（纺织化学与染整工程专业论文）胍变溶菌酶在疏水色谱表面折叠焓变的微量热研究[纺织化学与染整工程专业优秀论文].pdf

胍变溶菌酶在疏水色谱表面折叠焓变 的微量热研究 摘要 本研究利用双光束紫外分光光度计及圆二色c d 光谱仪，对不同浓度盐酸胍变性 的溶菌酶水溶液进行扫描测定，以研究变性程度不同时，溶菌酶的二级和三级结构的 变化。结果发现随着盐酸胍浓度从0 4 增加到2 6 t o o l l ( 蛋白浓度为o 4 m g m l ) ，溶菌 酶的变性程度也不断加强，逐渐失去其二级和三缴结构。但又发现溶菌酶均未被完全 变性，仍不同程度保留着二级和三级结构。 2 5 0 ，0 0 1 和3 5 0 0 0 l 时，不同盐酸胍( g u h c i ) 浓度变性的溶菌酶在高效 液相色谱疏水固体( 端基p e g 6 0 0 ) 表面的置换吸附的总焓变( h ，) 是用量热的方法 测定的。目的是建立一套新的直接测量蛋白在液固界面上折叠的热效应和自由能的 微量热的方法。变性蛋白在疏水填料p e g 6 0 0 上折叠并吸附时，所涉及的焓变包括 三部分：吸附亲合作用，去水合作用和分子构象。2 5 时，由去水合作用所导致的熵 驱动促使变性蛋白溶菌酶分子在p e g 6 0 0 表面吸附和复性。在2 5 时溶菌酶的折叠 路径中相应于0 8 m o l lg u h c i 时有一个较低的“能垒”。2 5 、3 5 时在1 8 m o l l g u h c l 处都有一个相对较低的焓变，可能出现了类似于能量较低被称为“能阱”的 中间态。溶菌酶的折叠焓a h i 比通常溶液中要高出1 0 1 0 0 倍，是由于疏水填料 p e g 。6 0 0 的表面给溶菌酶分子提供了足够高的能量使它整个分子发生去水合作用并 折叠成天然态的构象，然而在通常的溶液中，溶菌酶只能部分折叠。温度升高，体系 中的分子运动加剧，有利于溶菌酶的折叠、复性，导致3 5 。c 时g u h c l 浓度从1 3 至 2 6 m o l l 时，珏表现为放热，且在1 8 m o l l 处h j 最大。 采用摇床法通过改变盐酸胍和溶菌酶的浓度测定2 5 和3 5 两个温度下的变性 溶菌酶( l y s ) 在疏水色谱填料p e g 6 0 0 表面的吸附等温线。研究发现2 5 。c 时包覆作用 显著，温度升高时，包覆作用消失，吸附容易达到平衡。改变盐酸胍浓度，吸附量的 变化与三种作用力( 去水合作用，亲合力，分子构象作用力) 的相对大小有关；盐酸 胍浓度为o 8 m o l l 时吸附量达最大值，暗示蛋白可能发生了构象突变。以s d m a 对 溶菌酶的吸附等温线进行拟合的线性关系较好，证明溶菌酶在液一固界面上的吸附符 合吸附计量置换模型( s d m a ) 。s d m a 热力学研究表明，变性溶菌酶在疏水色谱 填料p e g 6 0 0 表面的吸附过程是自发进行的，这符合吸附过程的一般规律，然而， 吸附亲合自由能变a g 。才是这个过程的驱动力。 关键词：微量热，溶菌酶，蛋白折叠，液固界面，计量置换吸附模型( s d m a ) ，s d m - a 的热力学 c a l o r i m e t r i c s t u d yo ne n t h a l p i e so f g u a n i d i n e d e n a t u r e dl y s o z y m ef o l d i n go nt h e s u r f a c e o fh y d r o p h o b i cc h r o m a t o g r a p h yp a c k i n g s a b s t r a c t t h ed i f f e r e n t i a lu l t r a v i o l e ts p e c t r u ma n dc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) w e r eu s e dt os t u d yt h e l y ss o l u t i o n sd e n a t u r e db yg u a n i d i n eh y d r o c h l o r i d e ( g u h c l ) ，a n dt h ec h a n g e so f s e c o n d a r ya n dt e r t i a r ys t r u c t u r e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e n a t u r e dd e g r e eo fl y s i n c r e a s e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o nf r o m0 4t o2 6 m o l lg u h c i ，a n dt h es e c o n d a r ya n d t e r t i a r ys t r u c t u r ea l s ol o s tg r a d u a l l y b u ti tw a sa l s of o u n dt h a tt h el y sw e r ea l ln o t d e n a t u r e dc o m p l e t e l y , a n dh e l ds o m es e c o n d a r ya n dt e r t i a r ys t r u c t u r e c a l o r i m e t r i cd e t e r m i n a t i o no ft h et o t a l e n t h a l p yc h a n g e s ( a h i ) o fd i s p l a c e m e n t a d s o r p t i o no fg u a n i d i n e d e n a t u r e dl y s o z y m e ( l y s ) d u r i n gt h ea d s o r p t i o n w i t h s i m u l t a n e o u s l yr e f o l d i n go nt h es u r f a c eo fh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( h i c ) p a c k i n g s ( e n dg r o u pp e g 一6 0 0 ) w a sc a r r i e do u ta t2 5 - t - 0 0 0 1 c a n d3 5 o 0 0 1 t h ea i m o ft h i ss t u d yi st oe s t a b l i s han e wm i c r o c a l o r i m e t r i cm e t h o dt om e a s u r ed i r e c t l yt h eh e a t e f f e c t sa n dt h ef r e ee n e r g yc h a n g e sa t t a i n e dt h e r e a f t e ra tt h el i q u i d s o l i di n t e r f a c e t h e m e a s u r e d hi nt h ec i r c u m s t a n c e ss h o u l di n c l u d et h ec h a n g e si nt h et h r e ef r a c t i o n s ： a d s o r p t i o na f f i n i t y , d e h y d r a t i o na n dm o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n i tw a sf o u n dt h a tw h e nt h e u n f o l d e dl y sm o l e c u l e sa d s o r ba n dr e f o l do nt h ep e g - 6 0 0s u r f a c ea t2 5 o 0 01 e n t r o p y - d r i v i n gc a u s e db yt h ed e h y d r a t i o no fl y sm a i n l yd o m i n a t e st h ef o r e g o i n gp r o c e s s ， t h es t u d ys h o w st h a to nt h ep a t h w a yo fk sr e f o l d i n ga t2 5 0 0 0 1 al o w e re n e r g y a b r u p tc h a n g e ( a si f i tw e r ea ne n e r g yb a r r i e r , b u ta c t u a l l yn o t ) c o r r e s p o n d i n gt o0 8 m o l l g u a n i d i n eh y d r o c h l o r i d e ( c , u h c i ) m a yo c c u r a t2 5 o 0 0 1 a n d3 5 o 0 0 l a l l e n e r g ya b r u p tc h a n g ei sl o w e rt h a nt h a ti tw o u l db ee x p e c t e d ，w h i c hc a l lb ec a l l e d “e n e r g y w e l l ”a tt h ec o n c e n t r a t i o no fg u h c l ( c g u u c t ) a p p r o x i m a t e1 ，8 m o l lc o r r e s p o n d i n gt oa n i n t e r m e d i a t es t a t e t h er e f o l d i n ge n t h a l p i e so f l y s h iw e r ef o u n dt ob e1 0 1 0 0f o l d s h i g h e r t h a nt h a tm e a s u r e di nu s u a ls o l u t i o n s ，b e c a u s et h e e m p l o y e dm o d e r a t e l y h y d r o p h o b i cs u r f a c ep r o v i d e dh i g he n o u g he n e r g yt ot h eu n f o l dl y sm o l e c u l e s ，r e s t t l t i n gi n a c c e l e r a t i n gt h ep r o c e s so ft h ed e h y d r a t i n ga n dr e f o t d i n go ft h eh y d r a t e du n f o l d - l y si n t o i t sn a t i v es t a t e w h e nt h et e m p e r a t u r ew a sr a i s e dt o3 5 o + 0 0 1 t h em o v e m e n to f m o l e c u l e sw e r ef a s t e n ，a n dt h er e f o l d i n go ft h el y sm o l e c u l e sw o u l db em o r e a d v a n t a g e o u s w h i c hr e s u l t e di n ：h iw e r ee x o t h e r m i cf r o m1 3 t o2 6 m o l lg u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e ( g u h c b a n d - h io f1 ，8 m o l lw a st h em o s t a d s o r p t i o n i s o t h e r mo fl y s o z y m e ( l y s ) w h i c ho r i g i n a l l yh a db e e nd e n a t u r e db y g n a n i d i n eh y d r o c h l o r i d e ( o u h c i ) a tt h eh y d r o p h o b i cc h r o m a t o g r a p h yp a c k i n g s ( e n dg r o u p p e g 一6 0 0 ) s u r f a c eh a sb e e nd e t e r m i n e du n d e rt h ec o n d i t i o no fc h a n g i n gt h ec o n c e n t r a t i o n o fl y s o z y m ea n dc j u h c lu n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e su s i n gv i b r a t o r i tw a sf o u n dt h a tt h e a d s o r b e dl y sm o l e c u l e sw e r e “w r a p p e d u p ”a t2 5 i sr e m a r k a b l y , a n dt h ew r a p p i n gw i l l d i s a p p e a rw h e nt e m p e r a t u r ei n c r e a s e st o3 5 b e c a u s et h ea d s o r p t i o ne q u i l i b r i u ms l a t ei s e a s yt or e a c ha th i g h e rt e m p e r a t u r e t h ea d s o r p t i o na m o u n t sc h a n g e a b l e 谢t l lc o u h c ia r e r e l a t i v et ot h r e ei n t e r a c t i o n s ，i e d e h y d r a t i o n ，a d s o r p t i o na f f i n i t ya n dm o l e c u l a r c o n f o r m a t i o n ；t h em a x i m u ma d s o r p t i o na m o u n to fc o u h c io 8 m o l li m p l i e st h a tam u t a t i o n ( o rt u m u l ta tl e a s t ) o fm o l e c u l a rc o n f o r m a t i o nm a yo c c u r t h ef a c tt h a tt h eg o o dl i n e a r r e l a t i o n s h i po fa d s o r p t i o ni s o t h e r m so fl y sp l o t t e db ys t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tm o d e l o fa d s o r p t i o n ( s d m - a ) e x i s t sd e m o n s t r a t e st h a tt h ef o l d i n ga d s o r p t i o no fl y sa tt h e p e g 6 0 0s u r f a c ec o i n c i d e 、析t l lt h es d m a t h e r m o d y n a m i c s t u d yo fs d m as h o w s t h a tt h ea d s o r p t i o no fl y si sas p o n t a n e o u sp r o c e s s ，a n dt h es p o n t a n e o u sp r o c e s s e sa r et h e r e s u l to f g aa sd r i v i n gf o r c e ，w h i c hf i t st h eg e n e r a lr u l eo fa d s o r p t i o np r o c e s s h u i f a n gz h a n g ( d y e i n ga n df i n i s h i n ge n g i n e e r i n g ) d i r e c t e db yp r o f x i n p e n gg e n ga n dp r o f j i a n w e ix i n g k e y w o r d s ：m i c r o c a l o r i m e t r y , l y s o z y m e ，p r o t e i nf o l d i n g ，l i q u i d s o l i di n t e r f a c e ， s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tm o d e lo f a d s o r p t i o n ( s d m a ) 绪论 1 1 本课题的研究目的及意义 1 绪论 本课题的主要任务是用微量热的方法测定不同盐酸胍( g u h c l ) 浓度变性的溶菌 酶在高效液相色谱疏水固体( 端基p e g 6 0 0 ) 表面置换吸附的总焓变( a h i ) 。目的是 建立一套新的直接测量蛋白在液固界面上折叠的热效应和自由能的微量热的方法。 蛋白折叠的量热研究是探讨蛋白折叠特性及规律这一分子生物学中前沿课题的 极其重要的途径，这就使得它成为分子生物学和量热学相互交叉渗透的一个前沿课 题。迄今为止蛋白折叠仍存在着两个悬而未决的基本问题，一是对应于折叠过程中是 否存在自由能最低的中间态，另一个是对应于在折叠途径中是否有潜在的能垒，而蛋 白在液固界面上折叠的量热研究有助于对这些问题的理解和最终解决。而且蛋白在 液固界面上折叠量热的研究成果还有助于提高基因工程技术产业化的水平，寻找蛋 自折叠自由能与蛋白复性的活性及回收率的关系，对基因工程产品的生产与纯化具有 重大意义。量热法的一个最突出的特点就是描述体系过程中能量变化的直接性，且随 着微量热技术精密、准确性的不断提高，由此得到的蛋白折叠自由能的精确度和置信 水平之高都是其它方法不可比拟的。 1 2 国内外研究现状 目前在研究蛋白质折叠时常用的变性手段有：脲、胍的变性和酸碱变性等。关于 脲和胍变性蛋白的机理，目前主要有以下三种观点：( 1 ) 变性剂通过与蛋白分子骨架 表面上的氨基酸形成氢键使蛋白质变性【1 l ；( 2 ) 变性剂通过破坏蛋白质分子内部的疏 水键，促使疏水基暴露而使蛋白质失去立体结构囝；( 3 ) 变性剂与蛋白质分子特殊区 域或肽官能团作用，引起蛋白质分子的构象变化1 3 】。 关于变性蛋白质的折叠、复性，传统的复性方法有两种：稀释法( d i l u t i o n ) 和透 析法( d i a l y s i s ) 。前者通过降低变性剂的浓度而使蛋白质复性，但样品体积增大，后处 理工作量大；后者通过除去变性剂使蛋白质复性，但耗时较长。这两种方法的另一个 严重缺陷是蛋白质的复性效率低，通常仅有5 2 0 1 4 。近年来人们在不断探索提高复 性效率的新方法，如用反胶柬法【5 】、溶液中添加聚乙二醇1 6 、表面活性剂口1 或某些单 1 绪论 抗等均可在不同程度上提高复性效率。分子伴侣协助复性是近几年提出的蛋白质复性 新方法，已成为研究热点的课题之一。分子伴侣是细胞内参与协助新生肽链体内折叠 的一类蛋白质。它们能结合到折叠中间体的疏水表面，能防止多肽链的错误折叠或聚 集，从而起到提高蛋白质复性效率的作用。a l t a m i r a n o 等【8 1 将分子伴侣固化在凝胶介 质上制备的蛋白质复性介质，可在复性中多次重复使用。但分子伴侣协助蛋白质复性 尚存在许多问题值得探讨。蛋白在适度疏水色谱表面上的吸附及折叠研究是近年来刚 刚兴起的蛋白折叠复性及纯化技术的新的研究领域。液相色谱( l c ) 已成为分离纯 化蛋白质非常有效的方法之一，并有望成为基因工程领域内蛋白复性的重要手段。 1 9 9 1 年耿信笃等人首次将基因工程发酵的重组人干扰素吖( d f n y ) 的g u h c i 提取 液在4 0 r a i n 内经一次高效液相色谱h p i - i i c 分离就可使其纯度达到8 5 ，活性回收率 为常规稀释法的2 3 倍“。将盐酸胍变性的牛血清白蛋白( b s a ) 、溶菌酶( l y s ) 、 核糖核酸酶( r n a s e ) 混合蛋白质通过h p h i c 柱，能在3 0 m i n 内获得除去变性剂、分 离和完全复性的三重功效，盐酸胍变性的a 淀粉酶也能得到部分复性【l 到。三年以后， 捷克、美国和日本的科学家分别用离子交换色谱( i e c ) t i 3 l 尺寸排阻色谱( s e c ) i t 4 和亲和色谱( a f c ) 【1 5 成功地使变性蛋白复性；最近a l t a m i r a n o 用亲和色谱将某些在 复性缓冲溶液中不能得到复性的蛋白完全复性，并将此方法命名为再折叠色谱 ( r e f o l d i n gc h r o m a t o g r a p h y ) 【8 ，1 6 1 。 在过去的2 0 多年里，微热量计已经被越来越多的应用于各种生物大分子特别是 蛋白质和核酸的热力学及动力学研究。h a n s j t t r g e nh i n z d t l j l 恿过合适的测定方法并依 据两态转变模型，应用d s c 测定得到鸡蛋白溶菌酶的平均热变性转交温度为3 3 1 2 k ( 数值的变化介于3 2 9 4 k 至3 3 1 9 k ) ，平均变性转变焓为4 0 5 k j m o l ( 数值介于 3 3 7 k j m o l 至4 3 9 k j m 0 1 ) 。a o n e n gc a o 等【l8 j 利用d s c 在一个很宽的p h 值范围内( 从 1 5 至9 4 ) ，研究鸡蛋白溶菌酶的热变性和复性，结果发现热变性温度( t m ) 与鸡蛋 白溶菌酶缓慢再折叠速率的对数i n k 2 成线性关系。b u r o v at 等 1 9 1 用高灵敏度的差示 扫描微热量计( d s c ) 测定冻干的鸡蛋白溶菌酶在1 0 1 5 0 ( 2 温度范围内的协同型转移 烩及热容，从而获得了转移自由能，并揭示了溶蔼酶折叠构型的稳定性。t a k a n ok 等用d s c 研究在转折结构处删去或代入氨基酸残基的6 种突变溶菌酶。以弄清一 种球形蛋白在转折处的形态稳定性和在折叠中氨基酸残基的作用。p e n gz g 等人2 1 利用d s c 研究发现温度从2 0 升至1 0 0 吸附于f e 3 0 4性固体颗粒表面的溶菌酶没 有发生热致变性转变。之所以得到如此广泛的应用主要归功于微热量计越来越高的准 确性和灵敏度，以及日益提高的使用的方便性。而且人们认识到在提高d s c 的微量 2 ! 堕丝 一 一_ _ - _ _ _ _ _ _ 一 热性能上当前最重要的问题是提高仪器检测的灵敏度，从而当应用于昂贵的蛋白样品 时可以减少用量，甚至开辟新的应用领域。精密量热法研究蛋白折叠自由能是从能量 角度探讨蛋白折叠特性及规律这一前沿课题的极其重要也是最直接的途径。溶菌酶在 一种疏水色谱填料上折叠焓变的微量热测定可以说是为研究蛋白在液固界面上折叠 自由能迈出了第步。 目前有关蛋白变性以及折叠、复性方面的报道大多集中在溶液体系。 t z h a d 等田1 用荧光探针对鸡蛋白溶菌酶在折叠路径中三级结构的动力学进行研究。l i n g l i n g c h e n 等利用x 射线衍射对溶菌酶的折叠过程进行动力学研究，发现在折叠路径中 有中间态存在，这个结果对传统的两态模型而言是一种挑战。b e r tv a i ld e nb e r g 等j 通过稀释8 0m o l l 脲变性的溶菌酶水溶液发现p h 值近中性时，变性蛋白被氧化丽复 性。并用反相高效液相色谱在p h 值为2 时，分离出了折叠中问体。杨芳、梁毅【2 5 l 等在脲和盐酸胍诱导溶菌酶去折叠的荧光相图法研究中发现：有还原剂存在时，变性 过程符台两态模型，且不存在任何部分折叠中间体；无还原剂存在时，变性过程符合 “三态模型”。由b u r o v a 【9 j 等人对天然和经过热变性的溶菌酶样品在水中和在甘油中 的转变焓进行测定，结果分别为4 3 0 4 - 1 7 k j m o l 和4 7 6 - t - 2 8 i d m o l 。由c u e l oe ta 1 m l 测 定的天然和变性溶菌酶在不同条件下的全部是吸热的平衡吸附转变焓是从2 2 6 0 到 4 0 6 7k j m o l 。 至今关于在液固界面上蛋白折叠、自由能的测定的微量热研究的报道还很少见。 尽管人们已经知道固体表面对蛋白折叠的贡献相对溶液中非常之大。在地球重力场或 生物体内，蛋白质的折叠多在固体表面进行，例如，在体外的容器表面或体内的细胞 膜表面以及变性蛋白的液相色谱复性( 折叠) 时的固定相表面。但用量热的方法对液 侗界面上蛋白折叠问题开展的研究还是很少。定量的表达固体表面对蛋白折叠贡献 的一个直接的途径是使用微量热的方法对蛋白折叠的焓交a a h 进行测量，从而迸一 步获得蛋白折叠的自由f 1 a a g 。 研究蛋白在液固界面上的折叠通常要讨论蛋白在界面上的吸附作用。蛋白在界 面上吸附是众所周知和普遍存在的现蒙 2 7 - 2 9 】。例如，食品加工设备的沾污现象；在制 药工业中确定物质的生物协同性；生物材料、生物传感器的研究等等。近些年所报道 的关于溶菌酶在固液界面上的吸附研究也层出不穷 3 0 - 3 4 】。溶菌酶在疏水表面吸附等 温线的研究，不仅能为测量蛋白折叠焓变和自由能变提供必须的吸附量，而且也能为 蛋白折叠机理研究提供重要的信息。现有的吸附等温线的研究报道均为色谱法研究 口”，但色谱中流动相是连续的，而量热实验是一系列单元操作，为了解决量热实验中 1 绪论 蛋白吸附量的计量，需要用摇床法测定蛋白的吸附等温线，而目前还无采用此法对蛋 白吸附量进行研究的报道。液一固界面吸附中，常见的吸附模型有：l a n g m u i r 方程， f r e u n d l i c h 方程和溶质吸附计量置换模型( s d m a ) ，但s d m - a 要远远优于l a n g m u i r 和f r e u n d l i e h 模型m i 。 双光束紫外分光光度计和圆二色( c d ) 光谱仪是目前研究蛋白质在溶液中构象 的两种主要手段。早在1 9 5 6 年l a s k o w s k i 等 3 7 1 对胰岛索进行了p h 差光谱研究，以 后由h e r s k o v i t s 【3 8 】、f i s h c r 3 9 1 、b e l l o t 4 q 4 1 1 等逐步完善了各种差光谱的技术，使紫外差 光谱成为测定溶液构象的常用手段之一。圆二色( c d ) 光谱也是研究蛋白质在溶液 中的构象的一个十分重要的手段。它的优点在于可以应用于蛋白浓度相对低的体系， 而且对于缓冲溶液要求较低1 , 1 2 。蛋白溶液通常可以直接用于测量，而无须进行预处理。 随着实验手段和各种光谱，波谱实验技术的发展和完善，人们对于蛋白质结构的认识 越来越深入，可能会从中找出更多的结构规律，从而为深刻了解蛋白质结构和功能之 间的关系以及探测蛋白质变性和折叠的奥秘打下坚实的基础。 1 3 蛋自质及其变性和折叠、复眭 1 3 1 蛋白质简介 蛋白质( p r o t e i n ) 是细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎 所有的生命活动和生命过程。它最初发现于鸡蛋，是一类含氮的复杂有机化合物。早 在1 0 0 多年前，恩格斯就指出：“生命是蛋白体的存在方式”，“无论在什么地方。只 要我们遇到生命，我们就发现生命是和某种蛋白质相联系的；并且无论在什么地方， 只要我们遇到不处于解体过程的蛋白体，我们也无例外地发现生命现象”。1 0 0 多年 的科学实践，特别是近几十年来现代生物学、生物化学的成就，充分证实和发展了恩 格斯的伟大预见。实践证明，蛋白质与生命现象是密切相关的，凡有生命的地方，基 本上都有蛋白质在起作用。 2 0 世纪4 0 年代末至5 0 年代，开始了现代分子生物学的革命。人们建立了从脱 氧核糖核酸翻译成核糖核酸，再合成蛋白质的中心法则( c e n t r a ld o g m a ) 。生物体内 的分子运作的基本框架也就得到了阐明和了解【4 3 l 。但是作为广义的生物中心法则的最 后一步，也是十分重要的一步，蛋白质与生物功能之间的联系还没有很好的分析和认 识h a 作为生命功能的直接执行者，蛋白质分子怎样形成特定的功能结构，如何发挥 生物作用，实现大千世界生命过程的运作，对于人们仍然是一个需要继续探索的领域。 1 绪论 对蛋白质的结构和动力学的知识了解的不够是影响人们认识和控制生命活动的主要 的障碍之一。 因此，研究蛋白质的结构和功能是我们研究蛋自质的构象变化以及交性和折叠、 复性等问题的基础，而且对于了解基本的生命活动，探讨生命的奥秘是十分重要的。 1 ，3 1 1 蛋白质的基本组成单元：氨基酸 蛋白质通常由一条或多条异质线性离分子肽链组成，它的基本组成单元是氨基酸 ( a m i n oa c i d ) 。天然蛋白质主要由2 0 种标准氨基酸组成，他们都属于l 型d 氨基酸。 各种氨基酸在结构上都有个共同点：在与羧基一c o o h 相连的碳原子( 即d 。碳原子) 上都由个氨基，如图1 1 所示。它们的不同之处在于他们的侧链( 即图1 - 1 中的r 基团) 不同。 土l o s h 一：土 l ijn r 图1 - 1 蛋白质氢基酸分子示意图 1 3 1 2 蛋白质的多肽链状结构 蛋白质是由氨基酸头尾以酰胺键相连而形成的多肽链构成的。大量的氨基酸之间 可以通过肽键首尾连接，形成一条多肽链。有些蛋白质分子只是一条多肽链，有些则 是有几条多肽链组成的。 蛋白质分子种类繁多，结构复杂，但是各种蛋白质结构也具有一些共同点。在研 究中为方便起见，通常人为地将其结构分为几个层次【4 5 】： 一级结构( p r i m a r ys t r u c t u r e ) ，也就是多肽链中氨基酸的数其，神类和排列腰序， 即氨基酸如何连接成肽链以及氨基酸在肽链中的排列顺序。这是它的化学结构，而不 涉及空间排列。 二级结构( s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) ，指在多肽链骨架的局部空间结构，不考虑侧链的 构象以及整个肽链的空间排列。两种相对比较简单而又常见的二级结构是a 一螺旋结构 和d 一折叠片结构。 三级结构( t e r t i a r ys t r u c t u r e ) ，是蛋白质的三维空间结构。指的是肽链结构盘绕， 折叠形成的复杂的空间结构，包括肽链中一切原子的空间排列方式，即原子在分子中 的空间排列和组合方式。 四级结构( q u a r t e m a r ys t r u c t u r e ) ，指含有多条多肽链的蛋白质分子中各亚基之间 发生相互作用而形成的构象。如有些蛋白质分子含有4 个肽链( 亚基) ，其中2 个是 一链，另外2 个是b 链。这4 条肽链以一定的方式聚在一起，形成特定的空间构象， 就是四级结构。 随着蛋白质结构和功能研究的进展，人们认为在蛋白质二级结构和三级结构之间 应加入两个层次：超二级结构( s u p e r s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) 和结构域( d o m a i n ) 。超二 级结构是指二级结构单元相互接近，形成的有规律的二级结构聚集体。结构域则是指 蛋白质分子中那些明显可以分开的球状部分。 概括来说，蛋白质的结构层次可以用下面的示意图说明： 四级结构 f 三级结构 f 结构域 超二级结构 二警构 j 一级结构 图1 - 2 蛋白质结构的不同层次不意图 1 3 1 3 肽链中的相互作用 蛋白质结构和功能紧密相关，而蛋白质能否形成并稳定其天然结构，决定于蛋白 质分子中各部分之间的相互作用。蛋白质的各原子通过化学键连接成长链。由于化学 键结合强度很大，一般的热扰动对它的影响很小。蛋白质结构的稳定性在很大程度上 决定于各原予间的非键相互作用。影响蛋白质结构的非键相互作用主要包括： a 静电相互作用。组成蛋白质的氨基酸中的多种可离解的侧链基团。在正常的生 理条件下，带有电荷。这些离解后的带电基团，相互之间可能产生静电作用。蛋白质 中一些极性基团，在分子内其他原子或基团作用下，也可能诱导成为一些稳定性的永 久偶极。这些永久偶极之间以及永久偶极和带电基团之间也能产生静电作用。 b 氢键。氢键是形成蛋白质中规则二级结构的主要作用力。除了形成二级结构中 的氢键外，其他的极性基团也多形成氢键。氢键在蛋白质的结合基催化过程中起重要 绪论 作用。 c 范德华( v a nd e r w a a l s ) 力。蛋白质中的所有原子都在不停的运动，原子中的 电子也绕着核不停的运动。因此，一些原子的正负电荷会有瞬时的偏移，形成瞬时偶 极。这些瞬时偶极之间也能发生一些相互作用，称为范德华力。范德华力一般比较弱， 而且只在很短的距离内起作用，但是由于蛋白质分子内的原子数目非常之多，这种力 也是不能忽视的。 d 疏水相互作用。组成蛋白质的2 0 种氨基酸各自带有不同性质的侧链基团。这 些基团有些是极性的，有些是非极性的。在水溶液中，非极性的疏水基团有一种自然 的避开水分子的趋势，从而相互聚集在一起，隐藏在蛋白质分子内部或非极性区。 e 二硫键。二硫键是一种共价键。多数蛋白质具有二硫键，它是蛋白质分子中的 两个半胱氨酸的巯基氧化形成的一种共价键( s s ) ，使两条独立的肽链交织起来或 者使一条肽链形成特定的环状结构。二硫键的形成使蛋白质的肽链的空间结构更为紧 密，对蛋白质结构的稳定性起了重要的作用。 总之，蛋白质空间结构是以上所描述的蛋白质分子内各基团以及与周围大量水分 子之间的众多相互作用共同协作的结果。这些相互作用叠加在一起成为形成和稳定蛋 白质空间结构不可忽视的作用力。理解这些作用力的性质对于研究蛋白质的结构和功 能意义十分重大。 1 3 1 4 鸡蛋白溶菌酶介绍 溶菌酶是由弗莱明在1 9 2 2 年发现的【4 6 】。它是一种有效的抗菌剂，全称为1 ，4 - b - n 溶菌酶，又称为粘肽n 一乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断肽聚糖中n - 乙酰葡萄糖胺和 n - 乙酰胞壁酸之间的p 一1 ，4 糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作 用下细胞胀裂开，引起细菌裂解【4 7 】。人和动物的细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶 菌酶对人体细胞无毒性作用。溶菌酶广泛存在于动植物和微生物体内，在动物体内主 要存在于唾液、组织液、和鸡蛋清中。在蛋清中溶菌酶约占总蛋白的3 4 3 5 ，是 目前溶菌酶制剂的主要来源。溶菌酶是一种小分子碱性蛋白，长期以来一直被作为一 种“模型”体系，用于研究蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫 间的关系 4 8 1o 溶菌酶可分为三型：c 型( 鸡卵清溶菌酶，c h i c k e n e g g - w h i t e l y s o z y m e c l y ) 、 g 型( 鹅卵清溶菌酶，g o o s ee g g w h i t el y s o z y m e ，g l y ) 、噬菌体溶菌酶【例。鸡蛋白溶菌 酶属于c 型，它是一种小的单体球蛋白，由1 2 9 个氨基酸组成，含有6 个色氨酸( 2 8 ， 6 2 ，6 3 ，9 8 ，1 1 1 和1 2 3 位) 和4 个二硫键( 在6 - 1 2 7 ，3 0 1 1 5 ，6 4 8 0 和7 6 9 4 位之间) ， 活性部位的氨基酸残基为3 5 位谷氨酸3 5 和5 2 位天冬氨酸5 2 【2 5 】。它是蛋白质去折叠和 1 绪论 折叠研究的良好模型蛋白。图i - 3 是天然鸡蛋白溶菌酶的构象图。 图l - 3 鸡蛋白溶菌酶的构雾圈 1 3 2 蛋白质的变性和折叠、复性 1 3 2 1 蛋白质的变性 在体外，许多蛋白质都能在合适的条件下，从完全伸展的肽链自发的调整成具有 生物活性的天然构象。蛋白质的变性( d e n a t u r a t i o n ) 是指在变性因素( 如热、紫外线 照射、有机溶剂、胍、脲、酸、碱等) 作用下，天然蛋白质分子的二、三、四级结构 被破坏，从而生物活性丧失、溶解度降低、不对称性增高以及其他的物理化学常数发 生改变f 5 ”，但变性不涉及共价键( 肽链和二硫键等) 的破裂，一级结构保持完好。这 样的失去生物活性的结构态称为蛋白质的变性态。蛋白质变性态有着复杂的结构特 征，它取决于产生变性的具体因素【5 “。一般地说，变性态一般是一种相对折叠态较为 松散的结构形态。图1 - 4 表示了蛋白质从折叠状态变为变性态的过程【5 3 1 。早在7 0 多 年前，我国著名生物学家吴宪教授就提出了第一个蛋白质变性理论，即“天然蛋白质 分子，因环境种种之关系，从有序而坚密之构造( 即天然态) ，变为无序而散漫之构 造( 即去折叠态) ，是为变性( 郎去折叠) 作用”。作为从分子水平上阐明生命奥秘的 中心课题之一，蛋白质去折叠的研究从此受到了生物化学、生物物理学和结构生物学 领域研究工作者的关注。 1 绪论 图l - 4 蛋白质折叠过程示意图 在生物学中，表征蛋白变性及其分子构象变化的方法很多，( 1 ) 溶液流体学性质 的测定( 包括粘度、动力学光散射、电泳等) ；( 2 ) 生物活性的测定；( 3 ) 回旋半径 的变化( 光散射) ：( 4 ) 旋光性( 测定二级结构的变化) ；( 5 ) 紫外和荧光( 测定色氨 酸环境的变化) ；( 6 ) n m r ( 测定一定h 原子化学环境的变化) ：( 7 ) 荧光能量传递 ( 测定多肽链中的两个特征位点的距离) 。各种方法均可从不同侧面来表征蛋白质的 变性程度和分子构象的变化。 1 32 2 蛋白质的折叠、复性 蛋白质的复性( r e n a t u r a t i o n ) 是指除去变性因素后，在合适的条件下变性蛋白分 子重新恢复其天然结构以及生物活性的过程。正如蛋白质结构具有分层结构的特征， 蛋白质折叠复性也常常表现为分级进行的现象( 或许正是结构层次性的存在直接导致 了动力学过程的分步进行) 。在折叠过程中，蛋白质通常从松散的线团状的变性态 ( c o i ls t a t e s ) 出发，在倾向于折叠态的环境偏置的驱动下，首先聚集成为一团比较 紧密的结构状态，这种状态通常具有一个由二级结构成分堆积成的核心，外围则是较 为松散而缺少组织的结构形态。氨基酸的侧链间的相互位置也没有调整到十分适当的 位置，就像一个表面“熔化”的球体，被称为“熔球态”( m o l t e ng l o b u l es t a t e m gs t a t e s ) ”4 。5 6 j ；然后再通过对侧链等精细结构的一些相对慢速的调整，实现多肽链的完整折叠。 由于肽链成分的复杂性，肽链在折叠过程中可能在不同的位点同时形成若干个结构核 心，通过它们相互碰撞而结合形成更大的结构单位，最终形成稳定的自然结构。一 些蛋白质还拥有更多的中间稳定状态，这些中间态的多少及在折叠路径中的分布为折 叠过程带来丰富的复杂性，对于折叠过程的具体机制和快慢有着十分重要的影响。 i 绪论 1 4 本文研究的内容 本研究的主要内容是以特征蛋白鸡蛋白溶菌酶作为研究对象，盐酸胍作为变性 剂，并选择和对溶菌酶同时进行复性和分离的高效液相色谱相同的条件，在不同盐酸 胍浓度变性的条件下，通过m i c r od s c i i i 微热量计测量溶菌酶的总的热效应a h i s 并 计算出相应的a a h i s 。建立了一套测定蛋白在液侗界面上折叠的热效应和自由能的量 热方法。它的贡献是可以用于探索当今国际学术界关于蛋白在液固界面折叠的路经 上，是否存在能垒或低能量的中间态等至今悬而未决的问题。 通过摇床法测定溶菌酶在不同条件下的吸附等温线，讨论了溶菌酶的吸附平衡时 间、吸附量，并依据s d m a 模型及其热力学，计算了吸附折叠过程中的能量变化，得 到了重要的结果。 利用双光束紫外分光光度计及圆二色c d 光谱仪，对不同浓度盐酸胍变性的溶菌 酶水溶液进行扫描测定，以研究变性程度不同时，溶菌酶的二级和三级结构有何变化。 以加深对溶菌酶折叠、复性过程的理解，并给出相关的证据。 2 理论部分 2 理论部分 2 1 蛋白质折叠和量热研究中的理论问题 2 1 1 蛋白质折叠的物理问题 蛋白质怎样折叠? 人们获得或合成了一定成分、一定序列的肽链( 一级结构) 后， 它将通过折叠形成怎样的三维结构( 高级结构) ? 这个问题的解决，将不仅使人们更 为方便地了解生物体中各种蛋白质是如何实现和发挥它们的功能，而且可以大大