（微生物学专业论文）酵母菌不对称催化还原4氯乙酰乙酸乙酯的研究.pdf

论文摘要 本文通过对面包酵母不对称催化还原羰基化合物4 。氯一乙酰乙酸乙酯生成 ( s ) 一4 一氯一3 一羟基- 丁酸乙酯的研究，对酵母菌不对称催化还原羰基化合物反应进行 了研究。 考察了面包酵母在水相中立体选择性催化羰基化合物4 氯一乙酰乙酸乙酯不 对称还原反应的特性，建立了以气相色谱( c g ) ，火焰离子检测器为主的检测方 法。采用标准图谱和添加底物和产物标准品比较对照的方法进行定性分析，并确 立了以三氯甲烷为内标物的内标法进行定量分析。 借助m i n i t a b1 4 软件利用部分因子重复实验、响应面分析实验和中心组合实 验设计对面包酵母生物催化剂的制备和活化培养基组成进行了优化，对培养基成 分及各组分含量对酵母菌培养生物量的影响进行了研究。分析和优化结果表明： 蔗糖、磷酸氢二钾和硫酸胺三个因子对生物量有显著的影响，得到了以湿菌体量 为响应的响应方程模型，据模型寻优得n t 最佳培养基配方( 1 ) ：蔗糖2 9 ，磷 酸氢二钾4 9 ，硫酸胺1 3 ，酵母膏2 0 ，蛋白胨1 5 ，m g s 0 4 7 h z oo 5 ，p h 6 5 7 2 。并研究了酵母菌在最佳培养基中的生长曲线，表明1 6 1 8 小时是酵母菌 生长最旺盛的时期。 从多种化合物或混合物中筛选得到了手性添加荆m ，使得酵母菌在一定条件 下可以催化还原4 氯乙酰乙酸乙酯，由此建立了研究酵母菌催化还原反应合成 手性纯光学异构体( s ) 一4 一氯一3 羟基丁酸乙酯的标准反应体系，以进一步研究影响 酵母菌催化还原反应的多种因素和工艺条件。 对影响酵母菌催化还原4 氯乙酰乙酸乙酯反应因素进行了研究，结果确定 了适宜的温度( 3 0 3 1 ) 、p h 值、p h 缓冲体系类别、初始底物浓度、碳源底 物和能源物的添加方式等工艺条件。 根据影响酵母菌催化还原4 氯一乙酰乙酸乙酯因素及相关工艺条件的研究， 以l 9 ( 3 4 正交表进行实验设计，对影响产物( s ) - 4 - 氯一3 一羟基一丁酸乙酯的产率和对 映体过量值的四个主要因素包括蔗糖流加量( s u c ) 、底物流加方式、缓冲剂量 k 2 h p 0 4 。n a 2 c 0 3 ( 8 2 ) 1 、手性添加物m ( 1 2 0 m 1 ) 作了进步优化。用统计软件正 交设计助手i i v 3 1 设计实验并实施，结果表明：当蔗糖流加量为1 5 9 、底物以0 5 m l ( 3 ) 流加，缓冲剂为1 5 9 ，手性添加物m ( g 1 2 0 m 1 ) 为2 0 9 时，酵母菌可以高产率 ( 9 6 ) 催化还原目标底物浓度2 5 m l 1 2 0 m l 生成( s ) 一4 一氯3 一羟基一丁酸乙酯，产物 最后用手性柱分析纯度达到了1 0 0 。 关键词：酵母菌4 一氯一乙酰乙酸乙酯 ( s ) 一4 一氯一3 ，羟基一丁酸乙酯 生物不对称催化还原手性添加物m正交实验 i l a b s t r a c t t h ea s y m m e t r i cr e d u c t i o no fk e t o n e sb y y e a s tw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r f o rt h e p u r p o s e so f t h ei n v e s t i g a t i o n ，t h ea s y m m e t r i cr e d u c t i o no f e t h y l - 4 c h l o r o a c e t o a c e t a t e b yb a k e r sy e a s ti nw a t e rm e d i aw a si n v e s t i g a t e d t h er e s e a r c hw o r kc o n t r i b u t e st ot h e a p p l i c a t i o no fw h o l ec e l lb i o c a t a l y s i si nt h e ：f i e l do fc h i r a ls y n t h e s i si nt h e o r ya n d p r a c t i c e t h eg a sc h r o m a t o g r a m ( g c ) w i t hf i d ( f i r ei r o n d e t e t e c t o r ) w a sa p p l i e dt o d e t e c ta n da n a l y zt h e i ra p p e a r a n c e ，i nt h i sb i o r e d u c t i o no fe t h y l 一4 一c h l o r o a c e t o a c e t a t e b yb a k e r sy e a s t ， t h e s a m p l eo f s u b s t r a t ea n d p r o d u c t w e r e a n a l y z e dq u a l i t a t i v e l yc o m p a r i n g w i t l l g a sc h r o m a t o g r a p h i cc h a r to fs t a n d a r d ，t h ei n t e m a ls t a n d a r dm e t h o dw a su s e dt o d e t e r m i n et h e i rq u a n t i t yo fs a m p l e ，c h l o r o f o r ma si n t e r n a ls t a n d a r ds a m p l e f e r m e n t i n gb a k e r sy e a s t h a si m p o r t a n te f f e c to nb i o r e d u c t i o nb y b a k e r sy e a s t u s i n gs t a t i s t i cs o f t w a r em i n i t a bw i t hm o d e lb l o c ks u c ha sf r a c t i o nf a c t o rd e s i g n ， c e n t r a lc o m p o s i t e d e s i g n ，r e s p o n s es u r f a c em e t h o d ( r s m ) ，c o m p o s i t i o n o fc u l t u r e m e d i aw a sd i s c u s s e d ，t h ea n a l y t i c a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r ea r et h r e ef a c t o r s i n c l u d i n gs u c r o s e 、烈h 4 ) 2 s 0 4 、k z h p 0 4 w h i c hh a v er e m a r k a b l ee f f e c to nb i o m a s so f y e a s t ；t h em o d e le q u a t i o nw i t hb i o m a s so fy e a s tw a sa l s oo b t a i n e d b a s e do nt h e e q u a t i o n ，t h em o s to p t i m i z e dm e d i a i sd e t e r m i n e d t h eg r o w t hc u r v eo fy e a s tw a s d e t e c t e d ，w h i c hs h o w e d t h eh i g h - a c t i v i t yy e a s tc o u l db eo b t a i n e df o r16 18 h r a f t e rt h ec h i r a la d d i t i v e sw e r es c r e e n e df r o mm a n y c o m p o u n d s ，a d d i t i v em w a s p r o v e d t oh e l pa s y m m e t r i cb i o r e d u c t i o no f e t h y l 一4 一c h l o r o a c e t o a c e t a t eb y b a k e r sy e a s t r e m a r k a b l y b yv i r t u eo f a d d i t i v em ，t h es t a n d a r dr e a c t i o ns y s t e mo fb i o r e d u c t i o nb y y e a s tw a se s t a b l i s h e dt od e t e r m i n ei n f l u e n c e so f b i o c o n v e r s i o n a lc o n d i t i o n so n y i e l d a n de n a n t i o m e r i ce x c e s s ( e e ) o f e t h y l 一( s ) 一c h l o r o 一3 一h y d r o x y b u t y r a t e t h ef a c t o r s h a v i n g e f f e c to n a s y m m e t r i c b i o r e d u c t i o no f e t h y l - 4 c h l o r o a c e t o a c e t a t e b y b a k e r 。s y e a s t h a db e e n i n v e s t i g a t e d i ns t a n d a r dr e a c t i o n s y s t e m t h et e c h n i c a lc o n d i t i o n s o fb i o r e d u c t i o nb yb a k e r s y e a s tw e r eo b t a i n e d ， i n c l u d i n ga p p r o p r i a t et e m p e r a t u r e ，p h ，t h es o r to fp hb u f f e r i n gs y s t e m ，i n i t i a l s u b 1 l i c o n c e n t r a t i o n ，c a r b o nr e s o u r c e ，t h ea d d i n gm o d eo fs u b a n ds u c r o s ea ss oo r l t h e s e i n v e s t i g a t i o no f t e c h n i c a lc o n d i t i o n sh e l p e dt oi m p r o v e y i e l da n de n a n t i o m e r i ce x c e s s ( e e ) o f e t h y l 一( s ) - c h l o r o - 3 - h y d r o x y b u t y r a t ei nb i o r e d u c t i o nb yb a k e r 。sy e a s t b a s e do ni n v e s t i g a t i o n so ff a c t o r sa n dt e c h n i c a lc o n d i t i o n sw h i c hh a v ee f f e c to n a s y m m e t r i cb i o r e d u c t i o no fe t h y l 一4 - c h l o r o a c e t o a c e t a t eb yb a k e r sy e a s t ，t h et e c h n i c a l f a c t o r ss u c ha sf e e d i n gm o d eo fs u c r o s ea n ds u b s t r n e ，a d d i t i o no fb u f f e ra n dc h r i c a l a d d i t i v ew e r es t u d i e df u r t h e ra n do p t i m i z e d ，u s i n go r t h o g o n a ld e s i g n 【l 9 ( 3 4 ) t o p e r f o r m ，t h er e s u l t sa n a l y z e db ys t a t i s t i c s o f t w a r es h o w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f s u b s t r a t ea sh i g ha s2 ，5 m l 1 2 0 m lc a nb er e d u c e da t9 6 ( y i e l d ) a n d1 0 0 e e ( w h i c h w a st e s t e db yc h i r a lc o l o m n ) u n d e ro p t i m i z e dr e a c t i o nc o n d i t i o ns u c ha sa d d i t i o no f s u c r o s e15 9 ，f e e d i n g o nm o d eo fs u b s t r a t e ，o 5 m 1 ( 3 ) ，c h i r a la d d i t i v em 2 9 ，a d d i t i o no f b u f f e r 【k 2 h p 0 4 - n a 2c 0 3 ( 8 2 ) 1 5 9 k e y w o r d s ：b a k e r s y e a sa s y m m e t r i cb i o r e d u c t i o n e t h y l 4 一c h l o r o a c e t o a c e t a t e e t h y l 一( s ) 一c h l o r o 一3 - h y d r o x y b u t y r a t eo p t i m i z i t i o n a d d i t i v em o r t h o g o n a ld e s i g n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进 行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得耍j l 盘堂或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名：巧十勉 签字日期：w 。弘年月胗日 酵母菌不对称催化还原4 氯乙酰乙酸乙酯的研究 刖舌 手性( c h i r a l ) 一词源于古希腊语的“c h e i r ”，是“手”的意思。自然界本 来就是“手性”的，它是人类赖于生存的本质属性之一；在自然状态下，手性 物质的一种镜像通常具支配地位，虽然两种构型化学组成一样，但其毒性、生 理活性和药理往往存在差别。镇静剂反应停酞胺哌啶酮( t h a l i d o m i d e ) 最初以 外消旋体出售，而最后人类却以血的代价发现s 构型的酞胺哌啶酮竟有强的致 畸活性，会导致胎儿缺臂少腿( 1 ) ；( s ) 一( - ) 布洛芬的药理作用证明比r 一( 一) 型的高 1 6 0 倍。( 2 人们己逐渐认识到，两个互为对映异构体的化学药品在生物活性、转 运机制以及代谢途径方面都有可能不同。美国f d a 药物评价和研究中心 ( c d e r ) 专门成立了立体异构委员会( c d e rs t e r o i s o m e r i cc o m m i t t e e ) 以研 究和确定有关章程和制度，并在1 9 9 2 年明确要求一个含有手性因素的化学药 品，必须说明其两个对映体在体内的不同生理活性、药理、代谢作用和药物动 力学情况，以考虑单一对映体的供药问题。随着人们对药物手性及药效关系的 深入研究以及药政管理部门的严格管理，促进了药物公司积极开发手性药物。 而且从市场看，药物单一异构体的年增长率已超过2 0 ，到2 0 0 5 年估计全球将 有6 0 的上市新药为手性纯合体，开发手性药物是今后药物研究的必然趋势， 它将成为新药研究的又一热点。 生物催化法是制备手性化合物的最主要方法之一，与其他方法相比，除了 生产率不如化学合成法以外，和化学法相比：转化率高，无需高温、高压或冷 冻，通常在自然环境下运作；不用强碱或强酸，腐蚀低，污染少；并且有很好 的化学、区域选择性和立体选择性，可以提供许多常规化学方法不能或不易合 成的化合物的合成方法；研究表明，利用生物转化法可以合成和制备许多光学 纯的医药、农药及中间体在内的多种功能化合物。我国在发酵及酶工程方面已 有相当的基础，但在生物催化领域与国外相比差距比较大，所研究的生物转化 反应类型和原创性都很少，多集中在环氧酶、水解酶、甲烷单加氧酶以及脂肪 酶和酯水解酶等酶类；综合文献而言，在生物催化的不对称合成反应、细胞催 化的选择性有机合成反应、有独特立体选择性的生物催化羰基还原反应及具有 新颖和独特催化性能的生物催化剂的筛选等领域正成为手性技术研究的热点。 本课题是和西安太宝有限责任公司的合作项目，目的是开发出一套工厂小规 模化生产( s ) 一4 一氯一3 一羟基丁酸乙酯生产工艺，以满足公司为国外相关公司生产提 供具有光学活性的纯品( s ) 一4 氯一3 一羟基丁酸乙酯的需要。因此自接此课题后，就 在导师的辛勤指导下，从生产实际出发，摸索其小规模化生产工艺；相对而言， 研究更侧重于应用方面，对工艺影响不大的方面研究的相对较少。 本论文旨在通过酵母菌生物不对称还原催化4 一氯乙酰乙酸乙酯生成( s ) 一4 氯一3 一羟基一丁酸乙酯来研究酵母菌不对称催化还原- 酮酸酯反应的一些规律， 并为相关公司建立规模化生产( s ) 4 氯- 3 - 羟基一丁酸乙酯的生产工艺提供参考。 文献回顾 1 手性药物纯异构体研究与临床应用的意义 手性是生物系统的基本属性之一，在人体内核酸、蛋白质、糖类分别由右 旋d n a 、l 氨基酸、左旋单糖组成，许多内源性物质包括载体酶、受体( 包括 膜受体、胞内受体) 等都具有手性，药物分子进入机体内只有通过生物手性环 境才能起作用。自然界天然存在的药物大多以单一手性对映体( e n a n t i o m e r ) 的 形式存在，而占合成药物7 5 的手性药物( c h i r a ld r u g s ) 却以外消旋体( r a c e m a t e ) 存在，( 3 然而，药物分子的对映体结构不同，就意味着机体内的手性环境和其 特异的对映体作用不同，从而导致手性药物不同的对映体存在药理、药代动力 学、药效学等方面的差异，表现在医疗实践中的实际效果迥然不同，有时还可 能产生灾害性的结果。 手性药物不同的对映体和机体内相应受体结合的亲和力不同，决定了生物 活性包括药效的差异。a r i e n s 据手性药物不同对映体的活性不同将其分为优劣 两种对映体，劣对映体( e i s t o m e r ) 没有疗效或部分抵消优对映体的疗效，甚至 会产生严重的毒副作用。表1 列举了部分手性药物对映体的不同药理作用。 表1部分手性药物对映体的不同作用 t a b l e1d i f e r e n te f f e c to f s o m ec h i r a ld r u ge n a n t i o m e r s 药物的治疗作用 药物名称有效对映体和作用另一对映体和作用 由表l 可以看出，对映体构型不同，表现出药效差异的复杂性。而且由于 手性药物的对映体结构不同，机体对其吸收、分布、代谢及排泄过程也不同( 这 在医学上称为药代动力学特征的差别) ：这是因为药物对映体的三维构型和机体 的生物应答性相互选择，从而表现出这些差异。如由于肠壁异构酶参与了口服 外消旋体布络芬的吸收过程，导致在消化道中r 对映体( 为劣对映体) 会转变 为有疗效的s 一对映体巧。在通常的肝清除和肾排泄过程中，外消旋的药物会由 于l 一型的阻滞作用导致其肝清除率低于单一l 一构型的药物。嘶奎尼丁和奎尼两 个异构体分子结构基本相同，但其肾清除率却有很大不同。”1 手性药物( 包括农药) 的对映体在药代动力学及药理学等方面的不同特征， 是由于对映体与体内酶、受体、离子通道等手性大分子之间不同的选择性相互 作用所导致的，瞎这在临床上有可能表现1 t i 不同的差异。尽管目前对单一对映 体的研究尚远不能满足临床需要，但随着研究的深入，这将对临床上合理使用 手性药物产生深远的影响。表2 对手性药物对映体在临床上的不同药理活性和 药效差异做了简单小结。 表2 手性药物不同对映体的药理活性及药效 t a b l e2 p h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t ya n de f f e c to f o m e c h i r a ld r u ge n a n t i o m e r s 对映体的药性差异机理举例 药理活性相同作机体内相应受体对亲合性不同l 一构型的疗一阻滞剂作用是d 构 用程度不同型的1 0 0 倍“ 药理作用相反和机体内受体作用完全一种抗精神病药r 一构型为受体拮抗 不同，效果也不同剂，丽s 构型为受体激动剂。 一种有治疗作作用方式不同左旋氧氟沙星有抗病毒作用，而右 用，一种有副作旋体无效 用或无效 作用有互补性作用累加抗休克药由于两对映体的互补作用使 得其能增加心肌收缩力但不加快心率 和升高血压 正是由于手性药物异构体不同的药理药效，临床上和药政管理部门要求从 对映体水平即分子水平角度思考和处理问题。美国f d a 已明确要求新药申请要 有消旋体不同对映体的相关材料，我国药政及研究部门也加大了这方面的管理 和研究。正是由于药政及临床上的需要，使得手性技术尤其不对称合成技术的 研究日渐引起关注，而且随着市场对手性药物的需要，将进一步促进相关技术 的发展。 在手性农药研究和使用方面，也存在着手性对映体不同的药动学及药理、 药效性问题。如杀菌齐l j ( p a c l o b u t r a z 0 1 ) ，r - 构型有高杀菌作用及低植物控制作用， 而s 一构型却有低杀菌及高植物控制作用；“2 又如有些杀虫剂、杀螨剂和除草荆， 其一种化合物是高效的，而另一种对映体却是低效甚至无效或有毒的。另据统 计，在总数为5 5 0 种农药杀虫剂中，合成的5 3 7 种杀虫剂中，非手性纯合体占 8 3 ，这方面研究报道的很少，但农药对映体的相关研究也已引起注意。 2 手性合成技术的基本方法和获得手性化合物的主要途径 随着人们对手性药物( 包括农药) 的认识和药政管理部门相关管理政策的 加强，手性药物的生产特别需要低成本、能规模化生产的手性技术。手性技术 f c h i r a lt e c h n o l o g y ) 就是获得手性纯异构体的技术，其关键是用简单、经济的方 法获得手性化合物，而手性化合物的获得途径有天然手性化合物的提取与半合 成、外消旋体的拆分和不对称合成等三种，其各有自己不同的特点。 2 1 天然产物的提取和半合成方法 通过此方法主要获得氨基酸、糖类、羟基酸、生物碱及其衍生物，虽有部 分已投入生产，但因种类有限，原料不足，还是不能满足人类的需要。目前有 通过先进的生物栽培途径以弥补原料的不足或开发相应的半合成途径研究的报 道。如近年来抗癌药物紫三醇的获得就是除利用提取方法外，可以通过其叶子 中的提取物获得其母核部分，再通过不对称合成方法将侧链接到母核上得到的， “孙 1 4 但也还有利用提取方法生产的。 2 2 外消旋体拆分法 通过外消旋体的拆分获得手性化合物，具体可通过物理、化学及生物学等 方法和手段拆分消旋体获得纯异构体。 2 2 1 物理法拆分法 包括晶体机械分离、播种结晶和圆偏振光照射等方法。虽然机械方法适用 的范围窄，应用价值小，但基础研究应用的很多，巴斯德( p a s t e u r ) 就是利用此法 在低于2 7 。c 下巧妙的将酒石酸钠的左右旋对映体分开的，从而奠定了有机化学 的基础，对手性、立体化学、有机化学等学科的发展作出了不可磨灭的贡献。“5 、 n 6 播种结晶方法就是在外消旋体的过饱和溶液中，人为的加入一种对映体( 晶 种) ，诱导某种组分结晶，该技术的关键是获得晶种；此法简单易行，在工业上 仍有应用。近年又发展了新型的拆分方法一包夹拆分，它是一种通过分子识别 以及主一客匹配关系包夹拆分出一种特定对映体的方法。 2 2 2 化学手段拆分法 这是目前最常用也最重要的拆分方法。非对映体选择结晶法在制药及食品 工业有重要应用尤其对拆分共存于相同晶胞中的两个对映体有用“ ；此方法是 将对映体和一些手性试剂反应，生成非对映体，再据其物理性质如溶解度、沸 点等的差异，分离非对映体，然后通过相应反应得到各自对映体；适用范围比 机械方法要广，对消旋体混合物和外消旋体化合物均适用。 根据此方法原理将手性拆分试剂固定在不溶性介质上形成色谱柱的固定 相，就形成了手性色谱柱分离法，此法据外消旋体中各对映体和手性拆分试剂 间亲和力的不同而分离；由于免去了连接和去除手性试剂的两步反应，操作相 对简单，目前已成为手性分离的研究热点：此法可分为间接法和直接法，其共 同点是要引入不对称中心，可以引入分子内或分子间的以形成手性环境n 即；这 种方法在药物成分拆分和测定中广为应用。 对色谱柱拆分法的研究在我国已得到重视，主要因为它还是目前获得对映 体纯合体的主要方法之一，尤其在开发新药的初始阶段，因为获得纯对映体是 进行药效比较的前提。国外在此方面的研究较为深入，“膜分离法”就是其中之 一，并已达到生产规模，其原理是通过一种单一旋光体有机溶媒的流动使混旋 体的某种异构体经薄膜进入有机溶媒再进步分离得到单一光学异构体的。“”我 国已在不对称触媒、手性辅料、手性溶剂、手性酸碱等方面进行初步研究。旺” 在化学拆分方面，随着主客体化学和组合化学的深入研究而发展了新的化 学拆分方法，包括包结拆分( i n c l u s i o nr e s o l u t i o n ) 和组合拆分( c o m b i n a t o r i a l r e s o l u t i o n ) 等两种。包结拆分是8 0 年代由t o d a 等提出的，手性化合物通过氢 键及分子间的的次级作用，选择性地与客体分子中的一个对映体构成稳定的超 分子( s u p e r m o l e c u l e ) 化合物而解析出来，从而实现对映体的分离；瞳2 2 这样， 包结拆分的化合物就不再限于有机酸、有机碱了；q 孙不仅如此，包结拆分对亚 砜类、手性亚磷脂醇、环氧化合物以及手性酮等均能予以拆分。吧4 而且同时应 注意到此方法中主客体间并不发生任何化学反应，只是通过分子间力( 主要是 次级作用力) 实现拆分，故而主客体容易通过过柱、溶剂交换以及多次蒸馏而 分离：相对而言，操作简单，易于实现规模化生产，具有相当的工业化应用前 景。m e r k 公司的c a i 等人就用此方法获得了光学纯的r - ( + ) 联二荼酚和s - ( 一) 联 二荼酚，收率高达9 5 。”组合拆分是通过设计一系列的拆分试剂家族去进行 拆分的，这在药物先导化合物的筛选及化学研究中尤其有用。6 除此而外，动力学拆分也格外引人关注。由于手性化合物和相应化合物之间 的反应速度不同，可以利用外消旋体各异构体间反应速度快慢的不同，当外消旋 体反应进行到一定程度时，中止反应从而达到消旋体中不同异构体的拆分。旺即 2 3 生物学拆分法 生物拆分法是利用酶、微生物等广泛的生物学物质与外消旋体作用而进行 拆分的，具有专一性强、拆分效率高、生产条件温和等优点。目前是手性分离 的热点，也是有机化学和生物学的结合点之一。 2 3 1 生物拆分的酶类 生物酶选择性拆分( e n a t i o s e l e c t i v er e s o l u t i o n ) 得到手性药物对映体，并 不是完全是化学意义上所理解的从对映体对等的消旋体中拆分得到纯对映体 ( e n a t i o m e r ) ，而是利用生物酶的高度立体选择性特点专一性作用于目标底物的 特定基团而得到一定的手性产品。近几年报道的酶包括有脂肪酶、蛋白酶、羟 化酶、水解酶、裂解酶、氧化还原酶、内酰胺酶、脱羧酶、转酮酶以及连接酶 等。o w e np w a n * 和a j a ys i n g h 对脱羧酶催化生成医药中间体c h i r a la h y d r o x y k e t o n e s 做了综述。旺跗n i c h o l a s ，jt u r n e r 曾对转酮酶( t r a n s k e t o l a s e s ) 在有机合成中 的近期应用做过综述，指出转酮酶在生成不对称碳原子骨架时相当有用。” 可用以生物法拆分的生物酶很多，就已被利用的种类而言，报道的还很少， 开发研究的潜力巨大。就不对称合成而言，运用微生物或酶引入光学中心时选 用微生物种类目前还没有统一的方法趋向，不能就合成所需要的酶类直接选用 所用的菌类，所发现的酶拆分试验，并不是缘于其微生物所含的酶类特性，或 专一的目标、底物专一性。许诗伟和张金红等人都曾发现脂肪酶特性与转化能 力及立体专一性并不一致，旧其立体拆分能力的特性及大小应实际根据其手性 转化能力而判断。而且也不可仅仅局限于前人所研究过的几种菌具有的立体拆 分类型上，菌株的筛选应从多种类考虑。顾军等人报道环氧水解酶( e p o x i d e h y d r o l a s e s ) 在不对称合成的应用中可以是细菌的，也可以是真菌的酶，而且每一 种类之间的特性也不同。选择拆分某一消旋物的微生物或酶，不可囿于固有 思维，而应注重实际拆分能力。酵母菌在不对称合成中的作用多以其氧化还原 能力为主，而也发现其含有脂肪酶、裂解酶，而且其裂解酶已在利用工业化生 产l 一麻黄硷( l e p h e d r i n ) ；而s a c c h r o m y e s 和c a n d i d a 中某些种所含苯甲酸脱 羧酶比细菌的更易于发生偶姻型的脱羧反应。这也许是由于微生物结构简单和 酶多具有诱导性的特点，而且也可以看出微生物酶开发应用的潜力巨大。 2 3 2 生物拆分法有机相拆分反应体系的研究重点 利用微生物酶拆分制备手性产物已从水相酶转向非水相反应体系了，而且重 点集中在有机相反应体系的组建，温度、p h 值、离子强度、含水量及酶的不同 形式对转化率及对映体过量值的影响上了。由于大部分的手性前体药物是水不溶 性的，因此在有机相中进行手性药物的酶促拆分研究异常引人关注。酶是一种 特殊的催化剂，具有催化的专一性、立体及分子专一性。长期以来，对其应用研 究多囿于水相体系，直到用猪胰酶粉在几乎无水的有机溶剂中合成了多肽、手性 醇及酯酰胺，才使有机相酶促反应获得突破。”o ”而且拓宽了体内酶促反应的 类型，如脂肪酶在水中催化油脂的水解，而在有机相中能催化酯的合成。0 4 有机相酶促反应酶的催化活力受到有机相含水量、溶剂极性的影响，也受 到温度及p h 值的影响；其中含水量仍然是必需的基本条件，因为在绝对无水 的体系中，酶不表现任何催化活性，一定量的水和蛋白质表面的亲水基团形成 相互作用吸附在蛋白质表面，对保持酶的活性，稳定其构象结构和一定的柔性 异常重要。5 酶在有机相中必需水含量在组建反应体系要注意优化，使酶活达 到最高，且对每一种酶也不一样，如猪胰脂酶( p p l ) 分别以正辛醇和醋酸乙 烯酯做溶剂的酶促拆分体系中，在酶活力达到最高必需水的含量分别为酶重的 o 2 和o 5 。3 6 2 3 3 有机相反应体系中酶作用特点 有机相酶催化的发展改变了水相转化的观念，也提高了非水溶性底物进行 酶催化的能力。传统上只能催化水解反应的水解酶也在用于催化合成反应，化 学上很难发生的反应目前在微生物酶的催化下有时可以很容易的发生。吉鑫松 等人在不对称合成( s ) ( + ) 布洛芬时组建的反应体系主要还是水相体系，其中含 有d m f 以及0 2 5 的t w e e n 一8 0 ，并且认为酵母菌的固定化酶的最高水解温度 和自然水解酶的不一样，比游离酶的3 5 c 高，已达4 2 。c ；而且报道此菌虽不具 有脂肪酶活性，但能不对称拆分( s ) - ( + ) 布洛芬乙酯，且效率是原来酵母菌直接拆 分的2 0 倍以上，( 37 ) 其加入的t w e e n 8 0 利于提高底物在反应体系中的溶解度， 增大底物投放量。虽然脂肪酶( l i p a s ee c 2 3 ) 研究得最早且很多，但在组建反应 体系催化拆分底物时，也应注意具体的底物、反应基团及对映体专一性， s a n c h e n z 等发现c a n d i aa n t a r c t i c a 的l a p a s e 具有对亲核物质和酰基的双重识别 功能，可以实现对两者的双重拆分，在一步反应中可以拆分酯和胺，及进行酰 胺的转化。日鼬而t s a i 等人在对脂肪酶催化的酯化反应时证实用8 0 的异辛烷与 2 0 的甲苯组成的有机试剂体系进行反应，e e 值较高，这些都在众多酯化尤其 水解反应中得到证实。布洛芬、硫单草酮( d i l t i a z m ) 等的生物拆分中都加入有机 试剂以增加底物的溶解度。 有报道加入手性助剂( 化学上用做t o o l b o x ) 来提高反应的光学转化率和产 率。g r a d i l l a s 等对布洛芬酯化时加入了苯并一【1 8 冠一6 后，和未加任何添加剂时 相比，反应产率从4 3 提高到了6 8 。” 2 3 4 生物拆分法反应体系中加入有机试剂的弊端 但是加入有机试剂存在着潜在的危险，可能使微生物酶变性，也可能造成 反应阻遏，当然也会增加反应后处理的困难，增加产物分离的动力消耗。当考 虑添加时，应对其生物相容性及对反应的影响做综合考虑，且不可盲目添加。 我们在研究酵母菌生物转化时发现添加乙醇反而会影响其转化效率，分析认为 是乙醇的添加对酶有阻遏作用。一般而言，乙醇、丙醇、丙酮及t w e e n 8 0 被认 为是生物相容性好的试剂，可以酌情添加。 2 3 5 组建有机相反应拆分体系的注意问题 考虑组建反应体系时，主要要考虑采用微生物酶的何种形式参与反应。微 生物酶在有机相中催化反应的底物专一性和立体结构特异性已引起关注并逐渐 被引用。脂肪酶就是应用比较广泛的酶之一。利用洋葱假单胞菌( p s e u d o m o n a s c e p a c i a ) 在无水异丙醚中可以将外消旋体氰醇转化为单一构型的氰醇乙酸酯， e e 值和收率分别高达9 0 以上。d i r kp a m p e i n 等在利用s c e r e v i s i a e ( d s m c 1 2 8 5 ) 菌培养的醪液生物拆分时，认为加入t w e e n 8 0 是最好的有机溶剂， 他们从r s - 消旋体中拆分纯对映体( s ) - 4 一f o r m y l 一( 2 ，2 ) 一p a r a c y c l o p h a n e 和 r 一4 h y d r o x y m e t h y l 一( 2 , 2 ) p a r a c y c l o p h a n e 的e e 值达7 8 ，产率分别也达到了4 9 和3 9 。“”j o r g e d 等人巧妙地设计了一种称为“m u l t i p h a s e e x t r a c t i v e m e m b r a n e ”的反应器，使酶在水溶性差的介质中反应，提高了底物和酶的接触 程度，降低了产物对酶反应的抑制性，使酶反应器的生产性和可操作性有很大 提高，并已成功的用于生产治疗高血压和心绞痛的手性中间体硫单草酮 ( d i t i a z e m ) 的生产，实验规模已达1 4 4 r 。“”而且这种反应体系对其它相似反 应也是适用的。s p r i c h a n o n t ，+ d _ j 等人提出了用含有烯烃单加氧酶( a l k e n m o n o o x y g e n s e )的全细胞环氧化酶时用微生物m y c o b a c t e r r i u m3 4 1 5 6 来转化 a p e ( a l l y lp h e n y le t h e r ) $ 1 j 备手性中间体p g e ( p h e n y lg l y c i d y le t h e r ) 的典型反应体 系，为了解决底物加入、产物对酶抑制以及酶对产物的降解问题提高总的转化 率，采用了水有机相双相系统，巧妙地调节这些组分的组成可以优化酶催化微 环境，降低产物毒性防止产物的进一步降鳃。“”这种两相反应体系对其它全细 胞拆分过程也有借鉴意义。 2 3 6 生物转化机制的研究有助于提高反应效率 对生物转化过程以及其基本机制的理解，有利于对其精确的控制以及产物 e e 值的提高。j z h a n g j r e d d y 等在用微生物c u r v u l a r i a p r o t u b e r a t am f 5 4 0 0 的 酶d e c 砂d r o g e n a s e 转化茚类( i n d e n e ) 生成两种对映体时，发现其转化效率是和 反应时的p h 值紧密相关的，高的b r 2 h 2 0 2 比值可以加快反应速率，而低的 h 2 0 2 水平利于酶活性的保持，经过精确控制，e e 值可以达到9 5 ，甚至9 9 。 q 4 sp r i c h a n o n t 等人在进行生物转化时，将微生物细胞浸在h l b ( 亲水亲油平衡 值) 值为1 0 的油包水溶液制成细胞微胶乳液，保证了酶的稳定性。“” 微生物酶虽有严格的底物专一性，但在研究有机物手性转化尤其有机相反 应转化体系中，酶却显得较为迟钝，常常表现为底物的相对专一性，同类的不 同底物可以参与同一种酶的生物催化。p a u l oz a n i * 等人发现b a k e r jy e a s t 可以 催化一系列结构不同的酰基硅烷类( a c y ls i l a n s ) 底物，只是对有芳香基 ( a r o m a t i c ) 或极性基团( p o l o rg r o u p ) 的底物优先转化，而且反应是在同一条 件。4 6 3 不对称合成方法 不对称合成方法是制备对映体纯化合物的主要方法之一，具有广泛而不同 的含义。简单的说，不对称合成就是采取某些方法，使反应生成的两个对映体 中一个过量，甚至全部为单一的对映体，从而避免和减少拆分过程，它是立体 定向合成单一对映体、获得手性药物最直接的方法。从绿色化学角度考虑，高 效的不对称合成方法有利于节约资源，提高原子利用率，因此不对称合成是手 性技术发展的主流方向。 目前认为手性不对称合成方法包括物理、化学及生物学方法。 3 1 物理方法 物理方法就是采用偏振光照射诱导产生手性物质，它是以非分子的不对称 源( 即圆偏振光) 促进不对称合成反应的发生，但是研究的意义不在于应用， 而在理论，因为其合成的e e 值很低。 3 2 化学方法 化学方法分为化学计量的不对称和催化剂量的不对称合成等两种。 3 2 1 化学计量的不对称合成 最早被称为手性助剂法即加入手性助剂诱导非手性的前手性底物生成手性 物质，后再将其解离出来，其中合适的手性助剂选择是关键。 随后发展的手性试剂法是通过改性后的手性试剂( 引入一些手性化合物或 基团的试剂改性) 诱导不对称合成。 3 2 2 催化剂量的手性化合物诱导的不对称合成 此方法的手性实体仅为催化量的，而且好的手性催化剂，可以起到很好的 手性增殖作用。2 0 0 1 年诺贝尔奖得主的三位专家就是由于他们在手性不对称加 氢、不对称环氧化等方面的杰出工作而获奖的。“7 8 3 3 不对称催化的优点 杜邦公司的一些科技人员总结了不对称催化的一些优点：h 射 ( 1 ) 可能促进自然界中尚未发现的反应。 ( 2 ) 手性催化剂的手性易于修饰改变。 ( 3 ) 可以催化利用不为酶接受的底物。 ( 4 ) 生产量大，产物的分离相对容易。 ( 5 ) 金属有机试剂比酶相对稳定，不象酶一样受热氧化及p h 值的影响。 吕士杰等人总结过其在工业中的运用，认为其在不对称氢化、不对称氢氰 化、不对称环氧化等方面都有应用。巧o 3 4 生物催化不对称合成 3 4 1 生物催化法概念和主要优点 生物催化( 也称生物转化，b i o t r a n s f o r m a t i o n ，b i o c o n v e r s i o n ) 即利用生物学 方法合成具有光学活性的有机化合物的过程，也就是选用特定酶修饰特定的化 合物以获得目的产物。生物催化反应体系和发酵在形式上有许多共同点，但前 者以修饰、转化反应物为目的产物为目的，而且更侧重于利用特定酶或微生物 的一些主要特征如反应的专一性、光学及立体选择性。现代生物催化研究一般 认为始于巴斯德，具有里程碑式意义的是p e t e r s o n 等人利用黑根霉 ( r h i z o p u s , n i g r i