总蛋白含量测定操作规程.doc

总蛋白含量测定操作规程1 目的 确保口蹄疫灭活疫苗总蛋白含量测定（lowry）操作规程2 范围 适用于口蹄疫灭活疫苗总蛋白量测定。3 责任部门QC部相关检验人员4 内容4.1 准备4.1.1 设备酶标仪(全波长)，“M”型96孔板，卡介苗注射器，单通道和多通道移液器，涡旋震荡仪，酶标板振荡器等。4.1.2 试剂丙酮(分析纯)、无菌去离子水、商品化Lowry法改良试剂盒4.2操作步骤4.2.1 标准系列稀释液制备将商品化试剂盒内标准牛血清白蛋白(2mg/ml母液)，按下表依次稀释。编号123456789母液(l)052550100150200300400去离子水(l)4003953753503002502001000终浓度(g/ml)0251252505007501000150020004.2.2 检验疫苗处理取1瓶疫苗（不少于100ml）恢复至室温摇匀后，在3个1.5 ml离心管中分别精确加入100l疫苗和900l丙酮，充分混匀，室温放置10分钟，在4条件下，以15000 g离心15分钟。吸弃液相，沉淀物用400l丙酮洗涤2次，室温干燥约15分钟，加50l去离子水复溶备用。4.2.3 反应板加样与读数4.2.3.1 各取2.1稀释的各浓度牛血清白蛋白标准溶液40l，以及三重复待检疫苗样品40l，分别加入到96孔板内。用排枪迅速加入200l改良lowry法试剂盒内试剂，立即用振荡器混匀30秒;4.2.3.2 封膜，室温孵育10分钟;4.2.3.3 各孔内分别加入20l 1倍酚试剂(试剂盒内为2倍，用前用去离子水现稀释)，立即用振荡器混匀30秒;4.2.3.4 封膜，室温孵育30分钟;4.2.3.5 酶标仪测定750nm吸光值，保存读数。4.2.4 数据处理根据系列标准蛋白稀释液的浓度(0g/ml2000g/ml)和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值为X轴，以蛋白标准浓度为Y轴，绘制标准曲线，依据趋势线求得多项式，其多项式R20.98。将被检样品的吸光值代入标准蛋白获得的多项式，计算样品中蛋白含量，根据取样量求得1ml样品中蛋白含量。例如口蹄疫灭活疫苗水相/油相比例为1:1，免疫剂量为2ml时，100l疫苗经丙酮沉淀后用50l去离子水复溶，测得浓度即为每头份疫苗中蛋白浓度，或2ml疫苗中蛋白浓度。结果判定时，将测定值除以2即得每毫升疫苗中总蛋白含量。4.2.5 结果判定若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量小于或等于500g，则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定;若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量大于500g，判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定。4.2.6 检测数据处理举例4.2.6.1 收集数据如表所示Value123456789101112A0.1020.1490.3360.5040.8361.1221.3341.7021.923-B0.6771.7220.2521.1162.1671.020-C0.6401.7040.2301.0502.1950.962-D0.6411.7160.2251.0612.1751.012-E-F-G-H-上述表格中，A1-A9为系列稀释的标准牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白浓度依次增高;B、C、D行中1-6列为检测样品750nm吸光值，B1-B6为6批不同批次疫苗样品，每一列为同一疫苗样品三个重复。4.2.6.2 绘制标准曲线:将上表中数据复制到EXCELL表格中，Value123456789OD7500.1020.1490.3360.5040.8361.1221.3341.7021.923蛋白浓度g/ml025125250500750100015002000采用EXCEL程序，选中1-9列对应的两行数据插入散点图，选择带平滑线和数据标记的散点图，得到以750nm吸光值为X轴，以蛋白浓度为Y轴的曲线图。选择图表工具中布局 趋势线其他趋势线选项，选中多项式、显示公式和显示R平方值。通常R平方值大于等于0.98表明标准曲线可信。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。4.2.6.3 数值计算以样品测定OD750值为X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423，Y为蛋白浓度，以表中第一批疫苗测定结果为例。该疫苗三重复测定的OD750数据(X)分别为:0.677、0.640、0.641，代入公式计算蛋白含量(Y)分别为:334g/ml、306g/ml、307g/ml，该数据为每毫升水相抗原中总蛋白含量。计算三重复数值的平均值(AVERAGE)为316g/ml，标准差(STDEV.P)为13.1，变异系数为4.15%(标准差/平均值*100%)，将每毫升水相抗原中总蛋白含量，除以2折算为每毫升疫苗总蛋白含量，该疫苗的总蛋白含量为138g/ml。按照上述方法，可计算其他样品的总蛋白含量。4.2.6.4 结果判定同一样品不同重复间变异系数应小于5.3%，否则试验不成立，应重做。4.3 清场4.3.1 将所有试液、指示剂及相关化学试剂放回原处，并填写理化室化学试剂使用记录。4.3.2