（分析化学专业论文）磁性高分子微球的制备、性能及应用研究.pdf

桂林工学院硕士学位论文 摘要 磁性高分子微球具有许多优良的特性 在细胞分离 固定化酶 靶向药物 免疫测定 等生物医学领域有着广泛的应用前景 本文合成了三种不同的磁性高分子微球 并将其分 别应用到靶向药物 蛋白质分离和固定化酶等方面 效果较好 本文分三个部分 1 采用包埋法制备了b 环糊精聚合物磁性微球 用多指标正交实验k 3 4 确定了磁性 微球的最佳合成条件 测定了磁性微球的磁化率 采用透射电镜 粒度分析 红外分析 x 射线衍射分析以及x 射线能谱对其进行了表征 结果表明 b 一环糊精聚合物包裹f e 4 0 4 形成顺磁性的高分子微球 粒径较小 磁响应性较强 通过b 环糊精聚合物磁性微球与姜黄素的包合反应制得一种新型磁导向药物微球 研 究了温度 姜黄素用量和缓冲液等因素对磁性药物微球中姜黄素含量的影响 用红外光谱 证明姜黄素与磁性微球结合在一起 并探讨了该药物微球的体外缓释性和靶向性 实验表 明 磁性药物微球具有较强的缓释性和较好的靶向性 2 采用单体共聚法制各了p n v pm a a 磁性微球 用多指标正交实验k 3 4 确定了制 备磁性微球的最优实验方案 测定了磁性微球表面的羧基含量 采用电镜扫描 红外光谱 x 射线衍射 热重 差示扫描量热法等对磁性微球进行表征 结果表明 磁性微球中f 岛0 含量为8 3 2 羧基含量为0 3 7 m m o l g 平均粒径为2 5 3um 研究了磁性微球对牛血清白蛋白吸附行为的影响因素及微球的再生性能 磁性微球对 蛋白质的吸附量较大 最大吸附量达1 6 4m g g 重复使用4 次 吸附量基本不变 可见此 磁性微球的再生性能较好 3 采用交联聚合法合成了交联海藻酸钠磁性微球 研究了s a 浓度 戊二醛用量和反应 温度对粒径和f e a 0 4 含量的影响 利用透射电镜 粒度分析 红外分析 x 射线衍射 热分 析 x 射线能谱分析等对磁性微球进行了表征 结果发现 海藻酸钠包裹f e 吼成核壳结构 的磁性微球 磁性微球的平均粒径为8 6 9ui f l f e 0 含量大于7 0 将交联海藻酸钠磁性微球用做固定化胰蛋白酶的载体 讨论了给酶量 戊二醛浓度和 p h 值对固定化酶活性的影响 研究了固定化酶的各种性质 胰蛋白酶被磁性微球固定化后 性质有所改善 最适温度为6 0 c 最适p h 值为7 5 8 5 之问 储存热稳定性和p h 值稳定 性增加 关键词 磁性高分子微球 制备 表征 靶向 吸附 固定化 桂林工学院硕士学位论文 a b s t r a c t m a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e s m p m s h a v em a n ye x c e l l e n ts p e c i a l i t ya n da r ea p p l i e d w i d e l yi nb i o m e d i c i n ef i e l d s u c ha sc e l ls e p a r a t i o n i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e d r u g t a r g e t i n g i m m u n o a s s a ya n ds o o n t h r e ek i n d so fd i f f e r e n tm p m sw e r es y n t h e s i z e da n du s e di n d r u g t a r g e t i n g p r o t e i ns e p a r a t i o na n di m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e t h es a t i s f a c t o r yr e s u l t sw e r e o b t a i n e d t h i sp a p e ri sc o m p o s e do ft r e es e c t i o na sf o l l o w s 1 m a g n e t i c1 3 c y c l o d e x t r i np o l y m e rm i c r o s p h e m sw e r ep r e p a r e db ye m b e d m e n t t h o o p t i m u mc o n d i t i o nw a ss t u d i e db yl 9 3 o r t h o g o u a le x p e r i m e n t sa n ds u s c e p t i b i l i t yw a s m e a s u r e d f t r t h e r m o r e m p m sw e r ec h a r a c t e r i z e db yt e m i r x r d e d sa n dg r a n u l a r i t y a n a l y s i s mr e s u l t si n d i c a t e dt h a tr 3 0 4 w a se n w r a p p e d b yb c dc r o s s i n gp o l y m e ra n dm p m s w e r ef o r m e dw h o s eg r a i nw a ss m a l l e ra n dw h o s er e s p o n s et om a g n e t i cf i e l dw a gv e r ys t r o n g an o v e lm a g n e t i ct a r g e t i n gc u r c u m i n 一8 c y c l o d e x t r i nm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw e r ep r e p a r e d b yi n c l u s i o n r e a c t i o n o fc u r c u m i nw i t h h y d r o p h o b i c c a v u n li nt h ef a c eo f m a g n e t i c m i c r o s p h e r e s i tw a ss t u d i e dt h a tt e m p e r a t u r e c u r c u m i n sd o s a g ea n db u f f e rs o l u t i o n h a d i n f l u e n c e0 1 1t h ec o n t e n to fc u r c n m ai nm a g n e t i cm e d i c a m e n tm i c r o s p h e r e s t h a tc u r c u m aa n d m p m sh u n gt o g e t h e rw a sp r o v e db ym 血a d d i t i o n t h er e l e a s i n ga n dt a r g e t i n gp r o p e r t yo f m a g n e t i cm e d i c a m e n tm i c r o s p b e r e si nv i t r ow e r ed i s c u s s e da n dg o o d r e s u l t sw e r eb r o u g h t 2 m a g n e t i cp n v p m a a m i c r o s p h e r e sp r e p a r e db y m o n o l n e rp o l y m e r i z a t i o n 1 1 m o p t i m u ms c h e m ew a sd e t e m d n e d b yk 3 o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sa n dc a r b o x y lc o n t e n tw a s m e a s u r e di nt h ef a c eo f m a g n e t i c n v p m a a m i c r o s p h e r e s t h e n m p m sw a s c h a r a c t e r i z e db ys e m i l lx r d t ga n dd s c 1 h er e s u l t ss h o wf e 3 0 4w a s8 3 2 c a r b o x y l c o n t e n tw a s0 3 7 m m o l ga n da v e r a g ed i a m e t e rw a s2 5 3 m t h ei n f l u e n c ef a c t o ra n dr e b i r t hp r o p e a yw a si n v e s t i g a t e dt h a tm a g n e t i ce o q v p m a a m i c r o s p h e r e s a b s o r b e db s a 1 飞el a r g e s t q u a n t i t y o fba d s o r b e db s aw a s1 6 4 m g g l a n d a b s o r b e dq u a n t i t yd i dn o t c h a n g eo b v i o u s l y a f t e rm a g n e t i c p n v p m a a m i c r o s p h e r e sw e r eu s e df o u rt i m e s t h e r e f o r e t h er e b i r t hp r o p e r t yo fm a g n e t i cp n v p m a a m i c r o s p h e r e sw a sg o o d 3 c r o s s i n gs o d i u ma l g i n a t em a g n e t i cm i r o s p h e r e s c s m m s w e r es y n t h e s i z e db yc h e m i c a l c r o s s i n gp o l y m e r i z a t i o n i tw a ss t u d i e dt h a td i a m e t e ra n df e 3 0 4 w a se f f e c t e db ys e v e r a l f a c t o r s u c ha sc o n c e n t r a t i o no fs a d o s a g eo f 西u t a r i cd i a l d e h y d ea n dt e m p e r a t u r e t e m i r x r d e d s t g d s ca n dg r a n u l a r i t ya n a l y s i sw e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z ec s m m s i tw a sf o u n d t h a ta v e r a g ed i a m e t e ro fc s m m sw a s8 6 9 mg r a n u l a r i t yd i s t r i b u t i n gw a sn a r r o wa n df e 3 0 4 w a sa b o v e7 0 c s m m sw a su s e da sc a r r i e ri m m o b i l i z i n gt r y p s i n i tw a sa r g u e dt h a ta c t i v i t yo ft r y p s i n i m m o b i l i z e dw a se f f e c t e db ys o m ef a c t o ri n c l u d i n ge n z y m e d o s a g e p ha n dc o n c e n t r a t i o no f g h t a r i cd i a l d e h y d e t h eq u a l i t yo ft r y p s i ni m m o b i l i z e dw a si m p r o v e dv e r s u sf r e et r y p s i n t b e 桂林工学院硕士学位论文 o p t i m u mw o r kt e m p e r a t u r ew a s6 0 c a n dt h eo p t i m u mp hv a l u ew a s7 5 8 8 at h et h e r m a l s t a b i l i t y p hs t a b i l i t yw e r ea l s oi m p r o v e do b v i o u s l y k e yw o r d m a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e s p r e p a r a t i o n c h a r a c t e r i z a t i o n d r a g t a r g e t i n g a b s o r p t i o n i m m o b i l i z a t i o n 桂林工学院硕士学位论文 1 1 磁性高分子微球简介 第1 章引言 磁性高分子微球是指将无机磁性粒子与有机高分子材料结合形成的一种复 合微球 是一种新型的功能高分子材料 磁性微球的研究始于加世纪7 0 年代 末 u g e l s t a d 成功地在重力条件下制备了尺寸均一地单分散地聚苯乙烯磁性微 球 它具有许多优良的特性 如粒径小 表面积大 易于吸附 具有顺磁性 无外加磁场时在溶液中分散均匀稳定 加磁场则可简单快速分离 具有高分子 微球的特性 可通过共聚 表面改性 赋予其表面多种反应性功能基团 一n h 2 o h c o o h 一s h 等 具有良好的生物相容性 因此 磁性高分子微球在 细胞分离 固定化酶1 2 1 靶向药物 3 1 免疫测定 4 1 等生物医学领域有着广泛的 应用前景 近二f 年来 磁性高分子微球的研究非常活跃 已从最简单的高分子包裹 磁性材料发展到多种类型的组成方式 根据磁性高分子微球的结构类型可将其 分成三类 见图1 o o o 渤 1 j a b 1 b 2 c 二 磁性物质高分子材料 图1 磁性高分子微球的类型 f i g l t h ec l a s s i f i c a t i o no fm a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e s 但是 组成磁性微球的基本材料仍然是磁性物质和高分子材料 磁性物质 包括f e 3 0 4 卜f e 2 0 3 p t 5 1 n i i c o l 7 1 等 其中f e 3 0 4 使用最多 高分子材料 包括合成高分子材料和天然高分子材料 合成高分子材料常用的有苯乙烯共聚 物 聚酯类 聚酰胺类高分子 天然高分子材料常用的有明胶 白蛋白 纤维 素和各种聚糖 此外 近年来有人为了电磁方面的应用 研究了一些导电性的 磁性高分子微球p 1 聚吡咯 聚苯胺等导电聚合物也可用来制备磁性微 桂林工学院硕士学位论文 球 磁性高分子微球的性质不仅与组成材料的性质有关 还与制备方法有关 因此 制各方法的研究十分重要 通常不同类型的磁性高分子微球其制备方法 也有所不同 下面依图1 的分类对制备方法进行综述 1 2 磁性高分子微球的制备方法 1 2 1 a 型磁性高分子微球的制备方法 a 型磁性高分子微球是一种简单的核壳微球 其制备方法有两种分类法 一种是根据磁性物质与磁性微球的形成次序分 有一步法和二步法 另一种是 常规分法 有包埋法和单体聚合法 这两种分法的交叉部分在于包埋磁性物质 可采用一步法或二步法 而单体聚合包裹则都采用二步法 1 2 1 1 一步法 一步法又称共沉淀法 是指在生成磁性物质 f e 3 0 4 或f e 2 0 3 的同时产生 磁性高分子微球的制各方法 即先将高分子物质溶解 然后依次加入f e 和 h 2 0 2 或f e c l 2 和f e c l 3 溶液 搅拌的同时滴加碱性溶液提高p h 值 这样磁性 物质一产生就被包裹形成核壳磁性高分子微球 邱广赢 1 2 l 等采用这种方法制备了纳米级磁性明胶微粒 并用于纤维素酶的 固定化 由于磁性微粒大小不很均匀 部分粒径很小的微粒磁分离时被损失 李民勤 1 3 1 等也用一步法制取了具有超顺磁性的葡聚糖毫微球 通过凝胶色谱法 和高速离心法分离出葡聚糖磁性毫微球 研究了葡聚糖浓度 铁盐用量 氨水 浓度 f e 2 f e 3 摩尔比和二价钴对磁性葡聚糖毫微球磁化率的影响 国外研究 者一般不采用一步法制备磁性高分子微球 一步法的优点是制备方法简单 避 免了制取磁流体或均匀分散磁粒子的相关处理 制得的磁性微球粒径较小 表 面积大 缺点是磁性微球大小不均匀 磁响应性较弱 磁分离时会损失粒径很 小的微球 1 2 1 2 二步法 二步法通常是先制备f e 3 0 4 微粒子 或直接购买f e 3 0 4 粉末 然后将其与 2 桂林工学院硕士学位论文 球 磁性高分子微球的性质不仅与组成材料的性质有关 还与铡备方法有关 因此 制各方法的研究十分重要 通常不同类型的磁性高分子微球其制备方 土 也有所不同 下面依图1 的分类对制各方法进行综述 12 磁性高分子微球的制备方法 121 a 型磁性高分子微球的制备方法 a 型磁性高分予微球是一种简单的核壳微球 其制各方法有两种分类法 一种是根据磁性物质与磁性微球的形成次序分 有一步法和二步法 另一种是 常规分法 有包埋法和单体聚合法 这两种分法的交叉部分在于包埋磁性物质 可采用一步法或二步法 而单体聚合包裹则都采用一步法 1 2 1 1 一步法 一步法义称共沉淀法 是指在生成磁性物质 f e 3 0 4 或f e 2 0 3 的同时产生 磁性高分子微球的制各方法 即先将高分子物质溶解 然后依次加入f 2 和 h 2 0 2 或f e c l 2 和f e c l 3 溶液 搅拌的同时滴加碱性溶液提高p h 值 这样磁性 物质一产生就被包裹形成核壳磁性高分子微球 邱广亮 1 2 等采用这种方法制备了纳米级磁性明胶微粒 并用于纤维素酶的 固定化 由于磁性微粒大小不很均匀 部分粒径很小的微粒磁分离时被损失 李民勤 1 等也用一步法制取了具有超顺磁性的葡聚糖毫微球 通过凝胶色谱法 和高速离心法分离出葡聚糖磁性毫微球 研究了葡聚糖浓度 铁盐用量 氨水 浓度 f e 2 f e 3 摩尔比和 二价钴对磁性葡聚糖毫微球磁化率的影响 国外研究 者般不采用一步法制备磁性高分子微球 一步法的优点是制各方法简单 避 免了制取磁流体或均匀分散磁粒子的相关处理 制得的磁性微球粒径较小 表 面积大 缺点是磁性微球大小不均匀 磁晌应性较弱 磁分离时会损失粒径很 小的微球 1 2 1 2 二步法 二步法通常是先制备f e 3 0 4 微粒了 或直接购买f e 3 0 4 粉末 然后将其与 二步法通常是先制备f e 3 0 4 微粒子 或直接购买f e 3 0 4 粉末 然后将其与 2 桂林工学院硕士学位论文 聚合物或高分子单体溶液混合作用制得磁性高分子微球 目前制备磁性高分子 微球普遍采用二步法 e m i r l l 4 等先制取f e 3 0 4 接着把f e 3 0 4 粉末和壳聚糖到 入分散剂中反应 同时加入交联剂戊二醛 通过控制反应条件得到无孔的粒径 在1 0 0 2 5 0 9 m 之间的壳聚糖微球 讨论了不同参数对粒径和粒径分布的影响 由于一步法制得的f e 2 0 3 p a n i 复合微球室温电导率和磁化率都较低 且结构 和性质难以控制 d e n g s 8 j 实验小组经改进 采用二步法合成了电磁性f e 3 0 4 交联聚苯胺复合粒子 粒径在3 0 4 0 n m 之问 研究表明控制f e 含量和掺杂程 度可提高饱和磁化率与导电性 1 2 1 3 包埋法 包埋法是运用机械搅拌 超声处理和均化器等方法使磁性粒子均匀分散于 高分子溶液中 通过化学交联 热固化 溶剂蒸发 雾化 絮凝 沉积等手段 制得磁性高分子微球 磁性粒子和高分子物质以范德华力 氢键 配位键或共 价键结合 在磁性粒子表面形成高分子包覆层 在包埋过程中采用交联剂交联 高分子层可增加磁性微球的稳定性 但通常化学交联的磁性微球大小不均匀且 有聚集 粒径分布较宽且球形不规则 为了解决这些问题 c h a t t e r j e e i s 等采用 热固化包埋法合成了人血清蛋白磁性微球 粒径分布 球形都有所改善 微球更 分散 天然高分子磁性微球均采用包埋法制取 也有合成高分子包埋磁性物质 方面的研究 h a r r i s 1 6 1 等采用亲水性三段式共聚物 p e o c o o h p e o 包覆 f e 3 0 一纳米粒子得到磁性微球分散体系 该微球的饱和磁化率很高 研究了p e o 长度对微球分散稳定性的影响 a k g o l l7 j 等用戊二醛交联法制备了磁性聚乙烯醇 微球 经羰基二咪唑 c d i 活化后用于固定化转化酶 酶的固定化率是7 4 测定了固定酶的活性和动力学参数 k m 和v m a x 另外 有些学者从经济角度出发 采用包埋法制得低成本的磁性高分子微 球 如t a n y o l a c l8 1 9 等人使用便宜 常见的有机物作分散剂 稳定剂 表面活 性剂和包埋物质 合成了大小均匀 粒径在1 2 5 2 5 0 9 m 之间的硝化纤维素磁性 微球和聚乙烯缩丁醛磁性微球 这两种微球都可较好的应用于固定化酶和蛋白 质吸附 从查阅资料的情况来看 采用包埋法制备磁性聚合物微球简单易行 表面 桂林工学院硕士学位论文 含有各种功能基团 可直接偶联所需配基 且天然高分子多数较便宜 成本较 低 此法的缺点是所得磁性微球大小不宜控制 粒径分布宽 形状不宜控制 磁性较弱 磁均一性差 因而在某些领域的应用受到限制 但是 如经特殊处 理 1 2 1 用包埋法制得性质较好的磁性高分子微球是可能的 1 2 1 4 单体聚合法 单体聚合法是制备核一壳磁性高分子微球的又一种重要方法 它是在磁性 粒子或磁流体存在下 进行单体聚合 使生成的聚合物在磁粒子表面形成壳层 的方法 具体来说有分散聚合 悬浮聚合 乳液聚合 包括种子乳液聚合 微 乳液聚合 无皂乳液聚合等 接枝聚合 当无机磁性粒子与单体的相容性较好 时 聚合易在磁粒子表面发生 亲水性单体满足这一条件 而亲油性单体则难 以在磁粒子表面顺利聚合 为了解决相容性问题 可对磁粒子表面进行处理或 改进聚合反应体系的组成 c h a n g 2 0 等将磁粒子羟基化后与甲基丙烯酸丙酯基 三甲氧基硅烷连接 再与异丙基丙烯酰胺接枝共聚得到核一壳磁性高分子微球 研究了微球的乳化剂吸脱附现象 结果表明该微球有热敏性 d e n g s 2 l 小组用 反相微乳液聚合合成了聚丙烯酰胺磁性微球 通过交联剂浓度和表面活性剂与 水的比率控制粒径在8 0 1 8 0 n m 之间 粒径分布窄 还可改变f e 3 0 4 的浓度来 控制磁性 为了得到表面含功能基团的磁性聚合物微球 很多作者采用了共聚法 值 得一提的是 苯乙烯是一种重要的共聚单体 采用苯乙烯与其它单体共聚可使 聚合物壳层与磁核结合紧密 k o n d o m 采用两步无乳化剂乳液聚合制得热敏性 p s t n i p a m m a a 磁性微球 解决了磁性微粒既有足够大的吸附表面积 又 能快速磁分离的问题 z h a n g 2 引用分散聚合的方法制备聚 苯乙烯一烯丙醇 磁性微球 将其与c u p c c o c i 4 反应后得到一种具有良好光电导性的磁性微球 d i n g 6 也用分散聚合法制取了p s t n i p a m 磁性微球 1 2 2b 型磁性高分子微球的制备方法 b 型磁性高分子微球分为两类见图1 b l b 2 主要有两种制备方法 1 2 2 1 界面沉积法 4 桂林工学院硕士学位论文 界面沉积法可用来制各b l 和b 2 类型的磁性高分子微球 它通常是先分别 制取聚合物胶体粒子和无机物粒子 通过加入电解质 调节p h 值或其他方式 使聚合物胶体粒子和磁性粒子表面带上相反性质的电荷 由于静电作用 两者 混合后磁性粒子被吸附在聚合物胶体粒子表面形成包覆层 如果以此乳胶粒子 为种子进行乳液聚合 可制得夹心式结构 b l 型 的磁性高分子微球 如果不 继续实验 得到的就是以磁性粒子为壳 聚合物为核的核壳微球 b 2 型 s a u z e d d e l 2 4 5 1 实验组用这种方法制各了三种夹心式的亲水性磁性高分子微球 研究了电荷密度和交联度对磁性粒子表面吸附吸附能力的影响 b i z d o a c a t 2 6 等 在水基胶体溶液中将带负电的磁性粒子电沉积到被聚电解质包裹的的p s 微球 上得到核一壳 b 2 型 磁性聚合物微球 由于界面沉积法制备的磁性高分子微球粒径主要由最初的高分子微粒的大 小决定 故其粒径易于控制 大小均匀 磁一致性强 1 2 2 2 非电性沉积法 非电性沉积法也称化学沉积法或e p s 法 用于制备b 2 型的磁性高分子微 球 具体做法是先制得表面带功能团的微球 在微球表面引入贵金属离子 p d 接着将金属离子还原成0 价得到活化的聚合物微球 最后化学还原过渡金属离 子使其沉淀在聚合物微球表面 这种沉积不是由静电作用引起的 是一种非电 性沉积 p h w a n g 2 7 7 1 以p d 激活p s t a a 微球 将n i 和c o 沉积在其表面 得到核壳型的p s t a a n i 和p s t 一从 c o 磁性微球 他认为化学沉积是表面 功能团引发的 这种方法制得的磁性高分子微球 粒子大小由高分子微粒的大小和过渡金 属离子的浓度决定 粒径均匀 但微球表面不太光滑 1 2 3 c 型磁性高分子微球制备方法 c 型磁性高分子微球由溶胀法 也称化学转化法 制取 该法是u g e l s t a d 在1 9 7 9 年创立的 此法通过溶胀大孔的 表面及孔内含多种官能团 n 0 2 o h c h o 的聚合物粒子 让一定浓度的磁性金属离子渗透到大孔中去 然后利用碱性试剂或改变温度使金属离子转化为磁性氧化物 再利用交联剂或 其它方法封闭孔道 在封孔之前 可通过反复渗透和中和来调整磁含量达到所 5 桂林工学院硕士学位论文 需水平 采用此法制备的磁性聚合物微球单分散性好 磁含量可控 磁均一性 强 溶胀法是目前制备磁性聚合物微球的最好方法 已商业化 但操作程序繁 琐 国内张梅幽佣此法制备出磁性较强 磁分布均匀的强酸树脂 磁性磺化微 球等 康继超 2 9 也用二步溶胀法制取了单分散 大粒径的磁性聚苯乙烯微球 并讨论了溶胀效果和微球性质的影响因素 除了以上介绍的制备方法 有些学者还尝试了新的方法制备磁性高分子微 球 b u r k e l 3 0 在氨和聚合物分散剂存在下热分解f e c o 5 得到聚合物 金属壳核 纳米微球 其磁性介于超顺磁性和铁磁性之间 s h c h u k i n 3 q 先制得聚电解质微 囊 采用两种方式磁化微囊 一将内部含有p a h 单体的聚电解质微囊与磁流 体混合 使f e 3 0 4 渗透到微囊内部 通过静电作用固定f e 3 0 4 二使聚电解质 微囊内外p h 值不同 进行内部f e 和f e 共沉淀 得到聚电解质厄e 3 0 4 磁性微 球 a v i v i l 3 2 1 等用超声化学法制备了磁性牛血清蛋白微球 粒径分布窄 但微球 表面不光滑 有f e 2 0 3 粒子聚集 此外 为了满足生物医学应用对磁性高分子 微球性质的要求 常常需要对其表面进行修饰 g r u t t n e r l 3 3 1 总结了几种表面修饰 的方法 如在p f s t l 磁性微球表面包裹壳聚糖使其由疏水性变为亲水性 降低对 非特定蛋白质的结合能力 将磁性聚糖微球包埋在聚烷氰基丙烯酸酯中形成多 层的磁性聚合物微球 不仅保持了生物降解性 而且提高了强度 改善了球形 可用作靶向药物的载体 1 3 磁性高分子微球的生物医学应用 磁性高分子微球因具有 在外界磁场存在下能定向移动 的特殊性能 使 其在生物医学领域的应用非常广泛 磁性微球的高分子外壳的表面多样性使它 可以通过各种化学反应与生物活性物质中的配基偶联 从而识别相应的抗原或 抗体 核酸等 最后在外加磁场中进行分离 正是由于磁性高分子微球的顺磁 性 使它在磁场中定向移动 达到分离或靶向的目的 1 3 1 固定亿酶 游离酶在生物化学和生物医学方面的应用往往不尽人意 而将酶固定在磁 性载体上则有诸多的优势 这是因为酶固定在磁性高分子微球上后 其热稳定 6 桂林工学院硕士学位论文 性 存放稳定性和操作稳定性都得到提高 固定化酶再生性好 使用效率高 可用于连续生产 降低生产成本 可在外加磁场作用下快速分离 操作简单 适于大规模连续化操作 a k g o 1 刁用羰基二咪唑 c d i 活化的磁性聚乙烯醇微 球来固定转化酶 固定过程如下 昏 b w r g 一卜旷g n o 一卜ln h o a r i c a 3 4 1 等将环六亚甲基二胺 h m d a 连接在聚异丙烯酸甲酯 p m m a 磁性微球表面 用c d i 或c n b r 激活后用于共价结合葡糖淀粉酶 固定酶的活 性分别为5 7 c d i 活化 7 3 c n b 活化 研究了固定酶的各种稳定性 结果表明c n b 活化的磁性微球性质较好 r i t t i c h 3 5 采用三氯三嗪法将脱氧核糖 核酸酶固定在磁性纤维素微球和磁性聚 h e m a e d m a 微球上 用来降解 染色体和质体d n a 比较了p h 值和二价阳离子对固定酶和自由酶活性的影响 发现用c o 激活失去活性的固定酶可重复使用2 0 次 b i l k o v d 2 1 用磁性p h e m a e d m a 微球的酰肼衍生物固定半乳糖氧化酶 被定向固定的酶表现出很高的 存储活性和对环境的低敏感性 此外 用带功能基的硅烷磁性粒子也可固定化 酶 3 6 l 磁性载体的性质对固定酶的应用十分重要 它必须满足一定的条件 无 毒 可生物相容 能够提供足够大的表面积 使酶反应顺利进行 降低酶反应 基质和产物的分散限制 具有一定的机械强度 磁性微球固定化酶的方式很多 如物理吸附 金属螯合 化学偶联等 化学偶联是经过一定的活化处理使磁性 微球表面带有一定的功能基 然后与目标酶共价偶合 采用此方法固定的酶抗 温度 变性和有机溶剂的能力强 固定效率高 结合稳定 而使用物理吸附和 金属鳌合来固定酶 结合不牢固 酶易脱落 失活较大 回收过程中酶损失较 大 1 3 2 细胞分离 7 桂林工学院硕士学位论文 有效的细胞分离是临床免疫应用最基本最重要的一步 在磁性高分子微球 表面接上具有生物活性的吸附剂或配基 然后与目标细胞结合 加上外磁场将 细胞分离 分类 即磁性细胞分离 是一种有效的细胞分离方法 此法具有操 作简单快速 分离纯度高 保留细胞活性 成本低等优点 c h a t t e r j e e 3 7 l 在白蛋 白磁性微球 a l b m m s 和聚苯乙烯磁性微球 p s m m s 表面接上凝血素 用来分离红血细胞 这两种磁性微球都能与红血细胞有效结合 但由于 a l b m m s 的生物降解性和低毒性 使得用它分离的r b c s 可被再次注射到病 人体内 而p s m m s 只能用来结合将要遗弃的r b c s k a c e m i l 3 8 l 等为了研究胎 盘内皮细胞在血管形成及血流量维持中的作用 用免疫球蛋白磁性微球从胎盘 中分离出内皮进行分析 g o m r r l 3 9 1 贝l j 将单克隆a n t i e m a 和a n t i c a l l a 初级 抗体连接在二级抗体覆盖的聚苯乙烯磁性微球 d y n a b e a d s 上 从正常人乳腺 中分离上皮细胞和肌上皮细胞 1 3 3 磁性靶向给药 磁性靶向给药是以磁性高分子微球为载体 将药物包封在其中 吸附在高 分子层或偶联在表面 口服或注入体内 利用外加磁场引导载药微球到病患处 集中并缓慢释放 定向作用于靶组织 定向给药可使靶区药物浓度高于正常组 织 减少药剂量和药物毒副作用 提高药效 g h a s s a b i a n 4 0 l 等将地塞米松和f e 3 0 4 包埋于白蛋白微球中 用于治疗淋巴细胞肿瘤 结果表明 微球在有磁场存在 下的靶区滞留量比无磁场时多 并在一定时间内具有缓释性 h a f e l i 3 1 用磁性聚 乳酸放射性微球靶向治疗肿瘤细胞 进行了体外和体内放射效果研究 加外磁 场定位有7 3 的放射性在肿瘤区 而无外磁场时只有6 左右的放射性在肿瘤 区 9 0 y m m s 在靶区可有效杀死肿瘤细胞 邱广亮 4 1 1 等人制备了磁性导向柔 红霉素白蛋白微球 含药微球在体外1 2 h 内释放完全 具有一定的缓释作用 体内外磁定位实验表明 磁性白蛋白微球制剂可浓基于靶区 稳定性考察表明 所制微球稳定性良好 由于药物载体会与药物一起进入人体内 而药物载体必须不能对人体造成 伤害 故用于靶向药物的磁性高分子微球必须满足一定要求 1 具有生物降解 性 f e 3 0 4 可在一定时间内自然排出体外 主要是要求聚合物可生物降解 可 桂林工学院硕士学位论文 一 杰 一一o l o q r 1 o c 卅训 一c i i 一r 5 n h o l i g o 用于核酸杂化测定或含特定序列核酸的提纯 可自动操作和重复使用 产 物纯度高 除了可应用于以上生物医药领域 磁性高分子微球还可用于生物分子识别 4 7 细胞跟踪速度标定h 蚋 微量有机物测定h 9 等 近年来 磁性高分子微球引起了人们极大的兴趣 有大量的研究论文发表 但由于磁性高分子微球的基础理论研究不够 如形成机理 结构与性能的关系及 磁性来源等 还未形成完整的磁性高分子微球理论 因此 要使磁性高分子微球在 应用领域得到推广 广大学者还要做很多深入细致的研究工作 1 4 本课题的主要研究内容和意义 本课题分三个部分 分别合成了磁性1 3 环糊精聚合物微球 磁性 乙烯吡咯 烷酮一甲基丙烯酸 共聚微球和磁性交联海藻酸钠微球 并将它们分别用应用于 靶向药物 蛋白质吸附分离和固定化酶领域 本课题的意义在于 1 磁性药物微球是磁性药物制剂的一种类型 是靶向给药系统的新剂型 负载有缓释药物的磁性颗粒能够在外磁场的导向作用下 将药物运送到人体预 定的病变部位进行控制释放 这样可减小毒副作用 降低药物用量 提高药效 用磁性且 环糊精聚合物微球负载姜黄素得到具有靶向作用的磁性药物微球 磁 性微球中的f e 3 0 4 超微粒子可以定期安全的被排除体外 而b 一环糊精交联聚合 物可生物降解 因此 该磁性药物微球有望用于药物制剂 2 将牛血清白蛋白吸附在磁性o v p m a a 共聚微球上 然后在外加磁场 下进行分离 分离过程简便 快速 高纯 高效 由于具有诸多优点 这种蛋白 质的磁分离方法有望取代传统的蛋白质分离方法 o 桂林工学院硕士学位论文 3 以磁性高分子微球作为固定酶的载体 有利于固定化酶从反应体系中 分离和回收 操作简便 可再生 且可提高酶的稳定性 改善酶的性质 交联 海藻酸钠磁性微球固定化胰蛋白酶 固定后的酶性质有所改善 且分离效果好 第二章b 一环糊精聚合物微球磁性的制备及靶向药物研究 2 1 前言 g 环糊精是由7 个葡萄糖分子以g t 1 4 糖苷键连接而成的环状低聚糖 其 非极性的疏水空腔可以以范德华力 疏水作用和氢键等与分子问尺寸相匹配的 许多疏水性客体分子或某些客体分子的疏水性基团形成稳定的超分子包结化合 物 5 0 由于b c d 聚合物保留了疏水性空腔 故具有 3 c d 同样的包结作用 以b 环糊精聚合物微球作为载体 可将不溶药物包合于疏水空腔中制成超微囊 包合物 药物呈分子状分散 释药缓慢 延长药物疗效 易于吸收陋 姜黄素是中药姜黄发挥药理作用的重要活性成分 近年的研究不仅证明了 姜黄的传统作用 而且还揭示出一些新的药理作用 52 1 如抗炎 抗氧化 清除 氧自由基及抗癌防癌等作用 且抗癌广谱 毒副作用小 但由于姜黄素不溶于 水 生物利用度不高 磁性药物微球大多是将药物和磁性物质共包于聚合物中形成的微球1 5 1 j 它具有靶向作用 即在一定外加磁场作用下 可引导药物微球在体内定向移动 定位浓集 从而提高药效 降低药物毒副作用 本文用交联法使1 3 一c d 包裹磁 性物质形成聚合物磁性微球 然后使姜黄素与微球表面f s c d 空腔包结 得到 一种新型磁性药物微球 2 2 仪器与试剂 h g 3 0 3 3 a 电热恒温培养箱 南京实验仪器厂 7 2 2 型可见分光光度计 上 海精密仪器科技有限公司 t h z 8 2 恒温水浴振荡器 江苏省金坛市荣华仪 器制造公司 p a r a g o n5 0 0 红外光谱仪 k b r 压片 美国p e 公司 日立h 6 0 0 桂林工学院硕士学位论文 透射电镜 日本日立公司 l s p o p i i i 激光粒度仪 珠海o m e c 公司 d 8 a d n c e x 射线衍射仪 德国布克公司 f d f m a 磁天平 上海复旦天 欣科教仪器有限公司 d d 8 3 2 0 多功能蠕动泵 上海之信仪器有限公司 q f l 7 1 2 m 4 型直流稳压电源 成都前锋电子仪器厂 l i n k i s i s 3 0 0 型x 射线 能谱仪 英国o x f o r d 公司 自制电磁铁 f e s 0 4 7 h 2 0 广州化学试剂厂 化学纯 f e c l 3 3 h 2 0 广州化学试剂厂 化学纯 o p 乳化剂 上海南威化工有限公司一部 浓度9 9 b c d 上海生物 化学试剂公司 分析纯 环氧氯丙烷 广州新巷化工厂 分析纯 姜黄素 上海 试剂三厂 分析纯 2 3 实验方法 2 3 1b 一环糊精聚合物磁性微球的制备 5 将6 m l 0 5 m o l l f e 2 水溶液和1 0 m l 0 5 m o l l 的f e 水溶液混合均匀 搅绊下 加入6 0 m l 3 m 0 1 l n a o h 溶液 反应3 0 m i n 然后加入4 的0 p 水溶液5 0 m l 继续 反应3 0 m i n 得到分散均匀的磁流体 磁流体静置后除去上层清液 加入2 0 m l 4 的o p 水溶液 超声处理3 0 m i n 后 再用4 的0 p 水溶液稀释至7 5 m l 升温至 5 0 0 c 在5 0 0 c 下 取8 9b c d 溶于2 0 m l 2 0 的n a o h 水溶液 然后将其与7 5 m l 的磁流体混合均匀 超声分散1 0 m i n 移入三颈烧瓶中 5 0 0 c 水浴加热 电动 搅拌下 滴加3 5 m l 环氧氯丙烷 反应1 h 反应结束后反应结束后 进行磁分 离 将磁性微球倒入透析袋中 在p h l 的h c l 溶液中透析3 天 然后洗涤 干 燥 备用 2 3 2 磁导向姜黄素一b 一环糊精聚合物磁性微球的制备 取磁性微球0 2 5 9 移入三颈烧瓶中 加入5 0 m l 蒸馏水和 5 m l n a 2 c 0 3 n a h c 0 3 p h 1 0 2 5 缓冲溶液 称取o 1 9 姜黄素溶于5 0 m l 乙醇后 移入上述三颈烧瓶 3 0 0 c 水浴 电动搅拌反应1 2 h 静置 过滤 分别用水和 丙酮洗涤数次 干燥后备用 2 3 3 微球的表征 桂林工学院硕士学位论文 用透射电镜观察磁性微球的形貌和分散性 l s p o p i 激光粒度仪测定的 磁性微球平均粒径 红外光谱仪测定磁性微球和磁性药物磁性微球结构中的特 征基团 x 一射线衍射仪分析b c d 聚合物 f e 舢及磁性微球和磁性药物微球的 表面结构 x 射线能谱仪测定磁性微球表层的结构组成 2 3 4 磁性微球中f e 0 含量的测定 用e d t a 络合滴定法测定磁性微球中f e 3 十的含量 5 7 并换算成f e 3 0 4 百分 含量 测定方法 称取o 1 9 磁性微球 加入浓硝酸1 0 m l 加热至无定型物后 蒸至试管内液体约l m l 用蒸馏水定容至1 0 0 m l 取1 5 m l 调节p h 至2 在 5 0 6 0 以5 一磺基水杨酸为指示剂 用o 0 1 9 7 8 m o l l 的e d t a 滴定f e 计 的浓度 按下式计算f e 3 0 4 含量 f e 3 0 4 c f e 3 矿尼抖 mf e 3 0 4 0 1 x 1 0 0 2 3 5 磁性微球磁响应性测定方法 取l m l 磁流体移入量筒中 稀释到1 0 m l 置于磁场中 记录磁性微球完 全沉淀的时间 以沉降时间长短来表示其磁性大小 2 3 6 磁化率的测定 用f d f m a 磁天平测定磁性微球的磁化率 按下式计算 x u 2 z m 8 a m g m g o m h m x p 一样品的实际高度 l 一无外加磁场时的质量 m 一样品的摩尔质量 p 一样品密度 装填密度 o 一真空磁导率 x f 一空气的体积磁化率 均采用标 准单位 因样品体积很小 后一项忽略不计 2 3 7 姜黄素百分含量的测定 磁性药物微球中姜黄素百分含量 用分光光度法测定1 5 吸收曲线的制作 配制o 2g l 姜黄素溶液5 0 0m l 溶剂为3 1 的乙醇 一生理盐水 逐级稀释至o 0 1 6g o l 和o 0 0 6 4g l 取o 0 0 6 4g o l 的姜黄 素溶液在3 9 0 4 6 0 n m 之间扫描测得吸收曲线 见图2 一1 由图2 1 可知最大 吸收波长为4 3 0 r i m 标准曲线得制作 分别取1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5m l 浓度为0 0 1 6g o l 的姜黄素溶液到比色管中 稀释到1 0m l 分别测得吸光度 1 桂林工学院硕士学位论文 作图 图2 2 得线性回归方程为a 1 1 6 3 6 c 0 0 1 1 4 姜黄素百分含量测定方法 用磨口锥形瓶称取o 1 9 药物微球 加入6 0 m l 3 1 的乙醇生理盐水溶液 将锥形瓶放在3 7 5 c 的水浴振荡器中振荡2 h 后 磁性 分