API 串联四极杆质谱系统 Analyst 软件应用培训教程_3Q.pdf

Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程软件应用培训教程 API 串联四极杆质谱系统串联四极杆质谱系统 美国应用生物系统中国公司美国应用生物系统中国公司 技术服务部技术服务部 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 关于本教程的说明 关于本教程的说明 本教程为应用生物系统中国公司为在中国使用的客户培训的辅助材料 本教程仅提供给经过应用生物系统中国公司培训合格的操作人员使用 本教程内容仅限于串联四极杆系统 Analyst 软件基本操作和应用部分 本教程提供的分析方法仅对用户起参考作用 本教程解释权在美国应用生物系统中国公司 版本号 A Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 目目 录录 第一部分 1 定量分析简明流程 2 成功定量分析应注意的问题 3 定性分析原则与方法 4 LC MS 实验经验与仪器维护常识 第二部分 Analyst 软件操作简介 1 Calculator 功能与使用 2 Library 功能与使用 3 Analyst 其他常用功能 4 部分 Script 功能与使用 第三部分 部分化合物液质分析参考方法和信息 第四部分 附录 1 压力单位转换表 2 元素周期表 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 第一部分第一部分 1 LC MS MS 定量分析简明教程定量分析简明教程 首先确认仪器已经校准 气体 电压工作正常 一 溶液配制一 溶液配制 分别将待分析化合物的标准物质配制成 1 10 ppm 1 10ug ml 的溶液 用 于注射泵连续进样 以优化质谱参数 二 二 Q1 Scan 确定母离子 确定母离子 a 选择或建立 Project 建立一个新项目 Project 点击 Tools Project Creat Project 出现下图对话框 键 入项目名称 点击 Add All 添加项目功能 点击 OK 完成 选择 Project Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 b 硬件配制 激活 MS 主机 如果是 API2000 3200 硬件配置文件中的质 谱主机中应选择 Integrated Syringe Pump c 进入 MS 的 Manual Tuning 界面 并设置注射泵流速 5 10ul min d 选择质谱扫描方式 Q1 Scan 设置扫描范围 应包含待分析的化合物 根 据化合物性质 选择扫描极性 e 手动调节 DP GS1 等参数 使喷雾平稳 待分析化合物信号灵敏度较高 f MCA on 点击 Acquire 采集并存储 20 50 张加和图谱 根据灵敏度 并 保存方法 例如 Q1 dam Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 g 在质谱图区域 点击右键 Open File 打开图谱 局部放大 确定母离 子的质荷比 准确到 0 1amu 如下图 母离子 m z 应为 609 3 二 二 Product Ion Scan 确定子离子 确定子离子 以第一步测得值为母离子 做 Product Ion Scan MS2 手动调节 CE 等参 数 使母 子离子都具有一定强度 一般以母离子的强度占图谱中基峰强度的 1 3 到 1 4 为宜 MCA on 点击 Acquire 采集并存储 20 50 张加和图谱 并保存方法 例如 609 MS2 dam 在质谱图区域 点击右键 Open File 打开图谱 选择 2 个最高的子离子 母离子 基峰离子 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 如上图中 选择 195 397 局部放大 确定子离子的质荷比 准确到 0 1amu 则上面两个子离子为 195 2 397 3 三 三 MRM 优化质谱中与化合物相关的参数 优化质谱中与化合物相关的参数 以前两步选定的母离子 子离子 组成离子对 例如 609 3 195 2 609 3 397 3 等 做 MRM Scan 每个离子对的分析时间 100 或 200ms Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 通过 Edit Ramp 分别优化 Compound 项下的各参数 如 DP EP CE CXP 等 点击 Edit Ramp 选择要优化的参数 点击 OK 出现该参数的优化窗口 可 以根据需要改变该参数的优化范围 Start Stop 和优化步长 Step 不同参数 需逐一优化 然后保存方法 例如 609 MRM dam 同样步骤 优化需要分析的另外化合物 分别保存方法 四 将四 将 MRM 方法转化为液质联用方法方法转化为液质联用方法 关掉所有质谱分析界面 将现有质谱体系灭活 激活液相色谱 质谱设备 单击 Acquire 中 Build Acquire Method 打开上面保存过的 MRM 方法 右键 显示方法左边导引条中第一行 Acquire Method 点击 Add Remove Device Method 添加设备 色谱泵 自动进样器 选中方法左边导引条中第一行 Acquire Method 参数页 设置色谱同步 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 设置色谱参数 分析时间一般为 0 8 1min 流动相组成和流量与实际样品 分析时相同 修改质谱分析时间 Duration 一般设置 0 8 1min 与色谱参数 一致 设置 GS1 GS2 TEM 初始值为 40 40 400 左右 保存方法 例如 LC MRM dam 五 源参数优化五 源参数优化 将上面用过的样品溶液稀释 100 1000 倍 在 Tune 项下 双击 Quantitative Optimization 选择 FIA 分析 根据向导进 行自动优化 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 注意 需要优化的各可选值之间用 分隔 五 色谱条件优化五 色谱条件优化 接好色谱柱 关掉 Tune 在 Acquire 栏下调出上一步优化好的方法 根据色 谱柱规格和待分析体系的复杂程度设置液相色谱分离和质谱分析时间 或编辑洗 脱梯度 保存方法 用新保存的方法平衡色谱柱 平衡时间为 5 10 倍柱体积 色谱柱充分平衡 后 设置 Batch 进样 观察色谱峰形及保留时间是否合适 根据具体情况 调节 流动相 优化色谱条件 用空白提取液配制同样浓度标样 按上面方法进样 观察色谱峰形及保留时 间是否合适 峰高有无变化 有无离子抑制现象 否则调节流动相 进一步优化 色谱条件 注意 注意 等度洗脱 样品之间不需要再平衡色谱柱 若为梯度洗脱 则进下一针样 品前色谱柱一定要充分平衡 六 工作曲线制备六 工作曲线制备 用空白提取液配制一系列不同浓度化合物的混合标样 按上一步方法 设置 Batch 进样 例如 分别稀释浓度为 0 1 g ml 0 2 g ml 0 4 g ml 0 8 g ml 和 1 6 g ml 的混合标准溶液等 根据项目分析要求 有时也可只做单点校正 而不做多点线性 将采集的数据 根据峰面积 做标准曲线 根据检测项目要求 进一步考证方法的最低检测限 重现性 样品提取回收 率等性能参数 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 2 成功定量分析应注意的问题 成功定量分析应注意的问题 一 准备工作一 准备工作 1 查阅文献 2 做好样品前处理 萃取 浓缩 分离 纯化等 3 有条件的可先在 HPLC 上摸好 LC 条件 能够基线分离更好 注意缓冲体系 应符合 MS 的要求 4 溶剂 包括水 的纯度 最好色谱纯以上 5 新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净 某些样品非常容易吸附在进样 阀和管路中 应及时用溶剂清洗 6 质谱仪须校准 预热时间要足够长 气流的稳定也很重要 液氮气阀开度要 注意 达到稳定程度 二 二 MS 条件优化条件优化 先定性后定量先定性后定量 1 首先 根据待分析化合物的性质 确定离子化方式 ESI or APCI POS or NEG 2 用 1 100ppm 的纯样 Q1 SCAN 察看存在哪些离子 要能够看到待测的母离 子 应明显比周围的噪声离子高 通过改变 DP 观察离子的增减 若为 POS 方式 看 M 1 M 18 M 23 等等 初步判断分子离子 如看不到则可能 是浓度太低或离子化方式不合适 或选择的溶剂体系不合适 3 母离子选 M H 或 M H 最好 但有时只有 M NH4 M Na 等 此时 CAD 能量可能需要高些 选择 M H 还是 NH4 Na 等 要由化合物决定 加合离子若稳定 则可用 不稳定则可能需要更换流动相 但 H 的离子通 常好些 所需碰撞能量低 灵敏度高 如含 Cl 可选择 2 个母离子峰 4 SIM 与 MRM 方式的选择 单级 Q 只能 SIM MRM 可看成 2 个 SIM 选择 性更好 5 再根据上一步确定的母离子进行 Product Scan 确保所有碎片离子都来自待 测化合物 而不是溶液中的杂质 找出较强的碎片离子信息 通过改变 CE 从中选定 MRM 需要测定的一对或更多离子对 为最后 LC MS MS 联用做准 备 6 做 Product Scan 时 注意小数点后的位数 MRM 离子对信息输入准确 灵 敏度才会高 7 先多选几个离子对 待出现基质干扰时可换 最后根据法规要求确定离子对 数目 8 MRM 方式优化仪器 通过优化仪器参数 使得母 子离子都达到一定强度 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 水平 使 MRM 灵敏度最高 可先让仪器自动优化参数 然后再手动细致优 化 只检测一对离子时根据 TIC 的强度来确定仪器参数 一次优化多对离子 时 要根据每对离子的 XIC 强度来分别确定仪器参数 9 先用注射泵优化 Compound 项下面的参数 如 DP CE 及 CAD 等 再接通 LC 用 FIA 优化其他参数如温度 气流和 IS 电压及离子源位置 或接一个 三通 样品仍由注射泵进入离子源 同时 LC 保持需要的流量 然后进行 MRM 测定 10 Curtain Gas 在不降低灵敏度情况下尽量大些 温度在达到灵敏度时不用太 高 气流也不用太大 这样可以提高信噪比 保持信号稳定 11 分辨率的选择 当样品较纯 Q3 可选 LOW 提高灵敏度 若选 LOW 后本 底噪声太高则意义不大 三 三 LC 条件优化 条件优化 1 色谱柱长度可根据分离的要求而定 定性可长些 定量在能有效排除干扰情 况下尽量短 提高效率 内径最好选细径柱如 2mm 1mm IS 可不分流 4 6mm 柱用 1ml 流量时如不分流灵敏度还不是最佳 不如流量低时更好 流 速高 峰形好 2 不同牌号色谱柱 效果很可能不同 3 pH 的影响 正离子方式 pH 要低些 负离子方式 pH 要高些 除对离子化有 影响外 还影响 LC 的峰形 以至定量误差 流动相加乙酸铵可适合大部分 测定要求 4 用流动相配制标样 初步优化确定 LC 条件是否合适 5 标准品工作液现配现做 尤其是较低浓度 时间长了可能因吸附分解等降低 6 进样顺序要先稀后浓 7 洗针液要常换 进过浓样后要进一针空白 检验是否有残留污染 8 顺序 纯样 添加样 实际样品 9 流动相配制的标准品溶液优化后 用空白提取液配制标准品再次优化 考察 干扰情况 空白添加再提取后 考察回收率 10 用空白提取液配制标准样品做工作曲线 可以有效排除干扰因素 四 前处理方法的优化四 前处理方法的优化 1 LC MS 都优化过 还是达不到灵敏度要求或无法检测 需要改进提取方法 2 离子抑制 改变前处理方法或 LC 条件 3 内标用法 药代动力学时多采用内标 选择原则 内标物与被测物的化学性 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 质有区别时 要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同 尽量选同系物 还可利用同位素标记的同一化合物作为内标 4 衍生化 有时有助于使信号增强 且稳定 例如硝基呋喃类 衍生化后容易 测定 五 数据处理五 数据处理 1 最低检出限 信噪比 3 1 定量限 10 1 2 同一物质几对离子的比例应相对恒定 误差不超过 15 峰面积 比使用峰高 定量准确 3 当浓度低 信号弱 自动积分不准时 可对峰面积手动积分 4 平滑次数与峰宽因子 保留时间等设置都会影响积分值 5 曲线过零点时 可用 4 个点 不用 则需要 5 个点 6 线性范围太宽 有时意义不大 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 3 定性分析原则与方法 定性分析原则与方法 一 准备工作一 准备工作 1 核对样品名称 编号 2 通过询问样品提供人 查阅文献等 了解样品其他知识 例如熔点 沸点 溶解性等理化性质以及样品来源 合成路线 光谱 波谱数据等 3 可能含有的杂质 样品大致含量 4 样品保存状况 对温度 光是否敏感 5 进行 LC MS 分析前最好大致清楚 LC 条件 使体系得到比较好的分离 流动 相缓冲体系符合 MS 要求 6 色谱柱和管路的清洗 新的色谱柱以及分析过大量样品的色谱柱 可能要先 冲洗很长时间才能干净 某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中 尤其是 采用针泵进样时 应先用空白溶剂充分清洗管路 7 如果原来溶解样品的溶剂不合适 LC MS 分析 此时应用 N2吹干 再用流动 相定量溶解 溶解样品的溶剂一定要和流动相一致 否则得到的谱图不纯 峰形不好 变宽 出怪峰等等 某些固体直接用流动相不溶 可以先加一滴 DMSO 二甲亚砜 再加甲醇或乙腈等稀释 8 进样顺序要先稀后浓 定量溶解 浓度控制在几个 ppm 级 不然易污染系统 造成本底太高影响分析结果 9 浓度非常低的样品不能保存太长时间 容器吸附 分解等原因使样品浓度降 低 样品工作液应现配现做 二 色谱柱的选择 1 选择原则 可长一些 最好能够基线分离 若做不到 可以通过提取离子 XIC 来得到较好的色谱图 内径无要求 粗细均可 但注意应使流动相的流速与 色谱柱的内径相匹配 一般 4 6mm 柱 流速 1ml min 3mm 柱 流速 500ml min 2 1mm 柱 流速 200ml min 1mm 柱 流速 50ul min 左右 2 流动相流量大小 MS 分析前是否需要分流 取决于使用的离子源 一般 API2000 3000 流速高于 600ml min 需要分流 对于 API3200 4000 5000 由于使用 Turbo V 离子源 流速低于 2ml min 的情况 皆不需要分流 3 要对各种厂家的色谱柱有所了解 对于一些特殊的化合物必需使用特殊的色 谱柱进行分离 相关的知识可以向色谱柱供应商索取 大多数著名的色谱柱 厂商都有自己的色谱柱分析数据库 里面可能会有你想要的信息 三 三 LC 条件的优化条件的优化 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 1 LC 梯度的设定 目的是快速分离 峰形好 缩短时间 提高效率 可以将 所有化合物都冲出 防止影响下一个样品的测定 2 采取梯度洗脱 如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱 此时的信号会比等 度洗脱时强很多 而且加大进样量 是提高灵敏度的一种有效措施 但是分 析时间较长 且需要有色谱柱平衡的时间 四 确定离子化方式四 确定离子化方式 1 根据样品性质确定离子化方式 对于高极性的化合物 如 大分子 蛋白质 肽类 低聚核苷酸等生物分子 胺类 季铵盐等 含杂原子化合物如氨基甲 酸酯等 适合 ESI 弱极性 中等极性的小分子 如脂肪酸 邻苯二甲酸等 含杂原子化合物如氨基甲酸酯 脲等 适合 APCI 2 不适合用 ESI 方式的化合物 极端非极性化合物如苯等 不适合用 APCI 方 式的化合物 非挥发性 热稳定性差的样品 3 一般碱性化合物宜用正离子方式 酸性化合物宜用负离子方式 如未知 可 能正负都要做 有些化合物正负都出峰 选择灵敏度高的方式 不明确的优 先用正离子方式试 4 APPI 适合非极性化合物 同 GC MS 有重复 但一般小型台式 GC MS 分 子量范围小 APPI 比 GC MS 可测比较高分子量的化合物 五 初步定性五 初步定性 确定化合物的分子量确定化合物的分子量 1 对于纯样品 首先可采用针泵直接进样 察看存在哪些离子 设置低的 DP 电压可使谱图简单 通过改变 DP 观察离子的增减 M 1 18 23 39 2M 1 等等 初步判断分子量 2 注意要采集一段时间的溶解样品的溶剂本底信息 DP 同实际样品相同 以 便扣除本底干扰 可使用高 低 DP 电压各做一次 例如 20V 80V 等 一 般低流速 FIA 方式最适合 3 注意 当样品溶液内含有强离子抑制物质时 直接进样可能看不到化合物的 分子峰 此时需要经色谱柱分离或重新处理样品 4 选择一种通用的源参数及源位置 以适合样品中大部分化合物的分析 该参 数的确定可按照定量方法中 FIA 优化 通常主要取决于流动相有机溶剂比例 和流速 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 正离子方式常出现如下离子正离子方式常出现如下离子 1 Na 22 Da higher than M H K 38 Da higher than M H Li 6 Da higher than M H NH4 17 Da higher than M H ACN 40 Da higher than M H 2 有时还可能出现 M H2O H 2M H 3M H 2M Na 等 3 有意添加可以帮助确定化合物的分子量 例如有几个峰无法判断分子离子是 哪个 此时加入微量 Li 有可能观察到增加 6 的峰 而通常碎片峰很少加 合 扣除背景后 化合物的信号 610 出现 色谱峰值处的质谱图 平滑处理后的质谱图 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 负离子方式常出现如下离子 负离子方式常出现如下离子 1 TFA 114 Da higher than M H 113 227 为背景离子 2 Acetate 60 Da higher than M H 3 Formic 46 Da higher than M H 4 Cl 36 Da higher than M H LC MS 中常见的本底离子 中常见的本底离子 1 m z 50 150 溶剂离子 H2O nH n 3 112 2 m z 102 H 乙腈 乙酸 C4H7NO2H 102 0549 3 m z 102 三乙胺 C2H5 3NH 102 1283 4 m z 149 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐 C8H4O3H 149 0233 5 m z 288 2ml 离心管产生的特征离子 6 m z 279 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H 279 1591 7 m z 316 2ml 离心管产生的特征离子 8 m z 384 样品瓶光稳定剂产生的离子 9 m z 391 管路中邻苯二甲酸二辛酯 C24H38O4H 391 2843 10 m z 413 邻苯二甲酸二辛酯 钠 C24H38O4Na 413 2668 11 m z 538 乙酸 氧 铁 喷雾管 Fe3O O2CCH3 6 537 8793 同位素离子同位素离子 1 各种元素的同位素 基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中 这对于 利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便 如氯 35 和 37 溴 79 和 81 2 同位素分布图 可用 Analyst 中计算器 Calculator 功能模拟 对于分子量较大 含 C 较多的分子 最高峰可能是 C13同位素峰 分析数据时要注意 3 利用稳定同位素合成标记化合物 如 氘等标记的化合物 再用质谱法检出 这些化合物 在质谱图外貌上无变化 只是质量数的位移 从而说明化合物 结构 反应历程等 六 提取特征离子色谱图六 提取特征离子色谱图 XIC 1 利用提取离子色谱图来确定特征离子 在复杂混合物分析及痕量分析时是 LC MS 测定中最有用的方式 当样品浓度很低时 LCMS 的 TIC 上往往看不 到峰 此时 根据上一步得到的分子量信息 输入 M 1 或 M 23 等数值 观 察提取离子的质量色谱图 检验直接进样得到的信息是否在 LC MS 上都能 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 反映出来 确定 LC 条件是否合适 以后进行 MRM 等其他扫描方式的测定 时参考 2 调机时 注意质量数不要偏差太大 先用标准品校准仪器 如偏差很小 可 不用重新校准仪器 读取分子量数值时要多采集几次 用平均或累加后得到 的质谱图来读取离子质量 会相对准确 七 影响分子量测定的因素七 影响分子量测定的因素 1 pH 的影响 正离子方式 pH 要低些 负离子方式 pH 要高些 除对离子化有影 响外 还影响 LC 的峰形 2 气流和温度 当水含量高及流量大时要相应增加 3 溶剂和缓冲液流量 流速适当高可以提高出峰灵敏度 4 溶剂和缓冲液的类型 通常正离子甲醇好 负离子乙腈好些 5 不挥发性盐的影响 大量累积 会使仪器的灵敏度下降 6 根据样品结构和性质 选择合适的液相色谱类型 正相 反相 C4 C18 7 合适的电压 DP 电压高时 样品在源内分解或碎裂 高 DP 电压会使多电荷 离子比例低 多聚体也减少 提取特征离子 271 得到的色谱图 可以看到明显的峰值 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 8 杂质的影响 溶剂的纯度 水的纯净程度等 当成分复杂 杂质太多时 竞 争使被测物离子化不好 同时使 LC 分离不好 9 样品浓度不够 有时需要浓缩 八 样品预处理的常用方法八 样品预处理的常用方法 a 超滤 b 溶剂萃取 去盐 c 固相萃取 d 灌注 Perfusion 净化 去盐 e 色谱分离 反相色谱分离 亲和技术分离 f 甲醇或乙睛沉淀蛋白 g 酸水解 酶解 h 衍生化 九 目标化合物的检测和谱图解析九 目标化合物的检测和谱图解析 1 如果是纯样 则直接进行 Product Scan 找出碎片信息 同样要扣本底 做 Product Scan 时 注意输入母离子质荷比小数点后的位数 输入准确 灵敏 度才会高 而且不容易出错 得到的谱图相对干净 2 处理得到的数据 一种方法是库检索 另外就是手工谱图解析 为使库检索 的结果准确 可使用不同的碎裂能量 如 CE 20 35 50V 各采集一张 MS2 图谱 QTRAP 用户可以使用新的 CES 功能 三张图谱叠加 因为化合物性 质不同 需要 CE 不同 对同一化合物 可以使用高 低能量分别碰撞 高 质量区的碎片和低质量区碎片对推测结构都很重要 低碎裂能量可以判断主 要碎片 高碎裂能量可看到更多信息 手工解析可以参考质谱解析书籍 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 3 若为混合物或含有基质的实际样品 则首先由标准品建立方法 按照定量的 步骤 选择至少 2 对 MRM 四个数据点 进行 LC MS MS 分析 可以利用 IDA 中 MRM MS2工作流程 提高检测灵敏度 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 谱图解析 1 IDA Full Scan MS2 一次进样 得到大部分信息 进一步可以再细一些 采用灵敏度更高的方法确证 2 加大 DP 用串联四极杆实现拟 MS3功能 以进行进一步的结构解析 3 前体离子扫描 PREC 和中性碎片丢失扫描 NL 寻找代谢产物 解析肽磷段 酸化位点等 4 互补性方法 选已知同系物 研究其裂解规律 有共同的碎片或相差同样质 量数 再扩展到未知物 下图为天然产物结构分析的一种思路 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 4 LC MS 实验技巧与仪器维护常识实验技巧与仪器维护常识 样品制备方面 样品制备方面 样品处理的好坏直接关系到整个 LC MS 分析的成败 必须要有成熟规范的样 品制备方法 样品预处理各步不能随意省略 如萃取 分离 去盐等 某些化合物必须化 学衍生化以适应 LC MS 要求 如磷酸酯水解 若 MS 信号实在太低 考虑更换样品处理方法 浓度非常低的样品不能保存太长时间 容器吸附 分解等原因使样品浓度降 低 标准品工作液现配现用 离子化方法选择一般原则 根据样品性质确定离子化方式离子化方法选择一般原则 根据样品性质确定离子化方式 适合 ESI IS 的样品类型 高极性化合物 蛋白质 肽类 低聚核苷酸等生物分子 胺类 季铵盐等 含杂原子化合物如氨基甲酸酯等 适合 APCI 的样品类型 弱极性 中等极性的小分子 如脂肪酸 邻苯二甲酸等 含杂原子化合物如氨基甲酸酯 脲等 ESI 不适合的化合物 极端非极性化合物如苯等 APCI 不适合的化合物 非挥发性样品 热稳定性差的样品 碱性化合物宜用正离子方式 酸性化合物宜用负离子方式 如未知 可能正负都要做 有些化合物正 负模式都出峰 选择灵敏度高的方式 不明确的优先试用正 离子方式 LC 条件的选择 条件的选择 1 根据化合物类型选择流动相组成 甲醇 水 乙腈 水或甲醇 乙腈 水 2 某些化合物只有某种流动相体系才出峰 3 一般正离子方式用甲醇 负离子方式用乙腈好些 4 通常有机相比例高些 可以提高离子化效率 5 梯度的设定 梯度变化太快对离子化效率影响很大 相应源参数也应该 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 改变 所以恒定比例流动相能满足分离分析要求时 尽量不用梯度 尤 其定量分析时 6 流动相中加入甲酸 乙酸铵等可提高正离子化效率 7 是否加酸不是绝对的 具体应根据 LC 的分离情况 样品在酸性条件下的 稳定性等决定 8 通常 pH 值低时 M H 比率高 pH 值高时 M Na M K 或 M NH4 比率高 9 定性分析时 有时加一些 NH4 Li 等 可帮助确定判断母离子 对碎 片较少的化合物 可以增加其质谱特征性 但会使生物大分子的质谱复 杂化 10 水的选择 娃哈哈纯净水比普通蒸馏水好 若在玻璃瓶中已存放时间太 长 有可能变质 当本底增大 LC 压力增高 应更换水相 11 溶解样品的溶剂 用流动相或甲醇 乙腈溶比用含水多的溶剂 LC 峰系形 好 如果常用的流动相不能很好溶解样品 可用少量特殊溶剂先将样品 溶解后再用流动相稀释 12 LC 流量在色谱柱和 MS 允许情况下适当高可以压缩峰宽 使峰强度提高 13 使用长的色谱柱 对定性分离效果好 但分析时间延长 如峰形仍不理 想 可考虑另选其他型号色谱柱 14 柱后补偿 当不得不用高浓度 TFA 时 常用异丙醇 解决信号抑制问题 柱后衍生化 有时可以增加离子化效率 调机准备调机准备 1 仪器平衡时间 真空 温度 LC 流动相比例 宁可长些 2 容器注意 塑料离心管添加剂很容易混入 尤其是被有机溶剂浸泡时间 较长时 干扰物信号有可能超过待测物 3 LC Pump 脱气 可以快速放掉柱前部管路中液体 排净气泡 还要注意 检查 LC 流动相储液瓶液面的高度 仪器参数的优化 仪器参数的优化 1 先用 PPG 或一已知化合物校准 如偏差不大 可以不用做质量校正 但 偏高 偏低要心中有数 2 先用浓度大约 0 1 1ppm 的标样 通过 syringe pump 以 5 10ul min 优化 Compound 项下面的参数 如 DP CE EP CXP 及 CAD 等 3 顺序 Q1 Scan Production Scan MRM Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 4 不同化合物参数有可能差别很大 5 再接通 LC 用 FIA 优化其他参数及源位置 或接一个三通 样品仍由注 射泵进入离子源 同时 LC 保持需要的流量 优化温度和 Gas1 及 Gas2 CXP CAD EP 优化后通常不用再改 在保证样品充分离子化的基础 上 DP 低些使母离子丰度提高 总灵敏度也会相应提高 6 质量范围不要太宽 涵盖待测离子再增加 20 30amu 即可 7 采样时间适当长些噪声低 当同时检测数十对离子时 MRM 采样时间 可以数十毫秒 同时检测数对离子时 可 100 200 毫秒 8 母 子离子输入的质量数值要选准 要根据 Q1 Scan 及 Production Scan 得到的结果输入 不能只是整数 当不能确定精确质量数时 可选待测 质量数上下各 0 1amu 同时数对离子优化 最终找出灵敏度最佳的一对 离子 例如 321 0 152 0 321 1 152 0 320 9 151 9 9 若样品较杂 同一化合物要选择几对母 子离子 经进样实验找出哪对 有干扰 去掉 保留不易受干扰的 1 2 对离子 10 每对离子各参数分别设 如 DP CE Time 等 对较弱离子对 采样时 间可适当长些 11 运行 Ramp 分别优化各参数一次 Step 选小些更准 范围不用太宽 每 次优化重复两次以上 以减小偶然误差 12 根据 LC 流量和流动相组成确定温度和 Gas1 及 Gas2 当流量大 水相 多时 温度及气流要大 离子源喷雾位置是根据 LC 流量调节的 基本 上流量固定位置就固定 13 调节喷雾电压 但太高有可能会导致放电 14 调节 Q1 及 Q3 分辨率 15 许多源参数互相影响 需要反复细调 使信噪比得以改善 仪器清洗 仪器清洗 1 做完含生物体液样品后 LC 需多冲些时间 使吸附到色谱柱上的干扰物 完全洗脱下来 2 若本底高 清洗离子源喷雾针管和 orifice 喷雾针可拆下超声清洗 orifice 要用无尘纸沾溶剂 甲醇 水 1 1 擦 3 清洗管路 可从源上拆下 Peek 或将源从仪器上取下 用 Syringe Pump 洗 换不同溶剂 极性 非极性 酸等轮番冲洗 最后甲醇 水 4 清洗进样针 进样阀 5 用过含酸的流动相后 色谱柱 离子源都要用甲醇 水冲 延长仪器和色 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 谱柱的寿命 6 做完 MRM 后 用手动使仪器处于 Q1 SCAN 降温 停大流量 LC 最 后关气 但管路中最好有些水 不要完全干 提高灵敏度的其他方法 提高灵敏度的其他方法 1 做纯标样时 Q1 Q3 的分辨率可以选择 Low S N 提高一倍 而噪声并 不增高 若复杂混合物 因为有基质干扰 不宜选 LOW 2 适当加大进样量 可以延伸检测下限 3 浓缩样品 测定后再推算回原始浓度 4 谱图平滑后可提高信噪比 可多次平滑 5 负离子模式时 使用零级空气比氮气灵敏度提高 6 适当提高检测器电压 7 当化合物很稳定不易产生碎片 可考虑采用 Ar Xe 等原子量较大的气体 以增加碰撞能量 仪器无信号诊断与处理 仪器无信号诊断与处理 1 在需要工程师到达之前 首先说明出现此现象的时机 是正在工作时突 然出现 还是一段时间没用仪器 开机后出现的 在此之前 动了仪器 哪些部位 是某些扫描方式没有信号还是都没有信号 2 例如 MRM 无信号 先看 Q1 Q3 有无信号 若 Q1 Q3 有信号 则通常 是 Analyst 参数设置问题 若无 则继续下一步 3 看有无本底信号 即有没有电噪声 如有 则可能是离子源或软件问题 4 检查真空 Q1 SCAN 方式时 通常应该 0 7 1 2 10 5 torr 之间 过好可 能是 Orifice 堵塞 过差则可能是漏气或真空泵有问题 5 电源电压是否超限 UPS 显示正常否 6 更换了离子源以后 高压线是否插好到位 喷雾电压设置正确与否 7 各路气体压力是否正常 阀门是否打开 加热气开了吗 8 离子源喷雾针重装后 有无漏气 漏液 有无液体从针外壁流出 9 管路有否堵塞 一节一节拆开测试 看通否 喷雾是否均匀 泵压是否 过高 通常不接色谱柱 200ul min 流速 压力应不超过几十 psi 10 若为 APCI 检查流速是否过低 如没接 LC 只用注射泵 放电尖端对 正方向没有 放电电流是否加上 11 若为 APPI 有没有通甲苯 12 若为 NanoSpray 检查喷雾针是否损坏 针尖碰断了没有 高压放电烧坏 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 或样品堵塞针尖 外涂金属层被磨掉 加不上高压 需提高喷雾电压才 有信号等 都要更换新的喷雾针 13 有无气泡 注射针里面 LC 流动相管路是否有空气 流速低时多等一会 儿 可手推一下注射针 帮助液体快速到达喷雾针 14 诊断软件的使用要在工程师指导下进行 一定要 Off Line 15 在工程师指导下 可用万用表测量各点电压值 判断故障点 进样管及进样管及 spray tube 堵塞 堵塞 1 用 Syringe 推 直线喷出 没有堵塞 2 若堵 取下用 50 水 50 甲醇超声清洗 3 超声仍无效 则需要更换进样管及喷雾针 Orifice 堵塞 堵塞 现象 灵敏度下降或真空度异常的好 处理方法 a 50 水 50 甲醇清洗 orifice 外部 b 不能解决问题时再清洗 orifice 内部 仪器灵敏度低时的诊断与处理 仪器灵敏度低时的诊断与处理 1 首先按照无信号处理方法检查 2 Orifice 脏也可引起真空变差 当 Curtain Gas 很高才好 说明脏了 清洗 3 机械泵油半年以上没换 或颜色加深 换油 低于刻度下限 补充 注 意要用同型号的油 4 管路漏液 样品没有完全进到离子源里 5 管路部分堵塞 喷雾时断时续 6 先调出安装仪器时的 PPG 等方法 用注射泵 Syringe Pump 进 PPG 看看 CAL 漂移否 若 CAL 不对 造成质量数无法选准 重新校准仪器 7 若注射泵采集标准品正常 则再看样品 然后用 Reserpine 等标准品 接 通 LC 如果有手动进样阀 可从此处进样 看 FIA 有无峰 若无 则可 能是 LC 及源参数设置问题 8 如果正常 则排除 MS 再自动进样 看 FIA 有无峰 若无 则可能是自 动进样器问题 9 若 FIA 正常 则再继续接上色谱柱采样 判断是色谱柱问题还是流动相 问题 10 离子化方式是否对路 如非极性物质用 ESI 效果很差 有机酸采用正离 子方式没什么信号 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 11 样品本身的问题 如样品没有完全溶解 浓度不够 所用溶剂与流动相 不匹配等 12 样品存贮时间过长 保存条件不好 则会因分解或被吸附等原因导致浓 度降低 13 放在自动进样器中的样品小瓶内套管底部有气泡 没取到样品 或针头 位置太高 而样品液面太低 14 前处理步骤中 标准品 内标样品是否加进 提取过程中有无遗洒 15 离子抑制 改变前处理方法或 LC 梯度 或换为 APCI 也可以降低部分离 子抑制效应 16 离子对质量数输入准确否 有无错误 数据重复性差时的诊断与处理 数据重复性差时的诊断与处理 1 参考前面各步骤 2 Curtain Gas 太低 有周期性降低现象 3 Dwell Time 太长 每个色谱峰采样点太少 重现性下降 一般一个色谱 峰 至少 8 点以上 Dwell Time 太短 则噪声会增高 使信噪比降低 4 新色谱柱没有充分平衡 旧色谱柱老化 重新清洗活化 或更换 5 离子对的选择有问题 如 M Na 做为母离子不稳定 子离子若为脱水 峰亦不太好 6 源温度太高 导致样品分解 7 加样前与标液分别平行做处理 观察有无区别 若标准品溶液无问题 而样品重复性差 则问题可能出在基质的干扰或前处理方法不当 8 稀释配制样品的移液枪 移液管 容量瓶等有无问题 9 某些样品正离子改为负离子试试 干扰少 重复性会好些 10 样品管中吸附 尤其低浓度 导致不成线性 如氨基糖甙 加些甲酸或 乙酸 可以改善 11 尽量使用流动相溶解样品 如果不同 例如用甲醇溶解样品 流动相是 乙腈 水 则出峰乱 稀释时残存甲醇都会有影响 12 梯度洗脱后平衡时间不够 或脏东西没洗干净 累积使得 彻底洗柱子 13 手动阀如果没问题了 再看自动进样器有无问题 14 空调波动 与仪器在同一供电线路上 启动 停止会影响仪器真空 进而 影响实验结果 15 当液氮剩不多时 及使用钢瓶时 尤其注意压力变化 16 流动相虽有在线脱气 但装入前超声还是必要的 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 17 Peek 吸附 FIA 时明显 例 分析四环素 乙腈 水 0 1 乙酸 30 70 由开始时一个峰最后可能变为两个峰 另外保留时间也会改变 应该充 分冲洗管路 软件死机时处理方法 软件死机时处理方法 1 由于鼠标操作太快 打开窗口太多造成的死机 重启重启 Analyst 软件 正在 采集的数据不会丢失 用 软件 正在 采集的数据不会丢失 用 CTRL ALT DEL Windows 任务管理器结束任务管理器结束 Analyst 任务 任务 尤其当采集数据时 实时查看谱图不要用箭头翻看前后一 次的数据 可重新打开一个新的谱图 注意不要在一张谱图上过多次计算 信噪比 本底范围也不要选择太宽 2 当 Syringe Pump 到头时 API2000 QTRAP QSTAR 右下角图标变黄 须先点击 Standby 再点击 Ready 3 当由于 HPLC 的原因 如漏夜等引起图标变红 首先排除 HPLC 故障 并 重新开关所有 HPLC 设备一次 待自检通过后 先 Deactivate 再重新激 活 4 Analyst Services Stop 中断计算机与仪器通讯 本次采集的数据丢失 本次采集的数据丢失 重 启 Windows 正在采集的数据会丢失正在采集的数据会丢失 5 由于 Exhaust 排气管不通畅 引起图标变红 首先清理排气管 如果图标 仍然是红色 有可能是阀憋住了 要打开 Exhaust 进气口 放气 然后再 重新接好 6 以上步骤都失灵时以上步骤都失灵时 在 C 盘的 Program Files Analyst Frimware 中双击 SCU21 按 F4 Reset System Controller 等仪器主机上指示灯不再闪硕 重新进入 Analyst 7 重装 Analyst 软件前 先将 API Instrument 中 InstrumentDATA 和 Parameter Setting 两个文件 Copy 出来 然后卸载 Analyst 软件 再重装 不要修复 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 还要用 SCU21 查看 Frimware 版本号 如不对要 Download 参见软件安装 说明 注意计算机用户名 不能有符号 只能是字母和数字 还要以管理 员身份登陆 8 当软件运行速度很慢 经常死机 可考虑增加计算机内存 但要 DELL 专 用的内存 9 如果出现不能控制附加设备情况 检查是否需要加补丁程序 具体看 Hotfix 的说明 10 有时由于计算机的问题 引起软件工作异常 如提交后不采集数据等 试试重新编辑 Method Batch Configuration 11 经常清理计算机磁盘碎片 定期 查杀病毒 如果中毒太深 可能需 要硬盘格式化 12 Analyst 1 4 每次启动出现如图页 面 点 X 或 Register Later 按钮即可 仪器日常维护方法仪器日常维护方法 1 操作顺序是先开气 再加热 然后通液体进样 停止实验时要相反的顺序退 出 2 退出软件及 Standby 前 把仪器设定到 Q1 正离子模式 3 注射泵不要让它推到头 4 随时检查气压curtain gas 压力 0 35 0 4 Mpa Exhaust gas压力0 35 0 4 Mpa 不能超限 5 定期更换或清洁空气过滤网 6 定期校正仪器 7 注意仪器后面的排气出口必须保持通畅 机械泵维护方法机械泵维护方法 1 注意机械泵油的颜色 变深后换油 至少半年换一次 2 经常检查机械泵油液面正常位置 3 机械泵油的更换方法 首先关机 要在油处于温热状态下排出 加新油不要 过多 刻度一半即可 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 第二部分第二部分 1 LC MS MS 质谱数据库的使用质谱数据库的使用 因为 LC MS 的高本底 很难获得足够纯的化合物的碎片质谱图 所以这里 的质谱数据库中都是二级质谱图 即通常的 MS2或 EPI 谱 1 数据库的导入数据库的导入 原来默认的数据库是 compoundlib mdb 存储在 D Analyst Data 目录下 里 面已经包含了数据库的所有功能 但其谱图数量较少 将新的数据库文件 mdb COPY 到 D Analyst Data 如果数据库文件是由 CD 来的 则需将其文件的只读 属性去掉 然后在 Explore 项下依次打开 Tools Settings Optimization Options 此时出现如图右侧界面 在中间点击 Browse 找到你需要的库文件名 选中并 打开 选中的库文件名则在左侧下拉式菜单格中出现 继续点击右下的 Test Connection 成功后再点击 Save 将其存盘 最后 OK 退出 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 2 二级质谱图检索二级质谱图检索 打开一幅二级质谱图 点击鼠标右键 选择 Search Library 开始搜索 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 如果库中没有你要找的化合物 则出现如下提示 如果搜索成功 则继续显示下图结果 图左上谱是未知物谱 左侧第二和第三幅谱是库中检索出最匹配的两个谱 左下是检索出的结果 包括化合物名称 分子式 分子量 符合率 纯度和碰撞 能量等内容 右侧是 UV 谱 如果有的话 和结构式及化合物信息 通过点击图上部的 View Manager Hit List 可以编辑修改界面显示内容 例如下图中将 UV 和结构式去掉了 这样可使界面简单 点击左上 Subtract 使 得未知物谱与检索出的谱互相扣减 显示于左侧第三幅位置 便于观察相似度 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 二级质谱图检索还可以通过提供一些限制条件来进行 同样打开一幅二级质 谱图 点击鼠标右键 选择 Set Search Constraints 出现下图右侧选项 根据你 的需要打勾 如点击右下角的 Peak Constraints 出现中间画面 可以加减质谱峰 来检索 例如去掉明显的杂质峰或由于未知物峰太弱太少而加上 以提高检索成 功率 Analyst 软件应用培训教程 Analyst 软件应用培训教程 3 在数据库中增加谱图在数据库中增加谱图 同样打开一幅二级质谱图 点击鼠标右键 选择 Add a Record 出现下图右 侧界面 需要输入化合物名称等信息 允许你修改或删除右侧的峰数据 下半部 分的信息是仪器采集数据时自动记录的 但也允许修改 检查无误后 OK 确认 如果要在图中加入化合物