（植物病理学专业论文）马铃薯卷叶病毒的分子鉴定与检测技术.pdf

福建农林大学预士学位论文 摘要 马铃薯卷叶病毒是马铃薯上最重要的病毒病之一，严重地威 胁着马铃薯的生产。根据已有的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白( p o t a t o l e a f r o l lv i r u sc o a tp r o t e i n ，p l r vc p ) 基因序列( 6 2 7 b p ) 设计合 成了一对特异性引物，用反转录聚合酶链式反应( r e v e r s e t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r t - p c r ) 的方法和酶联免 疫吸附反应e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 的方 法检测到了马铃薯卷叶病毒。以带毒植物总r n a 为模板，通过反 转录聚合酶链式反应扩增得到长o 6 2 k b 的目的片段，通过克隆载 体p g e m t 将目的片段转入大肠杆菌( e c o l i ) d h 5a 菌株上，构 建了p l r vc p 基因的克隆载体，并进行了测序。已经将测序所得 到的序列登陆了n c b i ( g e n b a n k 登录号为a y 0 7 9 2 1 0 ) 。将序列测定 结果与其他p l r v 分离物c p 基因序列进行比较，发现核苷酸同 源性可达9 6 以上，氨基酸序列同源性可达9 7 左右，证明成功 地得到了p l r vc p 基因。对p l r vc p 氨基酸序列与其不同分离 物问进行的分子差异分析表明，p l r v 不同分离物间c p 氨基酸序 列差异不太明显，同源性在9 6 9 8 之间。依据p l r vc p 氨基 酸序列同源性建立了p l r v 系统进化树并对p l r v 不同分离物进 行了类型分析。 双酶切克隆载体的重组质粒p r c p 并回收目的片段，将所得目 的片段连接到表达载体p g e x 2 t 上。通过热激法将该表达载体转 化入大肠杆菌。构建了p l r vc p 基因的表达载体，摸索了一些 p l r vc p 基因的不能够表达的条件。 利用合成的p l r v 病毒特异性引物建立了p l r v 的常规 r t p c r 检测技术和核酸斑点杂交技术( n u c l e i ca c i ds p o t h y b r i d i z a t i o n ，n a s h ) ，并以n a s h 为重点，改进了n a s h 的检测 技术。与原来的检测方法相比，改进后的方法更为实用：不但大 大地缩短了检测所需要的时间，而且改进后检测方法的灵敏度也 与常规方法的灵敏度基本相同。 福建农林大学硕士学位论文 依据对上述病毒检测技术的研究结果，设计组装了马铃薯病 毒的一步r t ，p c r 检测试剂盒和核酸斑点杂交检测试剂盒，实际应 用结果表明：这些试剂盒具有稳定性强、灵敏度高、特异性好的 优点。 关键词：外壳蛋白，克隆，分子鉴定，检测技术，p l r v ，检测试 剂盒 福建农林大学硕士学位论文 a b s t r a c t p l r vi so n eo f t h em o s ti m p o r t a n tv i r u s e s ，a n dw i t ht h es p e c i f i c p r i m e r sw h i c h w e r ed e s i g n e db a s e do nt h eg i v e np o t a t ol e a f r o l lv i r u s c o a tp r o t e i n ( p l r vc p ) g e n e s e q u e n c e ( 6 2 7 b p ) ，p l r vi sd e t e c t e db y r e v e r et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) a n d e n z y m ee n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) p l r vc p g e n es e q u e n c ei sa m p l i f i e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e m s ec h a i n r e a c t i o n ，u s i n gt h et o t a lr n ao f t h ep l a n ti n f e c t e db yp l r v t h eg e n e i sc l o n e di n t oec o l i d h 5aa n ds e q u e n c e d t h e s e q u e n c ei s c o m p a r e dw i t ht h es e q u e n c eo f t h eh o m o l o g o u sg e n eo f o t h e ri s o l a t e s o f p l r v , t h er e s u l ts h o w sh i g hh o m o l o g yw i t ht h eo t h e ri s o l a t e s ( t h e h i g h e s th o m o l o g yc a nr e a c h9 6 o fn u c l e i ca c i da n d9 8 o fa m i n o a c i d ) a n ds h o w st h ev i r u si sp l r v t h ec pa m i n oa c i ds e q u e n c e so f d i i t e r e n ti s o l a t e so fp l r va r ec o m p a r e d t h er e s u l ts h o w s ：t h e r ei s l i t t l ed i f f e r e n c eo nt h ea m i n oa c i ds e q u e n c ea m o n gt h ep l r vi s o l a t e s t h eh o m o l o g yr a n g e sf r o m9 5 t o9 8 b a s e do nc pa m i n oa c i d s e q u e n c et h ep h y l o g e n i ct r e eo fp l r vi se s t a b l i s h e da n dt h ei s o l a t e s a r ec l u s t e r e di n t om a n yg r o u p s t h ee x p r e s s i o nv e c t o ro fp l r vc pg e n ei sc o n s t r u c t e di nec o l l d h 5d s u c c e s s f u l l y b ym a n yt e s t s ，f o u n ds o m ec o n d i t i o n st h a tc a n t e x p r e s sp l r v c p g e n ei ne c o l i d h 5aa n db l 2 1 s i m p l e ，q u i c k ，s e n s i t i v e ，r e l i a b l em o l e c u l a rd e t e c t i o nt e c h n i q u e s o fp l r va r er e p o r t e di nt h ea r t i c l e ：o n e s t e pr t p c r a n dn u c l e i c a c i ds p o th y b r i d i z a t i o n ( n a s h ) t h ei m p r o v e dn u c l e i ca c i d s p o t h y b r i d i z a t i o ni ss i m p l e ra n dq u i c k e rt h a nt h er o u t i n en u c l e i ca c i ds p o t h y b r i d i z a t i o n b u tt h es e n s i t i v i t yo fi m p r o v e dn a s h i sa ss a m ea st h e r o u t i n en a s h s t h ei m p r o v e dn a s hd e t e c t i o nm e t h o do fp l r v o n l yn e e d s4 5h o u r sw h i l et h er o u t i n eo n en e e d sa b o u t2 0 h o u r s i ti s m o r es a m p l e ra n dq u i c k e ra n di ss a m es u i t a b l ef o rt h ed e t e c t i o no fa 3 福建农林大学硕士学位论文 4 g r e a tn u m b e ro fs a m p l e s b a s e do nt h ed e t e c t i o nm e t h o d so fp l r v , n a s hd e t e e t i o nk i t a n do n e s t e pr t - p c rd e t e c t i o nk i ta r ee s t a b l i s h e d t h er e s u l to f u s a g e o f t h ek i t ss h o w ：t h e yh a v eh i g hs t a b i l i t y , s e n s i t i v i t ya n ds p e c i a l i t y k e y w o r d s ：c o a tp r o t e i n ，c l o n e ，m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n ，d e t e c t i o n m e t h o d ，p l r v ，d e t e c t i o nk i t 福建农林火学硕士学位论文 5 1 前言 1 i 马铃薯的经济价值及其种植 马铃薯是一种重要的经济作物，既可以作为人类的消费品，动物饲料，也可以作 为酿酒和提取淀粉的原料等 人类对马铃薯的种植开始于南美i i ，公元1 5 1 0 年引入到西班牙以后逐渐被欧 洲各国所种植。1 7 世纪，马铃薯成了爱尔兰等一些欧洲国家的主要食品当1 8 4 5 1 8 4 6 年马铃薯晚疫病在欧洲大爆发的时候，对马铃薯的这种依赖导致了数十万人的饥饿死 亡和人世移氏的产生。 随着全球经济的发展，马铃薯在各国经济中所占的地位也越来越重要据联合国 粮农组织( f o o da n da g r i c u l t u r eo r g a n i z a t i o no ft h eu n i t e dn a t i o n s 。f a o ) 统 计，目前马铃薯是世界上仅次于小麦、水稻和玉米的第叫种主要农作物就单位面积 出产的干物质而言，它高于小麦、大麦和玉米：就单位面积f l 产的蛋白质而言，分别 为小麦、水稻和玉米的2 0 2 、i 3 3 和1 2 0 倍。 目前世界上有1 0 0 多个种植马铃薯的国家，总裁培面积多达2 0 0 0 多万公顷现 在，无论是在发达国家还足在发展中国家，人们对马铃薯的消费需求帮越来越大。这 种需求的增加，反过来也导致了马铃薯生产的快速增长f a o 和国际马铃薯中心( t h e i n t e r n a t i o n a lp o t a t o c e n t e r c i p ) 的报告表明，过去3 0 年发耀中国家的马铃薯生产的增 k 比其他粮食作物的增长都快。在过去2 0 年问，发展中国家的马铃薯生产几乎翻了一 番，平均年增长3 6 据国际食品政策中心( i f i ： r i ) 估计，在来来2 0 年中发展中 国家对于食品的需求量将增长4 0 对马铃薯的需求将更多通过对中国农业统计年 鉴的资料分析，1 9 8 2 2 0 0 0 年近2 0 年来我国马铃薯种植面积与产量变化也反映了这一 趋势。2 0 0 4 年3 月在云南昆明召开的第五届世界马铃薯大会上专家们估计中国的马 铃薯总产量将呈现持续上升势头在来来6 年内，中国的马铃薯生产将以年平均5 左 右的速度递增中国农科院所做的调查显示，与栽培同样面积的小麦、玉米、水稻、 大豆相比农民栽培马锋薯所得收益最高广东省惠州市的实践也证明种植马铃薯 具有根好的经济敛益和社会效益，是农民增收致富的一条有效途径过去几年中，中 国水稻、小麦、玉米的种植面积都在不断减少，只有马铃薯种植面积年均增k 约4 5 f a o 统计表明，2 0 0 3 年中国马锋薯种植面积逾4 5 0 多万公顷。产量6 6 8 0 多万吨，居世 界前列 福建农林大学硕上学位论文 6 1 2 马铃薯病毒与马铃薯病毒性痛害 髓着马铃薯生产的快速增长，对马铃薯病害的防治，也提出了越来越高的要求。在 马铃薯的病害q 1 ，马铃薯的病毒性病害是一个重要的部分。马铃薯病毒性病害，不仅严 重威胁着马铃薯的产量，还降低了马铃薯的品质，使得马铃薯的利用价值大大降低据 统计每年由于病毒病的危害，全世界的粮食损失为2 0 0 亿美元我国检疫部门的资料 也表明我国每年由于病毒病造成的损失达几亿元 马铃薯病毒病是人类最早发现的病毒病害之一。自从1 6 世纪欧洲开始种植马铃薯 以来人们就注意到了病毒病对马铃薯的影响卷叶与皱缩和低产总是相关，认为是连 续的无性繁殖所致，这种不正常现象也称为“退化”1 7 7 8 年，a n d e r s o n 等指出马铃 薯“退化病”的侵染性明确了病毒在马铃薯“退化病”巾所起的土导作几】据报道可 侵染马铃薯的病毒有2 2 种，类病毒1 种( 名称与缩写见表1 1 ) ( h o o k e r ，1 9 9 2 ) 以 马铃薯命名的病毒就多达1 5 种( 谢联辉等，1 9 9 9 ) 危害严重的有p l r v 、p y y 、p v x 、 p v a 、p v s 、p v m 等几种，p s t v d 在我国北方危害严重 根据报道f i 前在我国马铃薯上已发现的病毒有：a m v ( 张鹤龄1 9 7 9 ) 、p s t v d ( 李 芝芳等，1 9 7 9 ) 、p v x 、p v y ( 张鹤龄等，1 9 8 3a ) 、p l r v ( 张鹤龄等1 9 8 4b ) 、p v s ( 张 鹤龄等，1 9 8 4a ) 、p v m 、p v a ( 崔荣昌等，1 9 8 9 ) 、t r v 、t n v ( 王人元1 9 8 9 ) 等1 0 种 其中研究报道最多、展深入的是p v y 、p v x 和p l r v 表1 1 可侵染马铃薯的病毒 t a b l e1 1t h ev i r u s e sw h i c hc a ni n f e c tp o t a t o ( h o o k e r ，1 9 9 2 ) 福建农林大学硕士学位论文 7 1 _ 3 马铃薯主要病毒及其危害简介 1 3 1 马铃薯y 病毒 p w 属于马铃薯y 病毒属( p o t y v i r u s ) ( 谢联辉，1 9 9 9 ) ，病毒粒体是弯曲的线条状 大小为7 3 0 1 l n m p v y 的基因纽为+ s s r n 。基因纽全长9 7 k b ，5 - 末端序列结含一个 基因组结台蛋白( v p g ) ，3 - 末端具有p o l y ( a ) 尾巴结构( h a r i ，1 9 8 1 ：s l a we t 日 1 9 8 5 ：r i e c h m a n ne t 日1 9 8 9 ；m u r p h ye ta 1 。1 9 9 0 ：t a k a h a s h ie t 日 ，1 9 9 7 ) 5 _ 末端1 e 编码区( u t r ) 具有转录增强予功能，同时也是其不具有5 _ 帽子结构的翻译 模式所必须的( n i e p e le ta 1 ，1 9 9 9 ) 整个病毒r n a 基冈纽包含一个长而单一的开放 阅读框( o r f ) 。可直接表达产生一个3 4 0 2 6 8 k d a 的多聚蛋白前体，以后再切割成小的 成熟蛋白。从n 一端到c - 端分别为p l 、h c p r o 、p 3 、6 k i 、c i 、6 k 2 、n i a - v p g 、n i a - p r o 、 n i b 和c p ，其中c p 是唯一的一个结构蛋白其基因组结构及表达策略与豇豆花叶病毒 属( c o v i r u s ) 、线虫传多面体病毒届( # e p o v i r u s ) 和动物病毒中的小核糖核聩病毒 属( p j c o r n a v l r u s ) 非常相似，均具有一个编码r n a 复制相关蛋白璀闻，r 口保守性很高 多聚蛋白的裂解主要通过三个具有噩白酶活性的p 1 、h c - p z o 、和n i a p r o 的协调作用来 完成p 1 、h c - p r o 分别催化p 1 h c p r o 和h c _ p r o p 3 间的裂解( v e r c h o te td ，1 9 9 1 ) ， 其他蛋白的裂解均由n i a - p r o 催化( c a r r i n g t o ne ta ，1 9 8 7 ) 。序列分析结果表叫基 因纽较保守的区域包括c p 核心区域、t i c - p r o 和n i b 基1 乩变异区土要为c p 的n 一末端、 福建农林大学硕士学位论文 8 p 1 和p 3 基因( a 1 e m a n - v e r d a g u e re ta 1 ，1 9 9 7 ) p v y 在世界各马铃薯种植区均有广泛分布，足危害马铃薯生产的最重要病毒之一 在自然条件下以蚜虫传播为主介体蚜虫主要有棉蚜( a p h i sg o s s y p y i ) 、桃蚜( m y z u s p e r s l c a e ) 等，以非持久性方式传毒该病毒可侵染3 4 个属1 6 3 个种以上植物，其中 对茄科、藜科和豆科植物的危害最为严重一般蚜虫在获毒2 个小时后就会丧失传毒能 力，感染p v l 的马铃薯表现出的症状随感染p v y 的株系( 普通株系p v r 和坏死株系p v y l ) 、 天气状况和感染类型的不同而备异就p v r 来说，在韧侵染后，会在下部n | 片和n f 脉卜 出现黑色坏死斑点叶片变得干燥而易碎也会在茎部产生畸形皱缩的症状发生再侵 染的植株会产生更叨显的症状，这些症状可以分为皱缩、杂斑和托n l3 种类型有关p v y 的图片见附录1 的图1 至图4 1 3 2 马铃薯卷叶病毒 p l r v 是马铃薯卷叶病毒属( p o l e r o v i r u s ) 的代表种( 谢联辉，1 9 9 9 ) 以前将其划 为黄症躺毒属( l u t e o v i r u s ) ( m a t t h e w s ，1 9 8 2 ；m u r p h ye ta 1 ，1 9 9 5 ) ，病毒粒体球 状，等轴对称直径约为2 4 r i m p l r v 基因组为+ s s r n 分子量2 xl o d a 基因组全长 5 8 8 2 b p ，具有6 个o r f s ，3 - 末端没有p o l y ( a ) 结构，只有一个7k d a 的基因组结合蛋 白( s t a r c i c he ta l ，1 9 8 6 ) 基因组具有3 个非编码区( u t r ) t5 i 末端u t r6 9 7 0 h p ， j # 中5 - 2 0 b p 严格保守，可能与病毒转录翻译有关( k e e s ee ta j 1 9 9 0 ) ；3 _ 末端i j t r 1 4 1 b p ；在o r f 2 b 和o r f 3 之问存在1 9 7 b p 的基因问隔区，将整个基因组分成两个编码区。 其中复制酶幕因由第三个阅读框架o r f 2 b 编码伞长约1 8 k b 编码一个6 9 k d a 的多肽 ( m a ye ta 1 ，1 9 8 9 ；v a nd e rw i l ke ta l 1 9 8 9 ：张鹤龄。1 9 9 6 ) p l r v 是马铃薯上最重要的橱毒炳窖之一广泛分布于世界各马铃薯种植区( s m i t h 1 9 5 7 ) p i r v 由某些蚜虫传播，其中桃蚜( m y z u s p e r s i c a e ) 是传播p l r v 的最主要介体 蚜虫一旦从病株获毒，将终生传毒为持久性方式传毒患病植株表现m 米的症状，依 赖于感染的类型( 初侵染和再侵染) 初侵染植株的顶部叶片有轻微的卷i f f l 井呈黄色， 有时在叶片边缘有紫色色素沉着现象但对于再侵染的植株，其下部n l 。片会有轻微卷| i l l 并变硬有时叶片边缘呈紫红色，同时植株的生长习性变得直立节问缩短植株颜色发 黄并矮化。种薯和子代的块茎都较小，某些品种的薯块在切开后能够发现内部有坏死 的蝌状纹有关p l r v 的图j l 见附录1 的图5 至豳7 1 3 3 马铃薯x 病毒 p v x 是马铃薯x 病毒属( p o t e x v i r u s ) 的典型成员( 谢联辉1 9 9 9 ) ，病礴粒体为弯 福建农林大学硕士学位论文 9 曲的线状。太小为5 1 5 1 3 n m 。病毒基因纽为线状+ s s r n a ，6 4 k b ，5 - 末端具有帽 子结构，3 乙末端具有p o l y ( a ) 尾整个基因组包古5 个o r f s o r f i 编码聚合酶，位于 基因纽的5 乙端，古有复制酶活性位点基序y ( g m ) 叩和解旋酶h i p 一结台位点g x x g x g k s ( d a v e n p o r te ta 1 ，1 9 9 7 ) o r f 5 为c p 基因位于3 - 末端两者之间为三联基因模 块( t g b ) ，其产物分别为2 5 k d a 蛋白、1 2 k d a 蛋白和8 k d a 蛋白，它们与病毒的细胞问运 动相关( a n g e l le fa 上1 9 9 6 ，h e f f e r o ne ta 1 ，1 9 9 7 ，k a l i n i n ae ta ，1 9 9 6 ) p v x 是马铃薯上一种重要的病毒，可以通过汁液传播，导致p v x 在作物上传播的主 要原因就是在作物上造成微小创伤风、机械、农事操作等都可以传播p v x 在生长后 期，昆虫造成的微伤口足感染p v x 的主要原因感染后的马铃薯通常表现出花叶症状 初侵染的马铃薯在植株上几乎不表现任何症状，但花叶症状在发生蒋侵染的植株上表现 的就比较明显：n | 予没有变形，花叶症状被局限在叶脉之问。这种症状在马铃薯生长阶 段和在微弱阳光的条件下尤为明显有关p v x 的图片见附录1 的图8 至图1 2 1 3 4 马铃薯s 病毒 p v s 属于香石竹潜隐病毒屈( c a r l a v l r u s ) 。病毒粒予为线状。大小为6 4 0 xi o n m p v s 的病毒基因组为线状十s s r n ，睦7 4 k b ( p y s ) ( z a v r i e ve ta 1 。1 9 9 1 ：c a v i l e e r p ra 1 ，1 9 9 4 ) 。3 _ 末端具有p o l y ( a ) 尾巴结构5 _ 末端具有帽子结构，共包含6 个 o r f s 其中o r f i 编码2 2 1 k d a 的病毒复制酶，o r f 2 、o r f 3 、o r f 4 组成三基因模块( t g b ) ， 分别编码2 5 2 6 k d a ( t g b i ) 、1 1 - 1 2 k d a ( t 6 8 2 ) 、7 - 8 k d a ( t g b 3 ) 的蛋白，它们与病毒细 胞问运动有关o r f 5 编码3 2 3 6 k d a 的外壳蛋白，o r f 6 编码一个1 1 1 6 k d a 的功能米知 的蛋白，可能与寄主基因转录或病毒r n a 复制相关( f o s t e ra n d 毗1 l s ，1 9 9 2 ) 。 侵染马铃薯的p v s 有两大叫址不1 州的株系t 普通株系( p v s o ) 和a n d e a n 株系( p v s a ) p v s o 在欧洲( 德国、波兰和中欧) 流行较广，而p v s 则是一种严格的检疫对象p v s 很 容易通过接触、工具等传播，蚜虫也可以以1 f 持久性方式传播p v s ，最常见的传插p v s 的蚜虫是鼠李马铃薯蚜( a p h i sn a s t u r t i i ) 和桃蚜( m y z u sp e r s i c a e ) 。根据不同的 马铃薯品种和侵染株系，p v s 在马铃薯上表现出微弱但不同的症状：在上部叶片的叶脉 问的变形使得上部叶片显得车i 1 糙、上部叶片变小和d , n 1 4 的生艮疗向向下( 逆着n l 柄的方 向) ，在一些敏感品种上，叶片的颜色呈现锈铜色，叶j l 上 】 现坏死斑点和植株矮小。 有关p v s 的图j l 见附录1 的图1 3 。 1 3 5 马铃薯m 病毒 p v l 4 与p v s 同属于香石竹潜隐病毒属( c a r l a v i r u s ) 病毒粒予为线状，大小为 祸建农林大学硕士学位论文 6 4 0 l o n m 。病毒基因组为线状+ s s r n ，长8 5 k b ( p v m ) j e 结构与p v s 相似 p v m 是通过蚜虫通过非持久性传播方式传播的它的寄主是茄科和豆科的作物。p v m 在马铃薯上的显著症状足病叶卷曲形成匙状( 它与马铃薯感染p l r v 症状的区别足感 染p l r v 的马铃薯叶子弯曲成简状) 这种症状通常出现在生长阶段的作物上，特别是项 部的叶片。另外，发痫马铃薯上部叶子的叶脉通常也会有轻微的变色，n i 的边缘卷曲和 花叶等症状。这些症状在凉爽和多云的天气状况下更为明址有关p v m 的图片见附录l 的图“和图1 5 1 3 6 马铃薯 病毒 p v a 与p v y 同属于马铃薯yj i i i 毒属( p o t y v i r u s ) 病毒粒予为线形，火小是7 3 0 1 5 n m 。病毒的基因组为+ s s r n a 大小与结构都和p v y 相似 p v a 也是由蚜虫传播的，其传播方式为非持久性传播方式蚜虫在获毒后的传插能 力只有卜2 个小时实际上，p v a 也只有通过蚜虫才能传播。感染p v a 的马锋薯在不同 的品种上和不同的天气条件下表现出不同的症状。在感染的当年，天气阴暗时，可以看 到轻微而短暂的花叶症状，这些花叶的症状看起来象是叶片上的污点当在被观察的叶 片下放一张白纸时，这种效果就更为明显柞感染的第二年症状会变得非常叨显。在 透明状的叶片上产生压纹，并且根据马铃薯品种的不同产生或多或少的明显花n 1 。如果 与p v x 或p v x 发生联台侵染时，症状就更为明显p v a 产生的症状强烈依靠天气状况( 凉 爽和光线暗时易见) 、病毒的株系和马铃薯的品种有关p v a 的图片见附录i 的图1 6 、 | 璺i1 7 i 3 7 马铃薯y 病毒坏死抹系块茎坏死种 马铃薯y 病毒坏死株系块茎坏死亚种( p v y n t n ) 是导致马铃薯块茎坏死环斑病韵病 原隶属于p v y “和p v y 一样，p v y n t n 的传插也是经种传播和经多种蚜虫传播马铃薯 块茎坏死病在多数欧洲国家普遍发生，并且在中欧和地中海附近的温带气候国家广为流 行。p v y n t n 侵染马铃薯后，会在易感品种的叶片上产生与p v r 相似的花叶和皱缩症状 在侵染发生的当年，在马铃薯上部叶片上或叶脉上可以坏死斑点的症状不同部位的坏 死斑形状并异：叶柄和叶1 ：的橡州状坏死和黄化n ti ：的绿环和爿；舰则形状这种粕毒 在马铃薯上的母有特点的症状表现的马铃薯的薯块上，在薯块上形成或多或少深褐色的 弓形或圆环状坏死带，这些坏死组织并不仅仅局限在薯块的表皮一1 - 。会症状的加重而破 裂。有关p v y n t n 的图片见附录i 的图1 8 至图2 1 1 3 8 烟草脆裂病毒 福建农林大学硕士学位论文 t r v 属于烟草脆裂病毒属( t o b r a v i r u s ) ，病毒粒予为杆状，大小为1 8 0 2 1 5 2 3 n m 和4 5 2 2 n m t r v 通过毛刺属( t r i c h o d o r u s ) 与拟毛刺属( p a r a t r i c h o d o r u s ) 的线虫传播，它可 以侵染近4 0 0 种茄科作物( 马铃薯、烟草、甜菜等) 的种予和苋届等其他作物在感染 的地块中，病毒可以存活多年在马铃薯上，t r v 几乎不会经过种予传播感染大多发 生在移栽时期和种薯运输过程中有几个株系可以在马铃薯的叶予上产生症状：残缺的 叶片小而发黄有时可以看到弓形或带状图案。切开薯块可以看到内部有褐色软木状坏 死，在薯块表面，坏死环通常会形成同心状，但与p m t v 相比这种同心环相对不规则 有时t r v 在马铃薯薯块的表面产生褐也裂缝，但如果把薯块横切会发现这些坏死延续到 暑块内部。在储藏阶段，坏死的程度会进一步发展t r y 在马铃薯上显示症状的明显程 度，与凉爽的天气，空气的湿度，病毒的株系和马铃薯的种类有关有关t r v 的图片见 附录1 的图2 2 和图2 3 i 3 9 马铃薯帚顶病毒 p m t v 足由土壤真菌传插的病毒，传插p m t v 的真菌主要足粉痂菌( s p o n g o s p o r a s u b t e r r a n e a n ) 病毒可以随真菌孢子或病株残余( 茄科，藜科) 在土壤中存活几年 在低温和潮湿的条件下带有p m t v 的游动孢予刺穿马铃薯的根或块茎表皮，从而传播 病毒。感染p m t v 后的马铃薯在叶部和块茎上都会表现出不同的症状下部叶片上会 现嫩黄色的斑点，有时伴有卷曲，上部叶片上形成亮绿色的条带并卷曲典型症状是顶 部n l 片节问缩短，使得顶部叶片显得非常浓密在薯块上“；现一砦同心的环形或线形的 褐色坏死，这些坏死还会没有中断地延续到块茎内部，与t r v 不同的足这些坏死只会局 限在收获期所能够达到的部位在储藏阶段不会进一步发展p l i t v 在马铃薯上症状的发 展，受到温度，品种等因素的影响。在中# 人民共和国进境植物检疫禁止进境物名录上， p m t v 属于检疫对象井从2 0 0 3 1 2 1 起实施了新的行业标准。有关p m t v 的图j l 见附录 i 的图2 4 至图2 6 。 1 3 1 0 马铃薯纺锤块茎类病毒 p s t v d 属于马铃薯纺锤块茎类病毒属( p o s p i v l r o o o ，类病毒粒予为环状或线状，大 小是3 6 0 n t 主要足由接触和农事活动传播，蚜虫也可以传播，但程度很小p s t v d 烈 性毒株感染的马铃薯植株的症状在叶子上的表现为p l 色浓绿扣曲成匙状马铃薯的块 茎呈现纺锤状造成大量的减产。有关p s t v d 的图片见附录1 的图2 7 和图2 8 1 4 马铃薯病毒的检测方法及其原理 福建农林大学硕士学位论文 1 2 对马铃薯稿毒的检测基奉上可以分为生物学实验方法( 指示植物法) 、也镜技术方 法、血清学方法和病毒核酸分子检测方法几大类如图1 1 所示 1 4 1 生物学实验方法 1 4 1 i 生物学实验方法的原理和特点 生物学实验方法也i 叫指示植物法，它的原理是：检测病毒赴其鉴别寄主上产生稳定 并具有特征性的症状或在其指示植物上快速出现感染症状，从而可以用来检测山某种病 毒或检测出某种病毒的存在。在植物病毒的检测上，生物学实验的方法足t 他方法所不 可替代的 生物学实验方法的优点足简单易行，反应灵敏。只需要很少的毒源材料但足工作 量比较大，需要较大的温室种植植物，并且比较费时有的时候会冈为气候或栽培的原 冈，个别症状反庶难以重复。 图11 马镎薯病毒检测方法示意图 f i g u r e1 1t h es k e t c hm a po fp o t a t ov i r u s d e t e c t i o n 福建农林大学硕士学位论文 1 4 1 2 检测马铃薯病毒常用的指示植物 用实验学方法来检测马铃薯上的病毒，常用的鉴别奇主或指示植物和对应的症状如 袁1 2 表1 2 检测一些马铃薯常见病毒的指示植物( 贺睛飞，1 9 9 9 ) t a b l e1 2 s o m ei n d i c a t o rp l a n t so fp o t a t ov i r u s ( i t ep e n g f e i 1 9 9 9 ) u t y n o s a sss isfl s f t 心时烟 l y c o p e r l s c o n sssls|t e s c u e n r u m 番茄 g o m p h r e n a 9 1 0 b o s a 千口红 福建蹙赘大学硕士墨! 垡焦文旦 p h a s e o l u s m l g a r $ s 绿豆 说明：= 无症状，l _ 局部症状，s = 系统症状，底部划线表示的是最敏感的 寄主。 1 4 2 电镜技术方法 1 4 2 1 电镜技术方法的原理 植物病毒粒休的形态和大小是分类的依据之一，尤其是长形病毒。病毒因粒体过于 微小，用光学显微镜不能够观察到。从4 0 年代以来建屯的f u 子显微镜技术经过不断 的改进和提高，已经成为了重要的检测和鉴定技术 电予显微镜的结构类似于光学显徽镜，有光学系统成像放大系统和记录系统组成 电镜阻i b 子柬作为光源，用一定波跃的电子流代替光学镜中的光波。波氏随电子流的速 度而改变，速度越快则波长越短发射电予的装置称为电子枪，由阴拯和舯极组成阴 极为钨丝是发射t b 子流的电予源，电流通过时发热放h 1 电予。m 极为几万伏的正电层， 成为一个强的电场发出的电子流通过一个也场聚焦，这个电磁场被称为磁透镜相当 于光学皿微镜中的玻璃透镜电予柬聚焦后通过样品时，由于样品中各部分的厚度和密 度不同，使得电予产生不同的散射样品薄或密度低时，散射角度小，大部分电子束能 够透过样品，透过样品的i u 予束，经过成像系统的物镜、中问镜和投影镜三级放大投射 到荧光肝f ：产生可见的| f l 了光源，这部分比较亮；而样品比较厚或密度比较大的部分， 因散射角度太大部分电子不能达到荧光屏而形成暗色区域，这样就可以在荧光屏上呈现 黑白对比的样品放火像，可以通过照相设备记录下来成f u 镜照片在镜筒中保持高度真 空状态，以减少气体分子对 也予束的干扰这种【乜予束可以透过样品的电镜，称为透射 电镜，是植物躺毒研究中常用的由于i 也予的穿透力低闪此要求样品必须很薄，祚 福建农林大学硕士学位论文 1 0 一l o o n m 之问。 1 4 2 2 电镜技术常用的方法 i 4 2 2 1 叶浸蘸法 这是最简便的方法又叫叶浸稻法具体操作是在干净的载玻片滴一滴蒸馏水，把 植物组织的新鲜切 j 放在水滴上蔫几次让受伤细胞的内古物质流入水滴中，在表面形 成一层膜用载网的膜面与水滴表面接触，让受伤细胞的内含物质转移到载网的膜面j ：， 然后用i u 镜观察 1 4 2 2 2 负染制片法 这足在6 0 年代发腱起来的一种方法它对从分予水卜上俐l 娜冉毒的超微结构起了 很大作用，现在是一种普遍应用的主要方法 其基本原理是用重金届盐类染色病毒粒体中的核陵。由于重金属盐类对病毒粒体表 面的农壳蛋白不能染色，这样重金属离子在病毒周围的背景处沉积下来，造成很强的电 子散射而形成较暗的背景，样品则容易被电予束穿透形成电了透明颗粒图象为暗背景 上的亮物体，如同照片的底片被称为负片，这种染色方法被称为负染该法受染色方法 和操作技术的影响比较太，但有如下的优点：( i ) 快速简便，半小时内即可制备好，待 镜捡用( 2 ) 可用于各种样本，如j 丑汁液和各种提纯液等( 3 ) 样品用量少。( 4 ) 有较 好的超微结构 1 4 2 2 3 超薄切片法 超薄切片浊足直接检测寄主耋1 1 1 胞中病毒的方法。在i u 镜技术中，它具有不町取代的 作用，对许多生物学科的发展做出了重要的贡献，对植物病毒的细胞病理研究有重要作 用主要应用在两个方面，一是对病毒在细胞内做定位观察，研究病毒与细胞的燕系， 病毒与细胞在侵染、复制、增殖和转移等方面密切栩关：二是用于病毒内含体的研究， 内禽体是重要的细胞病理变化之一，观察内含体的形状及产生部位具有诊断箍定价值。 超薄切片法主要技术环节包括取村、用定、r 脱水、浸透、包埋聚合、切j l 、染色和 观察等步骤。其中切片要用超薄切片机，一般由专业人员操作。掌握制蔷样品标本包埋 块的技术，是这种方法的赫础 i 4 3 以抗体为基础的免疫学检测方法 m 清学方法自2 0 世纪2 0 年代就已经被用于植物病毒的检测。现祚已绎成为了诊断 和鉴定痫礴的基础方法在榆测植物病毒时使向主要m 清学方法主要足以抗休为耩础的 酶联免疫吸附法 福建农林大学硕士学位论文 1 6 1 4 3 i 酶联免疫吸附法 1 4 3 1 1 基本原理 酶联免疫吸附法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 是一种免疫酶技 术它是本世纪7 0 年代在荧光抗体和组织化学基础上发展起来的一种新的免疫测定方 法。足在不影响酶活性和免疫球蛋白的免疫反应条件下，使酶分子和免疫球虽臼分子共 价结合成酶标抗体，酶标记抗体可直接或通过免疫桥与包被在同相支持物上待测定抗原 特异性结合，再通过酶对底物作用产生颜色或电子密度高的可溶性产物，借以显示出抗 体的性质和数量e l i s a 法灵敏度高、特异性强。既能定性又能定量测定抗体或抗原， 而且不需要使用同位素和复杂的设各如电镜、荧光显微镜、计量器等标记的抗体可以 冻千保存携带到基层单位进行病毒鉴定，适合于测定大量样品，且对人体基本无害等优 点( 张鹤龄1 9 8 3b ) e l i s a 常用的支持物是聚苯乙烯塑料管或血凝滴定板测定方法有以下几种方式： 直接法、问接法、竞争法、双抗体夹心法等直接法是将待测样品抗原加入聚苯乙烯板 中，保温洗涤后，附着在壁上的抗原与加入的酶标抗体反应。沈涤后保留与抗原结台的 酶标抗体，弭加入酶的底物既可产生颜色反应，此方法可进行定性和定量测定如先加 入特测样品( 抗原) ，再依次加入第一抗体( 抗病毒单抗) 、第二抗体( 酶标抗体) 、底 物，此方法称为间接e l i s a ( 硼波。1 9 8 7 ) 。竞争法是把酶标记于抗原上测定时，先把抗 体包被于固相支持物上洗涤后加入待测病毒抗原样品同时加入酶标抗原，对照处理 只加入酶标抗原，使之与吸附在同相载体表面的抗体反虑洗涤后加入酶底物使其显色， 根据对照和样品问显色的差剐，定性或定量的测定样品中病毒抗原的蓝固相载体的改 进发展产生了硝酸纤维索膜- e l i s a ( n c m e l i s a ) 法，又称d o t e l i s a ：对操作程序的改 进发展产生了快速e l i s a 法。下面就对d a s e l i s a 、n c l d e l i s a 和快速e l i s a 进行详细 介绍 i 4 3 1 2 双抗体夹心一酶联免疫吸附法 双抗体夹心一e l i s a ( d o u b l e a n t i b o d y s a n d v i c h e l i s a ，d a s - e l i s a ) 法包括6 个 基本步骤：( 1 ) 取病毒抗m 浒，加到酶联板上的小孔中，使抗体分予闸定在板上。形成 一个封闭层。( 2 ) 将植物提取液加到小孔中，如确有病毒粒体存在，就被相麻的抗体同 定( 3 ) 冲洗小孔，除去朱被圃定的成分( 4 ) 。将以麸价键结台有标记酶的另一病毒抗 件制剂加入孔内，如确有病毒粒体存在，后加的抗体能识别j h 同定在抗体层上的抗原并 与之结含稃次冲洗以除去未被同定的抗体( 5 ) 加入酶底物在酶作用下产生颜色反 福建农林火学硕士学位论文 应( 6 ) 报据着色的程度内限观察以判断结果或用酶标仪进行测定( m o r r i s ，1 9 9 2 ) d a s e l i s a 法是我国目前应用盟广的方法。白艳菊等( 2 0 0 0 ) 对该方法进行改进建立了 快