（运动人体科学专业论文）过度训练后大鼠心肌损伤及磷酸肌酸钠对其影响的研究.pdf

中文摘要目的：过度运动会导致机体受损，持久的超负荷训练对心脏会造成损害。本文以过度训练诱发大鼠运动性心肌损伤为切入点，动态观察心肌细胞的组织形态及功能代谢的变化，并与促心肌损伤恢复药物( 磷酸肌酸钠) 干预模型鼠进行同时相对比研究，以求更加深入、系统地研究运动性心肌损伤后的动态变化特征及其恢复规律，寻找有效的药物恢复手段，从理论上丰富运动性一c , , p j i 损伤的恢复规律的研究，为运动实践中进行运动员心脏疾患的医学监控以及预防、治疗措施的介入提供理论依据。方法：本文以4 周龄健康雄性w is t a r 大鼠作为研究对象，随机分为1 0 组：安静对照组、过度训练组( 5 幺j t ) 、过度训练后磷酸肌酸钠治疗组( 4 组) ，除安静对照组外的动物按照过度训练方案进行8 j a j 的递增负荷游泳运动，于最后次运动的运动后即刻、运动后6 小时、运动后2 4 d , 时、运动后7 2 d , 时和运动后1 周对大鼠进行麻醉、超声心动图检测及取材，选取血红蛋白( h b ) 、血尿素氮( b u n ) 、血清睾酮( t ) 三个血液生化指标对实验动物的运动负荷进行评定，同时测定血清中肌酸激酶( c k ) 、肌酸激酶同功酶( c k b i b ) 、乳酸脱氢酶( l d h ) 、乳酸脱氢酶同功酶1 型( l d h l ) ，并测定心肌组织中超氧化物歧化酶( s o d ) 活性及丙二醛( m d a ) 含量。同时对各组大鼠的心肌进行组纫觋态学观察，用原位脱氧核糖核酸酶术端标记法( t u n e l ) 检测细胞凋亡，采用免疫组1 乜法和免疫印迹法测b c 卜2 及b a x 表达，观察过度训练大鼠以上各指标不同时问点的变化。所有数据均采用s p s sf o rw i n d o wl1 5 软件包进行统计学处理，所得结果均以均数标准差( i s )表示。各组问均数比较采用单因素方差分析，同一时间点组问两两比较采用独立样本t检验。结果：( 1 ) 过度训练组及过度训练后给药组大鼠在8 周递增负荷游泳训练后普遍出现了运动能力下降，一般状况恶化，反映机能的指标发生明显变化，与安静对照组相l , h b 矛i i 血清t 水平显著下降( p o 0 1 ) ，b u n 显著增高( p o 0 1 ) ，差异有统计学意义( 2 ) 过度训练后大鼠心肌组织h e 染色示心肌纤维变性，混浊肿胀，出现空泡样变，间质中有较多的炎细胞浸润。( ：j ) 过度训练后大鼠较安静对照组大鼠相比左室收缩末期内径显著增大( p o 0 1 ) ，心率升高，左室射札分数、左室缩短分数都显著下降，差异具有统计学意义( 砌 0 0 1 ) ，随恢复时问延长反映心肌收缩功能的指标逐渐恢复，过度训练1 周后心脏超声指标恢复接近形常水平。( 4 ) 过度训练后各心肌酶学指标显著升高( p ( o 0 1 ) ，血清c k 值0 ：过度训练后即刻达峰值，随着恢复时间延长，c k 值逐渐下降，血；青c k - m b 、l d h 、l d h l 值旱现先增高后下降的变化。过度训练后大鼠心肌m d a 含量显著增加( p o 0 1 ) ，心肌s o d 活性显著下降( p ( o 0 1 ) ，随恢复时间延长心肌m d a 含量逐渐下降，心肌s o d 活性逐渐升高。( 5 ) 过度训练后大鼠较安静对照组大鼠心肌细胞凋亡率显著增加( 尺o 0 1 ) ，抑制凋亡基因b c l - 2 表达下降( p o 0 5 ) ，促凋亡基因b a x 表达显著升高( p ( o 0 1 ) ，b c l - 2 b a x比值显著降低( 尺o 0 1 ) ，随着恢复时i 廿j 延长，心肌凋亡率以及促凋亡二基凶b a x 表达逐渐下降，b c l 一2 b a x 比值逐渐回升。( 6 ) 运动后给药组大鼠与同一时问点过度训练组大鼠相比，在过度训练后6 h 时心肜l c k - m b 、l d h 、l d h l 显著降低( p ( o 0 1 ) 。左室射血分数、左室缩短分数分别在2 4 h 、7 2 h时相点运动后给药组较过度训练组显著增高( 尺0 0 5 ) 、运动后给约组孑过度训练组比较在2 4 h 和7 2 h 时相点心肌m d a 水平差异显著( 尺o 0 5 ) ，过度训练后2 4 h 时运动后给药组较过度训练组b c l - 2 b a x 比值明显增高。结论：( 1 ) 本实验采用8 周递增负荷游泳训练，模拟了大鼠过度训练模型。( 2 ) 过度训练后心肌组织形态学发生损伤性变化。( 3 ) 过度训练后大鼠左心室收缩功能下降，恢复l 周后左心室收缩逐渐恢复。( 4 ) 过度训练后大鼠心肌线粒体自由摹生成增加，清除能力降低，脂质过氧化反应水平显著升高，发生膜性损伤，心肌酶从细胞内逸出，血清心肌酶指标发生损伤性变化，随着恢复时间的延长，心肌自由基及酶学损伤指标与心功能转归变化一致。( 5 ) 过度训练后大鼠心肌凋亡率增加，随着恢复时| 日j 的延长，促凋亡基因b a x 表达逐渐下降，b c l - 2 b a x 仁g 值上调，心肌凋亡逐渐减少。( 6 ) 过度训练组与药物干预组反映心肌损伤恢复的指标水平存在一定差异，说明发生过度训练后，给予磷酸肌酸钠，可以加快运动性心肌损伤的恢复。关键词：过度训练；恢复期；心肌；超声心动图；凋亡；磷酸肌酸钠i va b s t r a c to b j e c t ：o v e r - e x e r c i s ec a u s e si n j u r yt ot h eb o d ya n dl o n g - l a s t i n g ，o v e r - t r a i n i n gi n d u c e sd a m a g et ot h eh e a r t i nt h i si n v e s t i g a t i o n w eo v e r - t r a i n e dt h er a t sa n di n d u c ed a m a g e si nt h em y o c a r d i a lc e l l sa n dt h e no b s e r v e dc h a n g e si nm o r p h o l o g ya n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no fc a r d i a cc e l l s w ed i s c u s s e df e a t u r e sa n dt h er e p a i rp r o c e s so fe x e r c i s e i n d u c e dm y o c a r d i a ld a m a g ef o rt h ep u r p o s eo fp r o v i d i n ge v i d e n c eo fm o n i t o r i n gt h i sk i n do fd a m a g ea n dt h e r e f o r es u g g e s t i n gp r e v e n t i v ea n dc u r a t i v em e a s u r e sf o re x e r c i s e - i n d u c e dm y o c a r d i a ld a m a g e m e t h o d s ：i nt h i si n v e s t i g a t i o n ，4 - w e e k o l dm a l ew i s t a rr a t sa r er a n d o m l yd i v i d e di n t o10g r o u p s ：c o n t r o l ，o v e r - t r a i n e d ，a n dp h o s p h o c r e a t i n ed i s o d i u ms a l tt r e a t m e n ta f t e rb e i n go v e r t r a i n e d a l lg r o u p se x c e p tt h ec o n t r o lg r o u pr e c e i v e dt h ea s c e n d i n go v e r - l o a dt r a i n i n gf o re i g h tw e e k sa c c o r d i n gt ot h eo v e r - t r a i n i n gp r o c e d u r e a n e s t h e s i at h er a t sf o ru c ge x a m i n a t i o ni m m e d i a t e l ya f t e rt h et r a i n i n g ，6h o u r s ，2 4 h o u r s ，7 2h o u r sa n daw e e ka f t e rt h et r a i n i n g ，r e s p e c t i v e l ya n dt h e ne x e c u t e dt h e ma n dt e s t e dt h eh b ，b u n ，a n dtt oa s s e s st h ee x e r c i s el o a do ft h ee x p e r i m e n t a la n i m a l w ea l s ot e s t e dt h es e r u mc k ，c k m b ，l d h ，l d h1 ，s o da n dm d ai nt h em y o c a r d i a lt i s s u e ，a n do b s e r v e dt h em o r p h o l o g yo ft h em y o c a r d i u mo fe a c hg r o u po fr a t s t u n e lw a su t i l i z e dt o t e s ta p o p t o s i sa n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n di m m o b l o t t i n gw e r eu s e dt oa s s e s st h ee x p r e s s i o no fb c l - 2a n db a x w eo b s e r v e dc h a n g e si nt h e s ep a r a m e t e r sa tt h et i m ep o i n t sm e n t i o n e da b o v ea n dp r o c e s s e dt h ed a t ao b t a i n e dw i t hs p s sf o rw i n d o w s1 1 5 ，a l lr e s u l t sa r ep r e s e n t e di nm e a n - + - s d ( i s ) d a t ao b t a i n e db e t w e e nd if f e r e n tg r o u p sa r ep r o c e s s e dw i t ho n e - w a ya n o v aa n dtt e s ti su s e dt op r o c e s sd a t aw i t h i nt h es a m eg r o u p p 0 0 5i sc o n s i d e r e dt oh a v es t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e r e s u l t ：1 o v e r - t r a i n i n gg r o u pa n dd r u g t r e a t e do v e r - t r a i n i n gg r o u pm a n i f e s t e dd e c r e a s e dm o t o ra b i l i t ya n dd e t e r i o r a t i o ni ng e n e r a lc o n d i t i o n t h ep a r a m e t e r sr e f l e c t i n gp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n sc h a n g e ss i g n i f i c a n t l ya sw e l l ：c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，h ba n ds e r u mtd e c r e a s e dd r a m a t i c a l l y 0 o1 ) ，b u nl e v e li n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yp o 01 ) 2 a f t e ro v e r - t r a i n i n g ，t h em y o c a r d i a lf i b e r sd e g e n e r a t e d ，c l o u d ya n ds w e l l i n g ，a n db a l l o o n i n gc h a n g ec a nb es e e ni ns o m ea r e a s al a r g ea m o u n to fi n f l a m m a t o r yc e l l si n f i l t r a t e di nt h ei n t e r s t i t i a lt i s s u e 3 c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，t h el v i d ( s ) o ft h er a t si nt h eo v e r - t r a i n i n gg r o u pe n l a r g e ds i g n i f i c a n t l y 0 01 ) ，t h eh e a r tr a t ei n c r e a s e da n dt h el v e f 、l v f s 数d e c r e a s e ds i g n if i c a n t l y a st h er e c o v e r i n gt i m ei n c r e a s e d ，p a r a m e t e r sr e f l e c t i n gt h es y s t o l i cf u n c t i o no fm y o c a r d i a lc e l l sg r a d u a l l yr e s t o r e d 1w e e ka f t e rt h et r a i n i n g ，t h eu c gd a t ar e s t o r e dt oan o r m a ll e v e l 4 a f t e rt h et r a i n i n g ，t h el e v e l so fm y o c a r d i a le n z y m e se l e v a t e ds i g n i f i c a n t l yp o 01 ) t h es e r u mc ka m o u n t e dt op e a kl e v e li m m e d i a t e l ya f t e rt h et r a i n i n ga n da st h er e c o v e r i n gt i m ei n c r e a s e d ，t h ec kl e v e ld e c l i n e dg r a d u a l l y t h es e r u mc k m b ，l d h ，l d hls h o wa l s ot h es i m i l a rc h a n g e s o v e rt r a i n i n gl e a d st oi n c r e a s e dm d ai nt h em y o c a r d i u ma n dd e c r e a s e ds o da c t i v i t yp o 01 ) a st h er e c o v e r i n gt i m ei n c r e a s e d ，m d ac o n t e n ti nt h em y o c a r d i u md e c r e a s e dg r a d u a l l yw h i l et h es o da c t i v i t yi n c r e a s e d v5 t h ea p o p t o s i sr a t ea n dt h ee x p r e s s i o no fb a x ( g e n et h a tp r o m o t e sa p o p t o s i s ) i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rb e i n go v e r - t r a i n e d 仞 o o1 ) w 1 1 i l et h ee x p r e s s i o no fb c l 一2 ，w h i c hi n h i b i t sa p o p t o s i s ，d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yp o 0 5 ) t h e r e f o r et h eb c l 一2 b a xr a t i od e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yp 0 0 1 ) a st h er e c o v e r i n gt i m ei n c r e a s e d ，t h ea p o p t o s i sr a t ea n dt h ee x p r e s s i o no fb a xd e c l i n e dg r a d u a l l ya n dt h eb c l 2 b a xr a t i oi n c r e a s e dg r a d u a l l y 6 c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p t h el e v e lo fl d h c k m ba n dl d hli nt h em y o c a r d i a lc e l l si nd r u gt r e a t e do v e rt r a i n e dg r o u pd e c r e a s e ds i g n i f c a n t l y6h o u r sa f t e rb e i n go v e r - t r a i n e d ( 矽 0 01 ) w h i l et h el v e f 、l v f s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y2 4a n d7 2h o u r sa f t e rb e i n gt r a i n e dc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u pp o 01 ) t h em y o c a r d i a lm d al e v e lo ft h ed r u gt r e a t e do v e rt r a i n e dg r o u pa n dt h eo v e rt r a i n e dg r o u pd i f f e rs i g n i f i c a n t l y2 4a n d7 2h o u r sa f t e rr e c e i v i n gt h et r a i n i n gp o 0 3 n g m 1 ) ，认为血清中c t n t 含量适度增长的心肌损伤为可复性损伤。又有研究表明。嘲铁人三项和半程铁人三项运动可导致安静时左心室收缩和舒张功能发生可逆异常，且上述运动后c t n t 显著增加，表明受过训练的个体，超长耐力运动后可能发生心肌损伤。盏永霞汹3 等的研究发现新兵3 公里运动后宥部分战士出现一过性肌钙蛋自升高。g u e n t h e r b 劬对马拉松比赛前后的c t n t 进行了对比研究，发现有2 7 。5 ( 8 2 9 ) 的运动员赛后即刻的c t n t 显著升高，赛后2 4 小时3 4 ( 1 2 9 ) 的运动员高于正常水平。c h e ny 秘踟的研究中发现，剧烈持续的运动最大鼠血清中的c t n t 显著井高、且心肌组织局部的c t n t 含量下降，这种变化基本在2 4 小时内结束，表明运动可造成心肌损伤，而且c t n t 的变化不同于临床上发生心肌梗塞时的变化。正常肌细胞腿酸激酶( c k ) 存在于细胞质的胞浆中，是提供腮肉收缩过程中能量供给的重要高能磷酸转移酶。此酶与运动强度和运动时间关系密切。肌酸激酶有3 种同功酶形式：肌型( c k m m ) 、心型( c k m b ) 和脑型( c k b b ) ，其中c k - m b 是心脏特异型鼹酸激酶同功酶，正常情况下细胞膜的完整和功能正鬻保证了c k m b 极少透出细胞膜。血液中如检出c k m b 的比例较高则可认为是来自心肌细胞的逸出。乳酸脱氢酶( l d h ) 是糖原无氧酵解代谢途径的关键酶，在耗氧的，心肌组织中，乳8酸在l d h 作用下氧化成丙酮酸并经线粒体进入三羧酸( t c a ) 循环h 别。l d h 含有5 种同功酶，它们是由h 与m 贬基按不同组合形成的四聚体，按照电泳速度不同，从阳极到阴极显示，分裂为l d h l l d h 5 。这5 种不同形式的圊功酶在肾脏、骨髂舰、翳脏和心脏等器官中广泛分布，l d h 同功酶的分布有明显的组织特异性，所以临床上可以根据其组织特异性来协助诊断疾病。其中存在于心肌细胞内的亚型，为乳酸脱氢酶同功酶1 型，l d h l 主要催纯由盘液进入心腿的乳酸脱氢生成丙酮酸，并进入线粒体参加三羧酸( t c a ) 循环，氧化释放能量供给心肌活动需要。当丙酮酸浓度最大时，该酶的活性迅速被抑制，而心肌细胞在供氧不足地特殊情况下，此酶的存在使无氧酵解提供能量成为可能。l d h l 在l 离床上冠状动脉狭窄弓| 起的急性心肌梗塞发作后，早期血清中l d h l活性即明显升高，是敏感性、特异性均较强的心肌损伤指标。在正常情况下，血清中l d h 和c k 及其同功酶的活性较低，但在病理状态下和剧烈运动后，血清心舰酶活性瞬曼升高，血液中某种特定酶含量的交化可以映出某个特定组织、器官的功能状态及损伤情况h 射。血清酶的变化趋势是判断剧烈运动致心肌损伤严重程度和预后的重要的预警因素。以往的研究中关于运动对c k 、l d h 及其同工酶的短时闻内的影晌有一定的报道，德是运动训练对机体c k 及其囝工酶一段时闯蠹的影响的研究为数较少。h o u m a r d l 4 4 等对长跑运动员进行4 周的大强度的运动训练( 1 8 1 k i n w ，6 d w ) 后，其血清c k 活性显著升高歪1 6 8 土1 5 u l ，而进行3 周小强度运动训练( 2 4 k i nw ，6 d w ) 后，英血清c k 活性显著下降至9 9 _ + 9 u 1 。田振军秘秘等研究发现，过度训练组大鼠其血清c k 活性显著高于对照组，其上舟幅度达到5 5 4 3 。h a r u k i ，m u s h a h 邮等研究发现，长时间大强度地超级马拉松跑，运动即刻c k m b 活性达到峰值，且是安静时地6 0 0 倍，证明心肌受到严重受损。t a k e k u r r a 弧7 3 等报道，短时闻大强度的调练能明显增力瑟骨骼肌糖酵解酶活性c k 和l d h 的活性。1 2 3 运动性心肌损伤的分子机制细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。现已证明，许多疾病与凋亡机制异常有关，而且越来越多的资料表明h 引，心肌细胞凋亡参与了心肌炎、缺血性心脏病等多种心血管疾瘸的病理过程。心肌细胞为终末分化、不具备增值熊力的成熟细胞h 蚋，心肌细胞凋亡在维持心脏正常形态结构方砸具有十分重要的意义，心肌细胞凋亡的不断积累，其结果是心肌数目逐渐减少，造成其收缩成份的减少，使心脏向心功能低下和心功能不全的方向发展。袁箭擘峰，常芸汹1 的研究认为反复大强度运动可导致凋亡比率的明显增加，这可能是过度训练导致心矾细胞损伤的病理机制之一。用d n a 片段原位术端标记法( t u n 毯l ) 可以观察到过度训练组大鼠心肌细胞胞质变深( 胞质浓缩) 和胞核染色质浓聚边集( 核周缩) 及凋亡小体形成等心肌细胞凋亡的形态学特点硒。b c l 2 是目前已知的抑制凋亡最重要的一种基因，b c l 2 定位于线粒体外膜、内质网膜、核膜上，直接影响线粒体功能，阻止细胞凋亡一切早期征象发生，包括线粒体膜电位的下降，抑制p t 孔开放，直接或间接阻止细胞色素c 的释放，阻止细胞凋亡瞄刳。有研究表明瑟3 瓤，适宜的运动训练可使大鼠心肌细胞中b c l 2 蛋自表达增加，而长期大负荷的运动可使心肌细胞中b c l 2 蛋自表达下降。f a s 基因又称为a p o 1 ，是重要的健凋亡因子之一。动物实验发现酾5 瑚1 ，发生急性心肌梗塞的心肌细胞中f a s 蛋白表达增 i l l 3 1 倍，体外培养的新生大鼠心肌细胞在缺氧1 2 小时后出现d n a 降解片断，心肌f a s 的m r n a 上调2 倍，提示心腿细胞缺盘坏死与f a s 介导的细胞凋亡有关。金其贯黔7 1 的研究中过度训练抑制大鼠心肌组织中b c l 2 蛋白的表达而促进f a s 蛋白的表达，可能是过度训练时大鼠心肌细胞凋亡发生的基因调控机制。_ 1 3 小结过度训练作为一种常见的运动性疾病，是一种多器官功麓紊乱的病理状态，它严重影响着运动员的身心健康和比赛成绩。过度运动会导致机体受损，持久的超负荷训练对心脏会造成损害。研究过度训练对心脏的影响机制，进而寻找有效的防治措施，是当前运动医学工作中急需解决的问题。从现有的文献来看，有关长时间大负荷运动对心脏结构及功能的影响已进行了大量的研究，体育界以及医学界的学者对运动所致的心肌损伤的机制从多方面进行了探讨，但豳于实验动物、运动模型以及测试指标的不同，所得结果尚不能完全一致，且运动对心肌影响的时相性研究较少，因此今后有待于进行运动对心肌形态、功能、生化等多指标影响的同时观察，并对这些指标变化的时相性特点进行系统的研究，以进一步加深运动性心肌损伤及其损伤变化特点的认识，为实践中进行运动性心腿损伤的医学监控以及以及预防性、治疗性措施的介入提供理论依据，并为科学制定训练方案和有效预防心肌损伤，开辟新的研究思路。1 02 实验材料与方法2 1实验动物清洁级w i s t a r 雄性大鼠6 0 只( 由首都医科大学动物实验中心提供) ，体重为l o o g 2 0 9 。标准啮齿类动物饲料喂养，自由摄食，每笼5 只，室内温度2 0 2 ，室内空气流通，相对湿度5 5 - - 一6 5 ，光照1 2 h d ，训练期间生活习性和饲养等各种条件均严格控制。2 2 主要实验仪器设备高分辨率小动物超声系统v e v 0 7 7 0 t m加拿大日立7 1 8 0 全自动生化分析仪日本s n 一6 9 7 全自动双探头免疫放射y 计数仪上海c a 一5 0 0 血球分析仪日本s i g m a 超高速低温离心仪德国分光光度计上海c m i s 多功能真彩色图像分析系统日本o l y m p u s b x 41 电子显微镜日本s i g m a 台式冷冻离心机德国石蜡组织切片机r m 2 1 3 5l e i c a电子天平b l 一6 1 0s a r r i o r i u s手术用常规器械移液器等2 3 实验方法与步骤2 3 1实验分组6 0 只大鼠随机分为安静对照组( 6 只) 、过度训练后即刻组( 6 只) 、过度训练后6 h组( 6 只) 、过度训练后2 4 h 组( 6 只) 、过度训练后7 2 h 组( 6 只) 、过度训练后1 w 组( 6只) 、过度训练后磷酸肌酸钠6 h 组( 6 只) 、过度训练后磷酸肌酸钠2 4 h 组( 6 只) 、过度训练后磷酸肌酸钠7 2 h 组( 6 只) 、过度训练后磷酸肌酸钠1 w 组( 6 只) 。表i 实验大鼠分组及缩写分组数量( 只)缩写2 3 2 实验运动方案大鼠游泳水池为9 0 c m x 6 0 c m x 5 5 c m ，水深6 0 c m ，水温控制在3 0 _ 2 。c 。除安静对照组外的动物均采用如下运动方案蚓( 参照朱全、浦钧宗的过度训练模型) ：大鼠共进行8 周的递增负荷游泳训练，大鼠每周训练6 天，第1 天下水游泳3 0 m i n ，以后逐日增加，第l 周末每天游泳1 2 0 m i n ，第2 周起进行离强度训练，开始时大鼠负重3 体重的重量，每天游泳1 2 0 m i n 。以后每周负重递增o 5 体重，每天1 2 0 m i n ，如发现有力竭表现，捞出水面休息l o m i n 后继续训练满1 2 0 m i n ，第7 周至第8 周大鼠维持5 体重的负重量，每天反复2 次游至力竭。2 次力竭闻隔时闻6 小时。力竭判断标罐：大鼠沉入水中l o 秒不能自主浮上水面，且放在平面无法完成翻正反射引。2 3 3 给药方式过度训练焉给药( 磷酸肌酸钠 组大鼠，予第8 周末运动结束后开始给予腹腔注射磷酸肌酸钠2 0 0 m g k g ，1 次1 2 h ，直到取材阳引。2 3 4 麻醉操作各组大鼠于第8 周末称重，安静对照组于实验第8 周末麻醉取材，其余动物按照组别分别于运动质即刻、运动居6 h 、运动履2 4 h 、运动骺7 2 h 、运动后1 周于大鼠尾静脉取血2 0 u l ，用于测定血红蛋白( h b ) 值，之后采用腹腔注射0 5 水合氯醛进行麻醉，剂量为0 5 m l l o o g 体重。1 22 3 5 大鼠超声心动图测定麻醉后大鼠胸部备皮，仰卧位固定，用高分辨率小动物超声系统v e v 0 7 7 0 t m 对大鼠进行超声检测：探头频率8 5 m h z ，扫描速度为l o o m m s ，由有经验的医师专人操作，探头置于其左胸，在取得满意的胸骨旁左心室短轴二维图像后，在乳头肌水平将m 型取样线垂直于室间隔和左心室后壁获得m 型超声心动图畸，根据a s e 推荐法测定左室舒张末期内径( l v i d ；d ) 、左室收缩末期内径( l v i d ；s ) 、左室舒张末期容积( l v d v ) 、及左室收缩末期容积( l v s v ) 并测定大鼠心率( h r ) ，经s i m p s o n 法换算左室射血分数( l v e b 弼) 、左室缩短分数( l v f s ) ，计算公式为l v e f = ( l v d v l v s v ) l v d v 1 0 0 ，l v f s = ( l v i d ；d l v i d ；s ) l v i d ；d x1 0 0 ，作为心功能参数嗽1 。2 3 6 取材进行超声心动图测定后的大鼠从其腹主动脉处取血4 m l ，置于一次性血清管中，并立即低温( 4 ，3 0 0 0 r p m ，l o m i n ) 分离血清，置于一8 0 冰箱保存，用于测定尿素氮( b u n ) 、睾酮( t ) 、肌酸激酶( c k ) 、肌酸激酶同功酶( c k m b ) 、乳酸脱氢酶( l d h ) 及乳酸脱氢酶同功酶l 型( l d h l ) 。取血之后立即取出大鼠心脏，放入预冷的生理盐水中洗去血渍，用吸水纸吸干，肉眼直视下剪取左心室心尖部心肌组织，作为标本立即放入1 0 的中性f o r m a l i n 溶液中固定。标本固定2 4 - - - 4 8 小时后常规石蜡包埋。连续切片6 8 张，厚度4 u m ，用涂有多聚赖氨酸的载玻片贴片，5 2 c 烘烤4 8 小时，备用。然后用刀片切取l o o m g 左右的心室肌，放在预冷的匀浆液中、用剪刀剪碎，研磨成匀浆，并立即低温( 4 c ，3 0 0 0 r p m ，l o m i n ) 分离上清液，用于测定心肌组织中的超氧化物歧化酶( s o d ) 活性丙二醛( m d a )含量。2 3 7 实验指标与测定方法2 3 7 1 一般情况观察：过度训练组及给药组大鼠在游泳训练前后仔细观察大鼠精神、活动状态、体力恢复情况、食量增减等变化。2 3 7 2 机能指标以及心肌酶学生化指标测定采用日本产c a - 5 0 0 血球分析仪对大鼠静脉血进行血红蛋白测定。采用同立7 1 8 0 全自动生化分析仪测定大鼠血清尿素氮、血清肌酸激酶( c k ) 、肌酸激酶同功酶( c k m b ) 乳酸脱氢酶乳酸( l d h ) 、乳酸脱氢酶同功酶1 型( l d h l )采用s n 一6 9 7 全自动双探头免疫放射y 计数仪对血清睾酮进行测定。1 3表2 机能及血清心肌酶学指标测试方法2 3 7 3 心肌组织蛋白含量的测定使用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒( 购自南京建成生物制品研究所) 进行测试。原理：蛋白分子具有- n h 3 + 基团，当棕色的c b b g 2 5 0 显色齐j j j h 入蛋白标准液或样品中时，c b b g 2 5 0 染料上阴离子与蛋白一n h 3 + 结合，使溶液变为蓝色，通过测吸光度可计算出蛋白含量。试剂及配制：取考马斯亮兰c b b g 2 5 0 贮备液，加入2 0 0 m l 蒸馏水进行5 倍稀释，配成应用液。取1pl 的蛋白标准品，加4 9pl 的生理盐水，配成1 2 5 6 m g m l 浓度的标准液。心肌组织蛋白含量的测定：空白管、标准管及各测定管分别加入蒸馏水、1 2 5 6 标准液、样品，均为0 0 5 m l ，再在各试管中加入3 o m l c b b g 2 5 0 显色剂。各试管混匀，静置1 0 分钟，用h u m a l y z e r 半自动生化仪，于5 9 5 n m 处，l c m 光径，空白管调零，测各管吸光度。蛋白含量计算公式：蛋白含量( g l ) = 测定管吸光度标准管吸光度标准管浓度( g l )2 3 7 4 心肌组织超氧化物歧化酶( s o d ) 活力测定( 采用黄嘌呤氧化酶法)使用超氧化物歧化酶( s o d ) 试剂盒( 购自南京建成生物制品研究所)原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基( 0 2 - ) ，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，可用h u m a l y z e r 半自动生化仪测其吸光度。当被测样品中含s o d 时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中s o d 活力。( 购自南京建成生物制品研究所)高等动物细胞内只有2 种s o d 即铜锌s o d ( c u 、z n - s o d ) 与锰s o d ( m n - s o d ) ，二者1 4相加等于总s o d ( t s o d ) 。c u 、z n s o d 主要存在于细胞内，相对分子质量约为3 2 0 0 0 ，m n s o d 存在于红细胞外所有细胞的线粒体和细胞液中。在催化超氧阴离子歧化反应过程中，c u 与催化活性直接有关，其反应机理为：s o d - c u ( i i ) + 0 2 一，s o d c u ( i ) + 0 2s o d c u ( i ) + 0 2 一十2 h + 一s o d c u ( i i ) + h 2 0 20 2 一通过与s o d c u ( i i ) 和s o d c u ( i ) 配位而活化，消除了0 2 - 间的静电斥力，加速了0 2 一的歧化反应。本实验结果为总s o d 活力。组织匀浆中s o d 活力的定义：每毫升组织蛋白在l m l 反应液中s o d 抑制率达5 0 时所对应的s o d 量为一个s o d 活力单位( u ) 。组织匀浆s o d 活力( u m g p r o t ) = ( 对照管吸光度一测定管吸光度) 对照管吸光度5 0 反应液总体积取样量( m 1 ) 组织中蛋白含量( m g p r o t m 1 )s o d 活力测定操作方法：按表3 进行操作后，室温放置1 0 分钟，于波长2 2 0 h m 处，l c m 光径比色杯，蒸馏水调零后，比色测定。表3s o d 活性的测定方法2 3 7 5 心肌组织丙二醛( 佃a ) 含量测定( 采用硫代巴比妥酸法)使用丙二醛( m d a ) 试剂盒( 购自南京建成生物制品研究所)原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛( m d a ) 可与硫代巴比妥酸( t b a ) 缩合，形成红色产物，在5 3 2 n m 处有最大吸收峰。m d a 含量计算见公式：组织中m d a 含量( n m o l m g p r o t ) = ( 测定管吸光度一测定空白管吸光度) ( 标准管吸光度一标准空白管吸光度) x 标准品浓度稀释倍数样本的蛋白含量( m g p r o t m 1 )( 注：n m o l m g p r o t 为纳摩尔毫克蛋白，m g p r o t m l 为毫克蛋8 毫升)组织匀浆中m d a 测定操作方法：表4m d a 测定操作方法：漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头扎一小孔，9 5 水浴4 0 分钟，取出后流水冷却，然后每分钟4 0 0 0 转，离心1 0 分钟。取上清，5 3 2 n m 处，i c m 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。2 3 8 组织切片制作以及免疫组化方法2 3 8 1 心肌组织切片h e 染色病理学观察脱腊至水的切片浸入苏木素中3 分钟，水洗。1 盐酸酒精分化片刻，水洗。1 氨水溶液蓝化片刻，水洗。0 5 伊红酒精浸染3 分钟。6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、9 5 、1 0 0 梯度酒精及二甲苯脱水，树胶封片。光镜下观察心肌组织形态学( 心肌纤维、心肌细胞核形态、有无变性坏死、炎细胞浸润等) 变化，并在高倍( 4 0 1 0 ) 视野摄片。2 3 8 2 心肌细胞凋亡的测定采用d n a 末端原位标记法( t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d et r a n s f e r a s em e d i a t e dd i g o x i n - d u t pn i c k e n dl a b e l i n g ，t u n e l 法) ，试剂盒购自南京凯基生物试剂公司。严格按照试剂盒操作，心肌细胞凋亡免疫组化( t u n e l ) 步骤如下：( 1 ) 切片常规脱蜡至水：二甲苯脱蜡3 次，5 分钟次：乙醇水合( 1 0 0 、9 5 、9 0 、8 0 、7 0 ) 每级5 分钟。( 2 ) 通透：将切片浸入含2 0 0 m l0 1 m 的柠檬酸缓冲液( p h6 0 ) 的塑料盒中，置于微波炉中7 5 0 w 处理1 分钟，倾去柠檬酸，迅速加入双蒸水( 2 0 。c ) 冷却至室温，将组织切片转移至p b s ( 2 0 ) 中。1 6( 3 ) 浸入封闭液，室湿( 1 5 2 5 ) 封闭3 0 分钟，p b s 洗2 分钟2 次( 4 ) 每个样本滴加5 0plt d t 酶反应液，加盖玻片3 7 避光湿润反应6 0 分钟( t d t 酶反应液：4 5 弘le q u i 王i b r a t i o nb u f f e r 加1 “lb i o t i n 一王王一d u t p 加4plt d te n z y m e ，需新鲜配制) ，p b s 洗2 分钟3 次，样本周围用吸水纸吸干。( 5 ) 滴加5 0uls t r e p t a v i d i n h r p 工作液，加盖玻片3 7 湿润避光反应3 0 分钟。( s t r e p t a v i d i n h r p 工作液：0 。5i jls t r e p t a v i d i n h r p 加9 9 5 塾lp b s ) ，p b s 洗2 分钟3 次。( 6 ) 滴加5 0ul 一1 0 0uld a b 工作液，室温显色反应1 0 分钟，( d a b 工作液：5ul2 0 d a b 加lul3 0 h 。0 。加9 4plp b s 需新鲜配制) ，p b s 洗2 分钟3 次。( ? ) 苏木精轻度复染，脱水，透甓，封片。显微镜观察。心肌细胞凋亡指数测定：利用日本产c m i s 多功能真彩色图像分析系统光镜下计算心肌细胞凋亡指数( a p o p t o t i ci n d e x ，a i ) 。a i 计算方法：光镜下正常心肌细胞核呈蓝色，缨胞核中有棕黄色颗粒者为翔性细胞，鄂凋亡缨胞。数5 个高倍( 4 0 x1 0 ) 视野，分别每个视野计算凋亡细胞数和总细胞数，a i = ( 视野内凋亡细胞个数视野内所有心肌细胞个数) 1 0 0 。2 。3 8 3 心肌缨胞b c l - 2 、b a x 表达的测定采用s a b c 免疫组化染色法( 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限责任公司) 。严格按照试剂盒操作。心飘细胞b c l - 2 表达免疫组化步骤如下：( 1 ) 切片常规脱蜡至水( 同上) 。( 2 ) 3 0 h ：0 。l 份加蒸馏水1 0 份混合，室温5 1 0 分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3 次。( 3 ) 热修复抗原：将切片浸入0 ，0 1 m 梭橼酸盐缓冲液( p h 6 。0 ) ，微波炉加热至沸猎詹断电，间隔5 分钟后，反复2 次。冷却后p b s ( p h 7 4 ) 洗涤2 次。( 4 ) 滴力h 5 b s a 封闭液，室温2 0 分钟。甩去多余液体，不洗。( 5 ) 滴加适当稀释昭一抗：b c l - 2 抗体( 兔抗大鼠) ，4 过夜。p b s ( p h 7 4 ) 洗2 分钟3 次。( 6 ) 滴加生物素化山羊抗兔i g g ，3 7 c2 0 分钟。p b s ( p h