑药水的抑制作用相近 最低抑菌浓度 m i c 为0 3 7 5 对红色毛癣 菌和铁锈色小孢菌m i c 为5 抗突变作用i l 陈泳培等采用了t a 9 8 和t a l 0 0 标 准试验菌株 试验结果显示油茶总皂苷具有较强的抗突变作用 其抗突变力与三种 民间常用的抗突变中药紫草根 夏枯草和风尾草相当 近年来学者们将油茶总皂苷 s a s a n q u a s a p o n i n s q s 对心脑血管影响进行了深 入的研究 1 s q s 对缺氧复氧所导致大鼠心脏损伤的保护作用 t 2 1 3 1 结果表明油茶 总皂苷能增加心肌的收缩能力 使氧自由基清除剂超氧化物岐化酶 s o d 谷胱苷 肽转移酶 g s h p x 活性增强 脂质过氧化产物丙二醛 m d a 生成减少 降低心肌组 织钙含量 人体肌酸激酶 c k 生成减少 对心肌缺氧再给氧 a 瓜 损伤具有保护作 用 2 n o 介导的s q s 对在体大鼠产生的药理活性预适应保护作用 1 4 1 结果表明预 适应i vs q s 能有效的保护i s o 所至大鼠心肌损伤 先驱亚甲基蓝i v m e t 后再给与 s q s 则s q s 对心肌损伤的保护作用明显减弱 说明s q s 对盐酸异丙肾上腺素0 s o 所至心肌缺血大鼠可产物药理性预适应保护作用 3 s q s 对缺氧复氧诱导的内皮细 胞损伤及中粒细胞黏附的影响 1 5 l 结果表明缺氧复氧能导致人脐静脉内皮细胞 h u v e c 操作及中性粒细胞黏附的增加 表现为乳酸盐脱氢酶 l d h 活性 m d a 水平及中性粒细胞黏附率显著升高 而s o d 和g s h p x 活性显著下降 s q s 呈浓 度依赖的对抗上述改变 说明s q s 对缺氧复氧诱导的h u v e c 损伤具有保护作用 0 1 2 油茶总皂苷的提取工艺研究现状 油茶籽中除具有丰富的油茶总皂苷 还具有大量的与油茶皂苷结构相似的黄酮 苷类物质 怕l f 结构见图二所示 因此 除去黄酮类物质是纯化油茶总皂苷的关键 0 1 2 1 油茶皂苷的提取 油茶皂苷的粗提 8 6 取主要有水提法和醇提法 包括含水甲醇及含水乙醇 这两 种方法所得的茶皂苷色泽深且含量均偏低 无法适应精加工的需要 0 1 2 2 油茶皂苷的分离纯化 由于皂苷的多样性和复杂性 给它的分离和结构鉴定带来困难 所以目前皂苷 的研究工作仍然集中在这方面 传统皂苷分离纯化中的沉淀法有分段沉淀法 铅盐 沉淀法和胆固醇沉淀法1 1 7 等 沉淀法中有机溶剂和重金属的大量使用与残留易导致 产品的毒性增强和纯度不高 并且分离得到的皂苷纯品很少 现阶段的分离纯化物质的方法运用于油茶皂苷的主要有 1 正丁醇萃取法 s 得 f 丁醇层 浓缩至干 得到棕黄色粘稠固体 此法得到的皂苷颜色太深 且杂质 较多 2 重结晶法f s 引 此法虽然所得产品的纯度较高 但得率较低 不适用于工 业生产 并且茶皂苷分子量较大 不易结晶 3 离子交换树脂法0 8 1 由于茶皂营 为非离子表面活性剂 因此用一般的离子交换树腊进行分离纯化难以达到目的 4 2 絮凝剂法1 1 9 目前所得产品纯度不高 有毒物质残留量大 但如能找到合适的絮凝剂 则可结合其它方法使其纯度增加以满足需要 5 大孔吸附树脂法 高效液相色谱 法和膜滤法 2 0 2 4 r y 咏 0 矗惫y 一k 嘟 左l 山紊酚 3 0 山鼠李毂i 母1 3 d 葡糖苷 k m p f l 3 na l r h a m n o p y r a n o s y l i 印p d g l u c o p y r a n l o s i 出l 左下 山奈酚 3 0 f 2 o o l 鼠李糖 6 ob d 葡糖苷 9 d 葡糖苷 k a e m p f e r o l 3 0 一 2 0o 1 r h a m n o p y r a n o 刚 6 o b d g l u c o p y r a n o s y l 1 3 一d g l u c o p y r a n o s i d e l 右上 山奈酚 3 o 2 o q l 术塘 6 o 9 d 鼠李糖 8 d 葡糖苷 f k a e m p f e r o l 3 o 1 2 o b d x y l o p y r a n o s y l 6 一o a l r h a m n o p y r a n o s y l 0 d g l u c o p y r a n o s i d e 右下 山奈酚 3 0 2 0 a l 鼠李糖 6 o b d 木糖 1 3 d 葡糖苷 f k a e m p f e r o l 3 0 2 0 l r h a m n o p y r a n o s y l 6 0 b d x y l o p y r a n o s y l t b d g l u c o p y r a n o s i d e 国二黄酮苷类结构式 f i g 2s t r u c t u r eo f f l a v o n e sg l y c o s i d e 0 1 2 3 大孑l 吸附树脂法 大孔吸附树脂吸附液体里的物质 主要通过表面吸附 表面电性形成氢键来分 离物质 朱英1 2 0 l 等利用大孔树脂法对油茶饼中的皂苷及黄酮苷进行分离 具体步骤 为 取3g 浸膏用热水溶解一上预处理好的大孔吸附树脂柱一用水及乙醇依次按 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 9 5 梯度洗脱并收集各部分洗脱液 并进行浓 缩一得成品 并用薄层层析色谱法 t l c 进行鉴定 另据郭柏淑等人报道 2 1 1 采用d 3 1 5 型大孔树脂来实行分离 其制备流程如下 粉碎油茶籽饼粕 1 0 0 9 加7 5 乙 醇回流 l 0 2 n a o h 洗脱 一水洗至无色 一大孔树脂 厂 人 红棕色物质再以2 0 4 0 7 0 的乙醇洗脱 l 加无水乙醇热溶浓缩物 一收集此部分洗脱液并浓缩至干 冷却静置析出沉淀得成品 大孔树脂所得产品纯度较高 但仍不能满足现阶段的大批量生产的需要 主要 是一次性投资高 后继处理复杂 设备庞大 并且大孔树脂的制孔剂及降解产物的 毒性也限制了它在工业化生产中的运用 0 1 2 4 制备型高效液相色谱法 近年来高效液相色谱法 h p l c 已应用于皂苷的分离制备 h p l c 在茶籽皂苷 上的应用分离的步骤如下 2 2 l 除去茶籽壳和皮得2 5 0g 一4 0 减压干燥并制成粉得1 2 9 0 9g j 下已烷脱脂 5 0 0 m l 2 一8 0 甲醇 5 0 0 m l x 2 提取一4 0 真空浓缩并干燥得淡黄色固体 取 1 6 7g 该粗品溶解于4 0 甲醇5m l 色谱条件为 l o b a rp r e p a c kr p 一1 8 m e r c k 2 5 r n m x3 1e m 检测波长为2 5 0n m 流速3r n l m i n 进样量为5m l 流动相用4 0 1 0 0 的甲醇梯度洗脱一收集相应的峰得油茶皂素 利用h p l c 可使其纯度达到很高 但是仪器本身的操作难度及费用是目前工厂 所不能承受的 o 1 2 5 超滤膜法 超滤是利用压力为推动力的一种物理筛分过程 影响超滤膜截留分子的因素有 溶质的形状与大小 溶质与膜材料之 自j 的相互作用 浓差极化 测试条件等 2 5 而 且截留相同相对分子质量的不同材质的超滤膜对溶质的截留率也可能不一样 2 6 1 黄 自强1 2 3 l 利用中空纤维膜精制油茶皂苷 工艺流程如下 原液 5 0 0m l 3 0 0 0m l p h 为0 7 皂苷浓度约5 储罐出1 2 1 一蠕动泵入1 2 1 一 蠕动泵出口一隔膜压力表 约o 1 2 9m p a 一中空纤维超滤器一浓缩液一原液储罐 曹万新 硎等探索的最后工艺流程为 油茶饼粕一粉碎一浸提一浆渣分离一絮凝一离心分离 或板框过滤 一预滤一精 滤一超滤一喷雾干燥一成品 4 虽然膜分离技术与常规的分离方法相比 具有节能 分离效率高等特点 但是 料液需预处理 并且浓差极化 膜污染是目前普遍的难题 0 2 皂苷类物质的提取分离及结构研究现状 0 2 1 皂苷类物质的提取与分离 皂苷作为一类结构比较复杂的糖苷类化合物 广泛地存在于植物和海洋生物 中 现代医学研究表明 皂苷类化合物具有十分广泛的药理作用 目前 在我国许 多以皂苷类化合物为主要有效成分的药物都具有很好的疗效 因此研究人员对于皂 苷类化合物的结构研究有着着愈来愈浓厚的兴趣 然而皂苷类化合物具有极性大 难挥发 分子量大等特点 给分离纯化及结构鉴定带来很大的困难 对于这类化舍 物结构的研究远落后于生物碱与黄酮类 在总皂苷的提取过程中 使目标成分含量较高 便于富集 以利于精制和纯化 的方法主要有活性炭吸附法 2 7 1 大孔树脂法 2 8 0 等方法 总之 在提取制备工艺过程中 应根据不同皂苷的特点 选取不同的方法 或 综合利用多种方法才能达到比较满意的转化 富集 分离与纯化的效果 0 2 2 皂苷类物质结构研究方法 目前 皂苷类结构研究口 主要通过化学方法及现代的波谱方法 现分述如下 1 化学方法 酸水解 它是常用的一种水解方法 一般在2m o l l 的盐酸中回流4 6h 由 于水解条件较剧烈 常伴有脱水 构型转变等副反应 二相酸水解采用二相溶剂 使生成的苷元能进入有机相 减少苷元与酸接触时i 8 j 防止被破坏 将江南紫会牛 皂苷在等体积的苯 现在一般采用石油醚 因为苯毒性大 和7 盐酸水甲酵两相中 6 0 恒温反应 不断分取苯层 水洗至中性 减压回收苯得白色粉末 甲醇结晶得 一新皂苷元 碱水解 适用于酯皂苷 酚苷和稀醇营 一般用5m o l l n i h o h 和3t 扣5 k o h 溶液 三萜皂苷中一些立体障碍较大的酯营键 常需较强碱性条件 因此易 引起苷元降解和糖异构化 在无水乙醇中与无水l i i 和2 6 二甲基吡啶中进行反应 与苷元以酯键结合的糖链以甲苷的形式定量得到 而对糖糖间苷键无影响 0 化学降解法 又称s m i t h 降解法 以过碘酸氧化糖苷 苒以四氢硼钠还原 酸性接解后得到原皂苷元 这是获得原形苷元一直沿用的一种方法 酶水解 它具有特定的选择性 条件温和 不同酶可以作用不同组成的苷键 不仅可以获知苷键构型 还可以得到保持结构不变的原皂苷元 由于构成皂苷糖种 类并非一种 所以采用各种糖苷混合酶进行水解 效果很好 利用粗橙皮酶及桔柑 酶水解了人参皂苷和竹叶参皂苷 土壤细菌法 土壤中某些微生物具有水解皂苷的能力 将细菌接种在含有皂 苷的揞养基上 使苷元分解出来 闩本吉冈一郎教授等以此法研究了皂营的水解 对酸不稳定易发生结构改变的三萜皂苷能得到原皂营元 回收率较高 紫外光分解法 利用紫外线对皂苷进行照射 直接与苷元相边的是葡萄糖醛 酸 阿拉伯糖或半乳糖可以通过光解反应解离出苷元 2 光谱方法 紫外光谱 u v s 大多数三萜皂苷没有共轭体系 所以在2 0 0n i i l 4 0 0n m 区段无吸收峰 但三萜皂苷在硫酸 三氯化锑等l e w i s 酸作用下 经过脱水 双键 位移 缩合等一系列反应可以产生有色的或有荧光的物质利用这些反应可以进行初 步鉴别及定量分析 o 红外光谱法 i r 利用分子吸收红外线引起分子振动能级的跃迁 分子振动 有许多基本振动形式 根据振动方向的不同 振幅不同 其振动能级各异 可以吸 收各种波长的光线形成红外光谱 因而根据不同骨架的三萜皂苷在1 3 9 2c m l 1 2 4 5 e m 特征区的吸收不同来确定其基本骨架 o 质谱 3 i m s 利用不同质荷比的离子在静电场和磁场中所受的作用力不 同 因而运动方向各异 导致彼此分离 经过分别捕获收集 从而确定离子的种类 和相对含水量量 最后求得样品中定性及结构和定量分析结果 在结构鉴定中常有 以下几种 激光解吸质谱 l d m s 用能量较低的光子来解吸附被分析的物质 显 著地扩大了质谱的质量测定范围 场解析质谱 f d m s 此种方法从根本上改变了 非挥发性有机化合物的结构研究手段 主要出现的 m 计4 a 与 m k 离子峰 它提 供了有关分子量和分子糖链连接顺序的信息 特别是灵敏度高 分子离子峰强度大 但其它信号少 对分子量以外的结构苷元信息提供较少 快速原子轰击质谱 f a b m s 按离子源可分为正离子快原子轰击质谱和负离子快原子轰击质谱 的者 出现 m h 准分子离峰 后者出现 m h 较强的准分子离子峰 而没有其它附加峰 易于辨认 本法优点在于不需衍生化就可直接给出分子离子峰 并可排除样品中杂 质的干扰 负离子化学电离质谱 n i c i m s 产生 m 及糖碎片 灵敏度高 选择性 强 对有极性大 热不稳定的三萜皂营有效 快速解吸化学电离质谱 f a b m s 它 具有明显质子化学离子峰及丰富的特征碎片 易于进行结构鉴定 二次离子质谱 s i m s 又称次级离子质谱 高分辨质谱 h r m s 现主要用来测定三萜皂苷分子 量 3 核磁共振法有磁矩的原子核 1 h 1 3 c 在磁场的作用下 以射频进行照射产 生能级跃迁而获得共振信号 它根据化学位移 偶合常数 峰面积与氢原子数目成 比例三个参数来解析图谱 主要分为以下几种 氢i n 1 h n m r 三萜类化合物的氢谱主要获取信息的质子信号是双健 质子 连氧质子及甲基质子 从甲基的数目可以判断苷元类型 高分辨n m r 观察糖的端 6 基质子数可以决定糖的个数 从偶合常数判断糖的构型 o 碳谱 1 3 c n m w 通过测定糖的苷化位移 苷元的苷化位移来确定糖糖和糖 苷元的连接位置 判断糖链及支链数目 判断糖的数目 通过端基碳的 6c 1 和偶 合常数 j 3 1 3 c 1 h 来判断苷键构型 还可得知苷键稳定性 0 二维核磁共振谱 2 d n m r 二维n o e 二维远程 h 1 h c o s y 它依靠 1 h n m r 的交叉峰识别 二维远程 3 c l h c o s y 和选择性i n e p t 则依靠远程的 c j h 偶合作用 它可直接确定深入研究皂苷的分子结构 避免了繁琐的化学降解 4 旋光谱 具有光学活性的化合物能使偏振光的振动面发生旋转 在不同波长 下测量物质的旋光度 根据h o d s o n 法则 按k l y n e 方法比较皂苷 次级皂苷 苷 元分子旋光比 与已知构型的该糖 对甲苷分子旋光比对照 即可知各苷键构型 5 偶合激发圆二色散谱 此方法不要参考物质就可以确定手性原子的绝对构型 而且不破坏样品 用量也很小 6 x 一射线晶体衍射法 基于x 射线对原子最内层电子间的作用进行物质结构分 析 对易结晶的三萜皂苷化合物可以确定其结构 随着分离精制技术的提高 很多 皂苷都能较好地获得单体结晶 它也成为皂苷结构研究的有力工具 7 毛细管电泳 以弹性石英毛细管为分离通道 以高压直流电场为驱动力 根 据样品中各组分之问分配行为上的差异而实现分离 现主要用于三萜皂苷中糖链分 析 以上均为近几十年来三萜皂苷提取分离结构鉴定中所采用的方法 随着科学技 术的发展 各种新技术的应用 三萜皂苷的研究工作将得到更大的发展 0 3 皂苷类次生代谢产物的定量研究现状 运用于皂苷类物质含量测定技术主要有比色法 薄层色谱法 高效液相色谱法 等 其中颜色反应仍占较为重要的地位 比色法就是利用这些颜色反应对皂苷进行 分析测定 用于三萜皂苷颜色反应的试剂有浓硫酸 香草醛 浓硫酸 香草醛一冰醋 酸 香草醛 高氯酸 等 其可能反应如下 7 旷 n 邺 叱 o c h 3 o 图三 油系皂苷在浓硫酸作用下与香草醛的显色反应 f i g 3p o s s i b l er e a c t i o no f v a n i l l i n h z s 0 4c o l o r i m e t r yw i t hs o s 0 4 干柱层析在物质分离中的运用概述 随者层析技术的不断发展 薄层层析已成为实验室的常规技术 并得到普遍应 用 在长期的实践过程中 发现薄层层析的分离效果比湿装的柱层析高 79 1 因此 有些用杜层析难以分离的混合物 采用制备性薄层来分离 但是 用薄层分离的样 品量有限 为了寻找高效的制备性层析分离方法 经过长期探索 终于在六十年代 中期发现于柱层析的分离效果与薄层层析相当 并对其实验技术做了改进 进而使 干柱层析得到复兴 干柱层析是指用填充剂干装成的柱进行层析分离的方法 它已广泛用于制备性 分离 包括人工合成的混合物和自然界中存在的复杂混合物 干柱层析的原理与薄 层层析相同 尤其是不加粘合剂的干推硅胶薄层板 它们都是以于填充剂填层析床 并借颗粒问的孔隙所产生的毛细作用而展层 因此 薄层的分离条件可以套用到干 柱上 分离效果办相同 由于填充剂颗粒的深孔内充满空气 在展层过程中 溶剂 和样品分子很难进入颗粒的深孔 其吸附与解吸附过程主要在填充剂颗粒的外部表 面进行 这样 克服了样品分子由于进出填充剂颗粒深孔所造成的扩散及传质缓慢 因此其柱效比湿装柱高 其具有如下优点 1 分离效果比湿装柱高 2 分离条件可用薄层层析探索 并可把薄层的最佳分离条件直接套用到干柱层 析 3 由于实验中可以采用塑料薄膜柱 对有荧光或颜色的物质 可在紫外光灯下 将已分离的各层带分别切开 避免常规液相层析中因流出液收集不当而造成的层带 交叉 4 适用于制备性分离 5 设备简单 消耗少 工时省 其主要缺点是 样品容量比湿装柱小 因此 消耗填充剂量大 o 5 活性炭在物质分离中的运用概述 活性炭柱层析对于分离水溶性物质 如氨基酸 糖类及某此营类 是一种较好的 方法 它是分离水溶性物质的主要方法之一 其特点是样品上柱量大 分离效果好 且活性炭来源较易 价格便宜 适用于大量制备分离 其不足之处主要是由于活性 炭的生产原料不同 制备方法及规格不一 其吸附力不象氧化铝 硅胶那样易于控 制 到目前为止 尚无测定其吸附力级别的理想方法 因而限制了其广泛应用 用于层析的活性炭基本上可以分为三类 粉末活性炭 颗粒状活性炭 锦纶 活性炭 这三类活性炭的吸附力以第一类粉末状活性炭吸附力最强 第二类颗粒状 活性炭次之 第三类锦纶 活性炭最弱 在层析分离时 根据分离物质的特性 选择 适当吸附力的活性炭乃是分离成功的关键 当欲分离的物质不易被活性炭吸附时 则要选择吸附力强的活性炭 当欲分离的物质很易被活性炭吸附时 则要选择吸附 力弱的活性炭 在首次分离某种样品时 一般首先选用第二类活性炭 研究表明 活性炭在水溶液中的吸附力最强 在有机溶剂中吸附力较弱 在一定条件下 对不 同物质的吸附力也不一样 一般有如下规律 1 对极性基团 如羧基 氨基 羟基 等 多的化合物的吸附力大于极性基团少 的化合 2 对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物 因而可借此性质将芳香族氨基 酸与脂肪族氨基酸 两者的氨基与羧基数目相同 分开 也可将某些水溶性芳香族物 质与脂肪族物质分开 主要可能是因为活性炭的表面张力吸附性质对芳香基团有较 大的亲和力造成 3 对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物 例如 活性炭对肽的 吸附力大于氨基酸 对多糖的吸附力大于单搪 因此可利用活性炭分离氨其与肽 单糖与多糖 氨基酸 单糖先洗脱下来 肽 多糖后洗脱下来 9 1 引言 1 1 目的与意义 我国各类茶籽资源十分丰富 利用潜力巨大 开发茶皂菅类物质的应用有重要 的现实意义和十分广阔的前景 油茶籽具有丰富的对人体有益的茶油 近年柬为人 们所关注 弗且其需求量呈逐年增长趋势 因而在市场需求的前提下 其种植面积 及产量也在大幅度增长 油茶籽在榨取油后 其饼粕还具有丰富的次生代谢产物油茶皂苷 并且油茶类 植物具有悠久的民间药用历史 但油茶皂苷的产品纯度及精加工至今乃未得到根本 的解决 从而影响油茶总皂苷的充分利用 至使我国大量的油茶籽饼出口到国外 因此 解决油茶籽饼的利用 开发出具有实际可行的生产工艺 拓宽油茶总皂苷及 分离出的单一皂营的实际用途 增加当地农民的收入 丰富人民的生活水平具有重 要的社会意义 1 2 研究内容 本论文结合油茶皂苷的化学特性 运用干柱层析法制备油茶总皂苷标准品为以 后油茶总皂苷的提取定量作准备 并对其组成成分进行了初步的液质联用分析 同 时将颗粒活性炭及陶瓷膜等高新技术运用于油茶皂苷的提取与纯化当中 具体分如 下进行 1 2 1 干柱层析法制备油茶总皂苷对照品的研究 1 2 2 油茶总皂苷的高效液相色谱分离与质谱分析 1 2 3 油荼籽饼粗提液陶瓷膜徽滤的研究 1 2 4 颗粒活性炭柱分离纯化油茶皂苷的研究 1 0 2 材料与方法 2 1 试材 油茶籽饼购于黄山市油茶厂 层析硅胶 1 0 0 目 2 0 0 目 青岛海浪硅胶干燥荆厂制造 薄层层析硅胶 青岛海洋化工有限公司制造 色谱柱 a n g i l e n t t c c 1 8 2 5l a m 2 5 0m m x 4 6m m 油茶总皂苷标准品由实验室干柱层析制备 粒状活性炭 2 0i 暑一5 0 目 中国林科院林产化工研究所一江苏省溧阳市活性炭联 合工厂出品 符号批号 q 3 2 0 4 2 3 l h g 一0 0 7 9 2 分析纯 2 2 仪器与试剂 1 主要仪器 a b l 0 4 n 电子天平 梅特勒一托利多仪器 上海 有限公司 z f i 型三用紫外分析仪 上海顾村电光仪器厂 u 3 0 1 0 紫外扫描仪 h i t a c h i 傅立叶变换红外光谱仪 n i c o l e r1 7 0s x 高效液相色谱仪 w a t e r s6 0 0c o n t r o l l e r 2 4 8 7d u a la b s o r b a n c ed e t e c t o r 液质联用色谱仪 f i n n i g a nl c qa d v a n t a g em a xi o nt r a pm s 真空泵 河南省巩义市英峪予华仪器厂 真空干燥箱 德国m m m 公司 b s 1 0 0 a 自动部分收集器 上海沪西仪器厂 k q 2 5 0 d e 型医用数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 u v 2 1 0 2 c 型紫外可见分光光度计 尤尼柯 上海 仪器有限公司 无机陶瓷膜过滤设备 合肥世杰膜工程有限责任公司 膜材料a 1 2 0 3 管道 1 9 膜面积为o 2 m 1 l n g t 8 3s p e e d v a ec o n c e n t r a t o r 太仓市科教器材厂 t 2 主要试剂 显色剂 王堑堕氅圣壁鎏鎏 蕉型巡适变 乙腈 色谱纯 美国t e d i a 公司 9 5 工业乙醇 其它试剂均为分析纯 2 3 实验方法 2 3 1 干柱层析法运用于油茶总皂苷对照品的制备 2 3 1 1 油茶总皂苷粗品的制备 称取干燥粉碎的油茶籽饼5 0g 按1 4 的体积比加入6 0 乙醇 室温超声2 0r a i n 后抽滤 同法提取三次并合并滤液 浓缩后加入等体积石油醚于分液漏斗中脱脂 分去石油醚层 再按3 1 的体积比加入正丁醇萃取油茶总皂苷 取正丁醇层并浓缩 至干 得红黄色固体物质1 3 2g 2 3 1 2 干柱层析f 川分离纯化 在原有文献1 7 7 1 1 的基础上 笔者选择乙酸乙酯 甲醇 正丁醇 水四相作为展 开体系 于分液漏斗中振摇分层后 取上相作为展开体系 并调整体系比例 通过 大量实验发现溶剂体系为乙酸乙酯 甲醇 正丁醇 水 3 2 5 1 0 时 展层效果最 好 展层结束后于2 5 4n m 及s 硫酸乙醇溶液显色后1 0 0 烤1 0m i n 于可见光下 观察 见图四 五 按薄层的最佳展开剂于载玻片上采用柱填料干铺法快速展层 为了防止在展层过程中溶剂解混现象的产生 实验时 先将层析用硅胶加入l o 展层剂饱和 再装入自制的2c r u x5 0c m 玻璃管中 一端用滤纸盖住并用橡皮筋 扎紧后将填料暾紧 该实验采用干法上样 样品与层析填料按l 1 0 0 的比例称取1 g 总皂苷粗样再加入和5 倍体积的层析硅胶于甲醇中溶解后并干燥待用 油茶总皂苷在硅胶h 干柱色谱上以溶剂最佳配比的上相展层分离后 按薄层 r 厂值切割 并用自制细长铁条取出相应的油茶总皂苷条带 所得条帝于6 0 真空 干燥至无溶剂为止 再将该条带硅胶装入 玻璃短柱 在减压情况下 用甲醇冲沈 3 个柱休积后砂芯漏斗抽滤并减压浓缩至干 得总皂苷样品 s 并薄层点样 同时合 并其余的条带 并按上述方法制得样品待检测是否含有皂苷类成分 2 3 1 3 样品 s 起泡 陛 溶血性与醋酐浓硫酸 li 曲e r m a n n b u r c h a r d 反应o 取2 支试管 各加入样品 s 水溶液lm l 一管加入2m l 浓度为5 氢氧化钠 溶液 另一管加入2m l 浓度为5 盐酸溶液 将二管塞紧 并强力振摇ir a i n 比 较起泡性 先将样品 s 水溶液用1 碳酸氢钠中和至中性