（植物学专业论文）西伯利亚白刺离体培养体系建立及试管苗耐盐性研究.pdf

西伯利亚白刺离体培养体系建立及试管苗耐盐性研究 摘要 西伯利亚白刺隶属于蒺藜科 z y g o p h y l l a c e a e l 刍束l j 属 n i t r a r i al 是典型荒 漠植物 在稳定沙漠 保护绿洲中起着重要的作用 同时 它又是沙生植物中少 有的药食两用的浆果类植物 具有较高的经济利用价值 本研究以西伯利亚白 刺茎段为试材 从探讨最佳外植体取材时间 基本培养基 以及最佳增殖和生 根培养基配方入手 建立起无菌离体培养体系 进而研究n a c i 处理下西伯利亚 白刺试管苗耐盐机理 为西伯利亚白刺种质资源保存和人工繁殖及盐生植物耐 盐机理提供理论依据 研究结果如下 1 以茎段为外植体 首次建立西伯利亚白刺的离体培养体系 外植体采集最 佳时间为5 月底 最佳启动培养基为m s 6 一b a2 0m g l 1 n a ao 5m g l 腋芽 启动萌发率9 1 1 1 继代增殖培养基为m s 6 一b a1 0m g l 1 n a a0 2m g l 增 殖系数高达4 5 3 生根培养基为1 2m s i b ao 5m g l 1 生根率为9 6 6 7 2 以试管苗叶片为外植体 首次通过愈伤组织途径获得了西伯利亚白刺再生 植株 黑暗培养一周后转为光周期培养 最佳诱导愈伤组织培养基为m s 2 4 d 2 0m g l 一 诱导率高达1 0 0 培养2 5 d 愈伤组织相对生长量为4 6 8 31 3 以试管苗为材料 最佳生根培养基附加不同浓度n a c i 0 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0m m o l l 1 随着盐浓度的增加 植株的鲜重 干重以及根冠比呈现先上升后 下降的变化趋势 在5 0m m o l l 1n a c l 处理下 植株的鲜重 干重均比对照明显 增加且为各处理的最大值 说明5 0m m o l l 1 n a c l 有利于白刺试管苗的生长 4 随着n a c l 浓度的增加 试管苗叶片中的可溶性糖和脯氨酸含量呈增加趋 势 叶绿素含量变化呈现先升后降的趋势 在5 0m m o l l 1 n a c l 时达到最大值 而叶片中丙二醛含量则呈现先降后升趋势 在5 0m m o l l j n a c l 时达到最小值 这表明5 0m m o l l 1n a c l 是西伯利亚白刺试管苗生长最适的盐浓度 5 随着n a c l 浓度增加 试管苗地上部和根系n a 离子含量呈现增加趋势 在低浓度时 5 0m m o l l 显著增加 而高浓度时 1 0 0m m o l l 1 增加幅 度不大 地上部k 含量下降而根系k 含量却呈现增加趋势 地上部 根系c a 2 含量降低 白刺试管苗地上部和根系的n a k n a c a 2 比值都呈升高趋势 表明在低盐浓度下 试管苗通过地上部积累n a 离子降低渗透势 适应盐环境 而在高盐浓度时根部积累一定的k 对n a 起到拮抗作用 减少高浓度盐的伤害 总之 本研究建立了西伯利亚白刺离体培养体系 明确了5 0m m o l l 1n a c l 是其试管苗生长的最适盐浓度 探讨了在n a c l 胁迫下 白刺试管苗主要通过 n a k 离子积累参与渗透调节的耐盐机理 关键词 西伯利亚白刺 组织培养 试管苗 n a c l 渗透调节 离子 e s t a b l i s h m e n to fn i t r a r i as i b i r i c ap a l l t i s s u ec u l t u r es y s t e ma n d r e s e a r c ho ni t ss a l tt o l e r a n c em e c h a n i s m a b s t r a c t n i t r a r i as i b i r i c ap a l l i sas p e c i e so f z y g o p h y l l a c e a ei nn i t r a r i ag e n u s w h i c hi s a ni m p o r t a n tk i n do ft r e es p e c i e st oc o n t r o ls a n d n o t o n l yi t sf r u i t sh a v eh i g h e r e c o n o m i cv a l u e b u ta l s o s i b i r i c ap a l l p l a y sa ni m p o r t a n tr o l eo nl o c a l e n v i r o n m e n t p r o t e c t i o n i nt h i ss t u d y at i s s u ec u l t u r es y s t e mo f n s i b i r i c ap a l l w a s e s t a b l i s h e db yi t ss t e r n t h e nw ed i s c u s s e dt h em e c h a n i s mo f p l a n ts a l tr e s i s t a n c eo f s i b i r i c ap a l l t e s t t u b ep l a n t l e t h o p i n gt oo f f e rs o m er e f e r e n c e sf o rt h et i s s u e c u l t u r ea n dt h em e c h a n i s mo fs a l tr e s i s t a n c eo ft h es a l tp l a n t t h em a i nr e s e a r c h c o n c l u s i o n sw e r es h o w e da sf o l l o w 1 i ti st h ef i r s tt i m et h a tat i s s u ec u l t u r es y s t e mo fn s i b i r i c ap a l l w a s s u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e db yi t ss t e ms e c t i o n m a ym i d d l ei st h eb e s tt i m ew h e n e x p l a n t sa r ec o l l e c t e d t h eo p t i m a lm e d i u mf o ri n d u c i n ga d v e n t i t i o u sb u d sf r o ms t e m e x p l a n t sw a sm s 6 一b a2 0 m g l 以 n a a0 5m g l t h er a t eo fg e r m i n a t i o nw a s 91 11 t h eo p t i m a lm e d i u mf o rs u b c u l t u r ec u l t u r ew a sm s 6 b a1 0m g l 1 n a a 0 2m g l t h em u l t i p l i c a t i o nc o e f f i c i e n t sw a s4 5 3 t h eo p t i m a lm e d i u mf o rr o o t i n g c u l t u r ew a s1 2 m s i b a0 5m g l t h er a t ew a s9 6 6 7 2 t h ec a l l u sf o r m a t i o na n d p l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mw e r ee s t a b l i s h e db yt h e l e a fo ft e s t t u b ep l a n t l e t a n di ti sa l s ot h ef i r s tt i m e c u l t u r e do n ew e e ki nt h ed a r k t h e nc h a n g e di nt h ep h o t o p e r i o do f14h loh t h eo p t i m a lm e d i u mf o rc a l l u s f o r m a t i o nw a sm s 2 4 d2 0m g l 一 t h ef o r m a t i o nr a t e sw a s10 0 t h er e l a t i o n g r o w t ha m o u n tw a s4 6 8 31 a f t e r2 5d a y s 3 n a c i 0 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0m m o l l 叫 w a sa d d e di nt h eo p t i m a lr o o t i n gc u l t u r e m e d i u m s i b i r i c ap a l l st e s t t u b ep l a n t l e tw e r eg r o w ni nt h e s em e d i u m s w i t ht h e i n c r e a s eo fn a c lc o n c e n t r a t i o n f r e s hw e i g h t d r i e dw e i g h ta n dr o o t s h o o tr a t e sw e r e f i r s t l yi n c r e a s e da n dt h e nd e c r e a s e d u n d e r5 0m m o l l n a c l t e s t t u b ep l a n t l e t s f l e s hw e i g h ta n dd r i e d w e i g h tw e r em o r eh i g h e rt h a no t h e r s i ts h o w e d t h a t5 0 m m o l l n a c lw a st h eb e s ts a l tc o n c e n t r a t i o nf o rt h eg r o w t ho ft e s t t u b ep l a n t l e t 4 w i t ht h ei n c r e a s eo fn a c lc o n c e n t r a t i o n c o n t e n t so fs o l u b l es u g a r p r o l i n e w e r ei n c r e a s e d m e a n w h i l et h ec o n t e n t so fc h l o r o p h y l lw e r ef i r s t l yi n c r e a s ea n dt h e n d e c r e a s e d a n dh a v et h em a x i m u mv a l u eu n d e r5 0m m o l l n a c l t h ec o n t e n to f m d ai nt h el e a fw e r ef i r s t l yd e c r e a s ea n dt h e ni n c r e a s e d a n dh a v et h em i n i m u m v a l u eu n d e r5 0m m 0 1 l n a c l t h e s es h o w e dt h a t5 0m m 0 1 l 1n a c li st h eb e s ts a l t c o n c e n t r a t i o nf o rt e s t t u b ep l a n t l e tg r o w i n g 5 w i t ht h ei n c r e a s eo fn a c lc o n c e n t r a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no fn a i ns h o o ta n d r o o tw e r ei n c r e a s e d u n d e rl o wc o n c e n t r a t i o n 5 0m m o l l 1 n a c l r a p i d l y i n c r e a s e d b u tu n d e rh i g hc o n c e n t r a t i o n 10 0 m m o l l 以 n a c l i n c r e a s e ds l o w l y m e a n w h i l ec o n c e n t r a t i o no fk i ns h o o tw a sd e c r e a s e b u tc o n c e n t r a t i o no fk i nr o o t w a si n c r e a s e da n dc o n c e n t r a t i o no f c a 2 i ns h o o ta n dr o o tw e r ed e c r e a s e da n d n a k n a c a 2 i ns h o o ta n dr o o tw e r ei n c r e a s e d t h e s es h o w e dt h a tl o w c o n c e n t r a t i o nn a c l n a 十r a p i d l yi n c r e a s e di ns h o o ti no r d e rt oa d a p t i n gt os a l ts t r e s s b u th i g hc o n c e n t r a t i o nn a c l k i n c r e a s e di nr o o tt oa n t a g o n i z en a i no r d e rt oa v o i d s a l td a m a g e i nc o n c l u s i o n i nt h ee x p e r i m e n t at i s s u ec u l t u r es y s t e mo f n s i b i r i c ap a l l w a s e s t a b l i s h e d i ti n d i c a t e dt h a t5 0m m 0 1 l 1n a c lw a st h eb e s ts a l tc o n c e n t r a t i o nf o rt h e g r o w t ho ft e s t t u b ep l a n t l e tg r o w i n g a n dd i s c u s s e dt h a tu n d e r n a c ls t r e s s t h e m e c h a n i s mo fs a l tt o l e r a n c et h et e s t t u b ep l a n t l e to f n s i b i r i c ap a l l u s e db y a c c u m u l a t i o no fn a k k e y w o r d s n i t r a r i as i b i r i c ap a l l t i s s u ec u l t u r e t e s t t u b ep l a n t l e t n a c i c a t i o n o s m o t i ca d j u s t m e n t 缩写词 6 b a 2 4 一d m a n a a m s b 5 w p m p h c h l m d a p r o 本文所使用的缩略词表 l i s to fa b b r e v i a t i o n 英文名称 6 b e n z y l a d e n i n e 2 4 d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d i n d o l eb u t y r i ca c i d a n a p h t h a l e n c a c e t i ca c i d m u r a s h i n ga n ds k o o g 19 6 2 m e d i u m g a m b o r g 19 6 8 m e d i u m w o o d y p l a n tm e d i u m h y d y o g e n i o n c o n c e n t r a t i o n c h l o r o p h y l l m a l o n d i a l d e h y d e p r o l i n e 中文名称 6 一苄基腺嘌呤 2 4 一二氯苯氧乙酸 吲哚丁酸 a 一萘乙酸 m s 基本培养基 b 5 基本培养基 w p m 基本培养基 酸碱度 氢离子浓度 叶绿素 丙二醛 脯氨酸 原创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 除本文已经注明引用的内容外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也 不包含为获得内墓直太堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 至墨叠 1 5 1 期 圣壁 l 厶 1 6 指导教师签名 i 茑善差垫 e t 期 口垒g l f 鱼 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 即 内蒙古大学有权将 学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构 部门送交学位论文的复印件和磁盘 允 许编入有关数据库进行检索 也可以采用影印 缩印或其他复制手段保存 汇编学位论文 为保护学院和导师的知识产权 作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学 作者今后 使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果 须征得内蒙古大学就读期间导师的同意 若用 于发表论文 版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表 学位论文作者签名 墨盎餐 指导教师签名 e t期 皇壁竺 叁 受e t 期 西伯利亚白刺离体培养体系建立及试管苗耐盐性研究 1 引言 白刺属 n i t r a r i al 植物隶属于蒺藜科 z y g o p h y l l a c e a e 为旱生或超旱生落叶灌木 全世 界有白刺属植物1 1 种 我国有6 种和1 变种 主要生长于沙漠 盐渍化沙地 海滨盐碱沙地等 内蒙古分布有西伯利亚白刺 s i b i r i c ap a l l 唐古特白刺 t a n g u t o r u mb o b r 球果白刺 n s p h a e r o c a r p am a x k n 和齿叶自刺 mr o b o r o w s k i ik o m 4 种 1 1 白刺能积沙而形成白刺沙堆 即 白刺包 由于该属植物特殊的适应性 成为改良盐碱地 防风固沙和治理荒漠的理想植 物之一 在内蒙古西部沙地 荒漠和盐渍化土地上成为重要的建群种或优势种 白刺浆果中 富含多种维生素和氨基酸 具有较高的药用和食用价值 种子可榨油 嫩枝叶可作饲料并可 入药 具有广阔的开发利用前景 白刺属植物以有性繁育为主 也可以茎段扦插繁殖 迄今 有关白刺组培快繁的报道多以唐古特白刺 2 为主 而有关西伯利亚白刺组培快繁少有报道 木本植物具有生命周期长 遗传杂合率高等性质 许多木本植物组织培养过程中存在着难以 解决的外植体褐变 试管苗玻璃化和生根难等现剩3 1 而且在组织培养过程中多以茎段为外 植体获得再生植株 因此 深入研究西伯利亚白刺快繁技术对野生白刺资源良种选育及资源 开发具有十分重要的现实意义 木本植物的组织培养过程中 通过愈伤组织再生植株较难 但通过愈伤组织或胚状体培 养途径来诱导多倍体植株和筛选突变体 可以大大加快育种进程 4 1 曹有龙 5 采用枸杞花药进 行离体培养 建立细胞系 诱导了植株再生 s h a i l j at r i v e d i t 6 筛选小麦耐盐性的愈伤组织 目前仅有张红晓 2 1 用唐古特白剌叶片和茎段诱导愈伤组织 叶片诱导率较高 并且在分化过 程中仅分化出根未分化出芽 因此 对白刺愈伤组织培养的研究 不仅为今后白刺优良无性 系的扩繁创造条件 也为试管苗染色体加倍及抗性突变体筛选打下一定的基础 本研究拟以茎段作为外植体获得再生体系 再利用试管苗叶片诱导愈伤组织 经过愈伤 组织分化产生再生植株 目的是建立西伯利亚白刺离体快繁体系 同时白刺也是重要蒙药植 物锁阳的寄主 本研究获得的西伯利亚白刺试管苗 可以为在离体条件下研究锁阳和白刺的 寄生关系提供技术支持 植物按其对盐分环境的反应分为盐生植物和非盐生植物 盐生植物是一类能够在盐渍土 壤上正常生长并完成其生活史的植物 其最大特点是具有较强的耐盐能力 盐生植物对盐有 响应规律 在低盐浓度下促进生长 有一最适生长盐度 高于这个盐度时生长被抑制 7 盐 生植物对盐胁迫的适应性反应是一个非常复杂的生理生态学问题 形态解剖结构 生理生化 的变化等都是紧密联系在一起的 是综合性的反应 当盐浓度超过抗盐阈值时 也会对盐生 植物产生胁迫 盐胁迫可以引起细胞质膜透性增大 膜脂过氧化程度加剧 电解质外渗 电 内蒙古大学硕士学位 毕业 论文 解质渗透率反映了细胞受盐胁迫伤害的程度 r 萄k u m a rs a i r a m 等人 8 对盐胁迫下小麦耐盐性 相关生理指标的分析表明 电解质渗透率反映了小麦耐盐性的强弱 其变化可作为小麦耐盐 性鉴定指标 王瑞刚 9 发现耐盐性不同的杨树其电解质渗透率和膜脂过氧化产物m d a 均差异 显著 盐胁迫可以打破植物的营养平衡 抑制其它元素的吸收和转运 改变植物细胞内离子 的浓度和种类 导致膜完整性的破坏和某些酶功能的降低 它们都与盐胁迫下植株对离子 n 矿 k 的吸收有着直接或间接的关系 植物的耐盐性主要取决于根系对离子的选择性吸 收和盐分在器官 组织和细胞层次上的区域化分布 降低地上部盐浓度是植物耐盐的重要机 理之一 但不同耐盐性的植物的耐盐机理是不同的 l o 耐盐植物的耐盐作用主要表现在对n 矿 k 的选择性吸收和运输方面 耐盐植物根系对n 矿 k 的选择吸收较强 根系拒n a 吸收k 的能力和向地上部运输c 的能力均大于盐敏感品种 有利于植株的正常生长 l l 李伟强等 1 2 1 研究表明 盐生植物碱蓬从生境中吸收的n 矿可以在地上部重新分配和再转运 从而适应盐环 境 有些盐生植物在缺少n a 时不能完成生活史 1 3 说明n a c i 对盐生植物生长发育的必要性 目前关于盐生植物的耐盐性研究大多以盆栽苗为试材 而本研究是以西伯利亚白刺试管 苗为材料 在离体培养条件下 通过研究不同n a c l 浓度下试管苗的形态指标 生理指标和离 子含量的变化 确定试管苗最适生长盐浓度 以及盐胁迫对试管苗质膜透性 膜脂过氧化产 物m d a 有机溶质及离子含量变化的影响 探讨n a c l 胁迫下对西伯利亚白刺试管苗的耐盐 性 为培育 开发优良西伯利亚白刺的耐盐品种提供理论依据 2 西伯利亚白刺离体培养体系建立及试管苗耐盐性研究 2 试验材料与方法 2 1 西伯利亚白刺离体培养体系的建立 2 1 1 植物材料 西伯利亚白刺 n i t r a r i as i b i r i c ap a l l 采自内蒙古自治区鄂尔多斯市杭锦旗 2 1 2 试剂与仪器 6 b a n a a m a 南京博尔迪 9 8 蔗糖 天津市化学试剂三厂分析纯 琼脂 南京博尔迪日本进口分装b a c t e r i o l o g i c a lg r a d e 超声波清洗器 k q 2 5 0 v 远红外恒温干燥箱 y h w 1 1 0 3 超纯水仪 m i l l i p o r e e l i x5 移液枪 f i n n p i p e f f e 酸度计 s a r t o r i u sp b 一1 0 天平 s a r t o r i u sb t1 2 4 s b t2 2 0 2 s 恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦0 3 2 电热板 l a bt e c he g 3 5 a 三角瓶 天玻l o o m l 高压灭菌锅 y x q l s 3 0 si i 超净工作台 博迅s w c j 2 f d 光照培养箱 m g c 3 0 0 b 2 1 3 试验方法 初代培养基和继代培养基附加3 蔗糖 生根培养基附加1 5 蔗糖 每升培养基添加6g 琼脂 p h 为5 8 0 在容量为1 5 0m l 的三角瓶中装入5 0m 1 培养基 1 2 1 1 0 6k g c m 2 高温高压灭菌2 0m i n 光照培养箱中培养 培养温度为2 5 1 光照周期昼夜为1 4h 1 0h 光照强度3 6 4 0um o l m 2 s 1 筛选最佳初代培养基 初代培养时研究了不同基本培养基 不同取材月份的外植体对西伯利亚白刺茎段启动培 养的影响 基本培养基选择m s b 5 w p m 培养基中均附加2 0m g l 1 6 b a 和o 5 m g l 1 n a a 探讨基本培养基对白刺启动培养的影响 运用上述试验筛选出的适宜基本培养基附加2 0m g l 1 6 一b a 和o 5m g l 1 n a a 选择不 同月份的外植体作对比试验 材料的预处理 取不同月份的带芽茎段切成长4 5c m 先在加有l 洗涤灵的洗涤液中 漂洗5m i n 用毛刷轻刷枝条 再用自来水冲洗2 0m i n 移至超净工作台上 用7 0 乙醇振 荡灭菌3 0s 后 迅速用无菌水冲洗3 次 接着用o 1 h g c l 2 溶液振荡灭菌6m i n 再用无菌 水振荡清洗5 次 并用无菌滤纸吸干表面水分 切去两端消毒液接触渗透的部分 然后将外 植体剪成1 5 2 0c m 长的单芽茎段 以备接种用 每种培养基接种4 5 个外植体 接种后3 0d 观察其生长状况并统计相关数据 3 内蒙古大学硕士学位 毕业 论文 启动率 萌发出新芽或侧枝伸长的外植体数 外植体总数 1 0 0 污染率 接种污染数 接种个数x1 0 0 死亡率 未污染死亡数 未污染总数x1 0 0 褐化率 未污染褐化数 未污染总数 1 0 0 2 筛选最佳继代增殖培养基 初代培养所获得的芽苗数量有限 还需进一步继代扩大繁殖 才能发挥组织培养快速繁 殖的优势 培养材料为初代培养获得的幼年材料的启动单苗或丛生芽 基本培养基为m s 生长调 节物质为6 b a 和n a a 筛选最佳增殖培养基 探求适宜的激素种类及配比的效果 表1 每种培养基接种3 0 个外植体 接种后3 0d 观察其生长状况并统计相关数据 增殖系数 增殖后有效芽数 接种外植体数 出愈率 产生愈伤组织的外植体个数 接种的外植体个数x1 0 0 出愈率是指埋入培养 基的茎段基部长出愈伤组织 表l 西伯利亚白刺增殖培养激素配比方案 t a b l e1s c h e m eo ff o r m u l ef o rg r o w i n ga n dr e g u l a t i n go ns u b c u l t u r eo fn s i b m c ap a l l 3 筛选最佳生根培养基 取增殖培养的芽苗转接于生根培养基 进行生根诱导以获得完整再生植株 基本培养基 为1 2 m s 大量元素减半 生长调节物质为i b a o 1 0 5 1 0m g l 1 每种培养基接种3 0 个外植体 统计内容为生根时间 生根率 平均每株生根数 生根效果从生根时间 生根百分率 每株生根数考察 生根培养4 0 d 观察统计生根百 分率 记录每株生根数 4 炼苗移栽 基质 蛭石 基质处理 1 2 1 高温高压灭菌3 0m i n 在生根培养3 0d 后 试管苗已具备了发达 健壮的根 苗茎基部半木质化时 即可移栽 4 堕堡型垩皇型堕箜苎鲞竺墨塞塞墨苎笪堕塑垫丝堑塞 将生长健壮的试管苗在自然光照下炼苗4d 再开盖炼苗3d 移栽前在培养瓶中倒入少许清水 将培养基浸软 以减少试管苗根系损伤 然后用镊子轻轻取出带根小苗 用清水洗净根部附 着的培养基 将根系小心展开 移栽到蛭石中 2 1 4 数据分析 试验所得数据用e x c e l 进行处理 得到平均值 标准差 下同 2 2 西伯利亚白刺叶片愈伤组织的诱导 2 2 1 植物材料 生根培养后得到西伯利亚白刺试管苗幼嫩平展叶片 2 2 2 试剂与仪器 2 4 d 南京博尔迪 9 8 其他试剂和仪器同2 1 2 2 2 3 试验方法 愈伤组织诱导培养基 增殖培养基和分化培养基均以m s 为基本培养基 附加3 蔗糖 生根培养附加1 5 蔗糖 每升培养基添加6g 琼脂 p h 为5 8 6 0 在容量为1 5 0m l 的三角 瓶中装入5 0m 1 培养基 1 2 1 高温高压灭菌2 0m i n 光照培养箱中培养 培养温度为2 5 1 暗培养时将培养瓶放于纸盒内并用黑布覆盖 光照周期昼夜为1 4h 1 0h 光照强度3 6 4 0 lm 0 1 m 2 s 1 筛选最佳愈伤组织诱导培养基 取生根培养后的健壮试管苗幼嫩平展叶片 切成o 5 1c m 大小 沿近轴端用剪刀剪和5 个切口 以背面向下平放于诱导培养基上培养 确保每个切口都接触到培养基 黑暗培养一 周后 转为光周期培养 每个处理接种4 5 个外植体 培养2 5 d 时统计愈伤组织诱导率和枯叶 率 计算相对生长量 愈伤组织诱导率 诱导出愈伤组织的外植体块数 接种的外植体块数x1 0 0 枯叶率 枯叶块数 接种时叶块数x1 0 0 进行生长量测定时每处理接种前 用电子天平称量装有培养基的三角瓶 接种后再称量 1 次 二者相减即得初始质量 w 1 培养2 5d 时将每瓶愈伤组织取出称量 得收获质量 w 2 愈伤组织的相对生长量按下式计算 相对生长量 w 面2 广w 1 x1 0 0 重量以鲜重表示 本试验以m s 为基本培养基 2 4 d 浓度设计了1 0 2 0 3 0 4 0m g l 1 四个水平 筛 选最佳愈伤组织诱导培养基 5 堕矍直奎堂堡主兰垡 里些 笙苎 2 愈伤组织的增殖培养 诱导培养3 0 d 后 将愈伤组织再切成o 5c m 3 的小块 转移到最佳愈伤组织诱导培养基中 对其进行传代 以便获得更多的愈伤组织 培养温度为2 5 1 光照周期1 4h 1 0h 光照 强度3 6 4 0l am 0 1 m 2 s 4 分化培养 将生长状况良好的愈伤组织转接到m s 6 b a 2 0m g l 1 n a a 0 5m g l 1 诱导愈伤组织 分化出不定芽 培养温度为2 5 4 i c 光照周期昼夜为1 4h 1 0h 光照强度3 6 4 0l am o l m 2 s 5 生根培养 由愈伤组织分化出来的不定芽 待其长到2 3 c m 时 沿基部切下 接种到培养基 1 2 m s i b a m g l 1 上进行生根培养 培养温度为2 5 1 光照周期昼夜为1 4 h 1 0 h 光照强度3 6 4 0 um 0 1 r n 2 s 一 2 3 西伯利亚白刺试管苗耐盐性初步研究 2 3 1 植物材料 西伯利亚白刺试管苗 2 3 2 试剂与仪器 n a c l 天津市化学试剂三厂分析纯 离心机 b e c k m a nx 1 5 r 紫外分光光度计 s h 讧a d z uu v 2 4 5 0 电导率仪 m e t t l e rs g 7 天平 s a r t o r i u sb t l 2 4 s 原子吸收 光谱仪 a a 一6 7 0 漩涡混合器 x w 二8 0 a 其他试剂和仪器同2 1 2 2 3 3 试验方法 在最适生根培养基 1 2 m s i b a 0 5m g l 1 中添加不同浓度的n a c l o 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0m m o l l 1 将在1 2 m s i b a 0 5m g l 1 生根生长3 0 天左右的试管苗 切成带两个芽的茎 段 分别接种于添加不同浓度n a c l 的培养基中 每一处理接种3 0 个外植体 1 生长指标的调查 接种后调查试管苗的生根时间 接种4 0d 后统计生根率 生根数 并记录白刺死亡情况 计算不同浓度n a c l 胁迫下白刺的存活率 接种4 0d 后 在培养瓶中倒入少许清水 将培养 基浸软 以减少试管苗根系损伤 然后用镊子轻轻取出带根小苗 用清水洗净根部附着的培 养基 滤纸吸干水分 各处理的植株分成地上部和地下部 量取最长根长 茎长并分别称得 鲜重 再将新鲜样品材料置1 0 5 c 烘箱中杀青1 0m i n 转至6 0 烘至恒重 称得干重 得到 生物量和根冠比 根冠比 根重 地上部重 6 西伯利亚白刺离体培养体系建立及试管苗耐盐性研究 相对含水量 r w c 1 4 堡譬 1 2 叶绿素含量的测定 取培养4 0d 的试管苗叶片 下同 准确称取o 2g 将叶片剪成宽度小于lm i l l 的细丝 混匀 放入具塞试管中 加入无水乙醇 丙酮混合液 1 1 1 0m l 使叶片完全浸入液体中 加盖 室温下放在暗处浸提 当叶片完全变白时即可比色 将色素提取液倒入比色杯中 分别于6 6 3 和6 4 5 姗下比色 分别记录其o d 值 参考沈伟划1 5 1 的方法计算叶绿素a b 及总叶绿素含 量 3 叶片脯氨酸含量的测定 称取各处理的叶片材料0 1g 用3 磺基水杨酸5m 1 研磨提取 匀浆移至离心管中 在 沸水浴中提取1 0m i n 冷却后 3 0 0 0 印m 离心1 0m i n 取上清液2m l 加入2m l 蒸馏水 2 m l 冰醋酸和2 5 酸性茚三酮4m l 沸水浴显色1h 冷却后 加入4m l 甲苯盖好盖子在漩 涡混合仪上振摇o 5m m 静置分层 吸取红色甲苯层于波长5 2 0m 测定o d 值 从标准曲 线查脯氨酸含量 按侯彩霞 1 6 的方法计算叶片中脯氨酸含量 4 叶片丙二醛 m d a 含量的测定 称取各处理的叶片材料o 2g 将其剪碎 加入5 t c a 5m l 充分研磨 匀浆液在3 0 0 0 印m 下离心1 0m i n 取上清液2m l 加0 6 7 t b a 2m l 混匀 在试管上加盖塞 置于沸水 浴中煮沸3 0m i n 迅速冷却 再离心1 次 取上清液测定在4 5 0m 5 3 2 衄和6 0 0 衄处的 o d 值 按t 觚d 1 7 的方法计算m d a 的含量 5 可溶性糖含量的测定 蒽酮比色法 称取各处理的叶片材料0 2g 将其剪碎 分别放入具塞试管中 加入5m l 蒸馏水 于沸 水中提取3 0m i n 提取2 次 提取液过滤并反复漂洗试管及残渣 定容至2 5m l 吸取样品 提取液o 5m l 加蒸馏水1 5m 1 再加入0 5m l 葸酮乙酸乙酯试剂和5m l 浓硫酸 充分振荡 立即将试管放入沸水浴中 逐管均准确保温1m i n 取出后自然冷却到室温 在6 3 0 衄波长 下测样品的吸光度 按梁超 1 8 的方法计算可溶性糖含量 6 细胞质膜透性 参照d i o m s i o s e s e 的方法 19 1 分别取各处理幼苗叶片0 2g 置于试管中 加入l om l 去 离子水 将试管放入真空干燥器内抽气1 0m i n 除去水与叶片表面和细胞间隙的空气 使叶 片组织内电解质易渗出 室温下保持3 0m i n 间隔几分钟振荡1 次 用电导仪测外渗电导值 l 1 然后将材料放入沸水中煮5r a i n 以杀死组织 使质膜完全破坏 待冷却至室温后测 7 内蒙古大学硕士学位 毕业 论文 定外渗电导值 l 2 每处理重复3 次 按下式计算相对电导率 相对电导率 鲁 1 0 0 l 2 7 离子含量的测定 采用原子吸收光谱法 将培养4 0d 试管苗的地上部和地下部分别取样 经1 0 5 杀青1 0 m i n 转至6 0 c 烘干至恒重 粉碎过6 0 目筛 分别取o 1 9 用浓硝酸和高氯酸 5 1 消化 去离子水定容后 用a a 6 7 0 原子吸收光谱仪 按邓勃 2 0 1 的方法测定n a k c a 2 m 矿 离子含量 每项指标测定为3 次重复 2 4 西伯利亚白刺愈伤组织耐盐性研究 2 4 1 植物材料 西伯利亚白刺试管苗的叶片 2 4 2 试剂与仪器 n a c l 天津市化学试剂三厂分析纯 其他试剂和仪器同2 1 2 2 4 3 试验方法 在最佳愈伤组织诱导培养基 m s 2 4 d2 0m g l 1 中分别添加0 2 5 5 0 1 0 0 2 0 0 m m 0 1 l 1n a c l 在超净台上 取生根培养后的健壮试管苗幼嫩平展叶片 切成o 5 1c m 2 大小 沿近轴 端用剪刀剪4 5 切口 背面向下平放于诱导培养基上培养 确保每个切口都接触到培养基 黑暗培养一周后转光周期培养 每个处理接种1 0 个外植体 重复3 次 培养2 5 d 时统计愈伤 组织产生的时间 出愈率和枯叶率 相对生长量 枯叶率 枯叶块数 接种时叶块数 1 0 0 出愈率 有愈伤组织的叶块数 接种叶块数x1 0 0 进行生长量测定时每处理接种前 用电子天平称量装有培养基的三角瓶 接种后再称量 1 次 二者相减即得初始质量 w 1 培养2 5d 时将每瓶愈伤组织取出称量 得收获质量 w 2 愈伤组织的相对生长量按下式计算 相对生长量 w 面2 广w 1 1 0 0 重量以鲜重表示 8 西伯利亚白刺离体培养体系建立及试管苗耐盐性研究 3 结果与分析 3 1 西伯利亚白刺茎段离体培养 3 1 1 不同基本培养基对白刺茎段启动培养的影响 将灭菌的西伯利亚白刺 即白刺 的单芽茎段分别接种到p i m s 6 一b a 2 0 m g l 1 n a a 0 5 m g l p 2 b 5 6 b a2 0 m g l 1 n a a0 5 m g l 1 p 3 w p m 6 一b a2 0 m g l 1 n a a0 5 m g l 1 筛选最佳的初代培养基 带芽茎段在初代培养基上培养2 3d 后 腋芽开始萌动 并不断伸 长 表2m s b 5 w p m 培养基对白刺茎段启动培养的影响 t a b l e2e f f e c t so fm s b 5 w p mm e d i u m so ns t e mc u l t u r eo f n s i b i r i c ap a l l 由表2 可以看出 白刺带芽茎段在m s 基本培养基上腋芽启动率最高 图版1 高达 9 1 1 1 且培养3 0d 后芽长为4 3 7c m 并且生长状况均比b 5 w p m 好 这表明 m s 培 养基较b 5 w p m 培养基更适合白刺茎芽启动和生长 3 1 2 取材时间对培养效果的影响 取材月份对培养效果有显著的影响 本试验分别于2 0 0 6 年8 月 2 0 0 7 年4 月 5 月 8 月和1 0 月进行重复试验 从表3 可以看出 在4 月份取材 消毒比较困难 所接种的外植体 全部染菌 图版2 可能是因为4 月取的材料不是当年新生枝条 病原微生物已经侵入表皮内 按常规消毒时间 不能够彻底达到灭菌效果 5 月和8 月份取材 都为当年生的新枝条 尤 以5 月底初接种的材料最佳 在此期间 褐化率仅有4 4 4 死亡率也仅有8 8 9 而1 0 月 份取的材料 接种后其褐化率 污染率和死亡率都很高 可能因为生长时间长 粘附菌类的 机会要多些 在试验过程中还发现 5 月和8 月份接种外植体 消毒时间非常关键 时间过 长容易使外植体死亡 时间过短达不到消毒的效果 根据预试验7 0 乙醇消毒3 0s h g c l 2 溶液消毒6m i n 为最佳 不过外植体一旦启动后 生长速度加快 长势旺盛 能很快建立无 菌体系 9 内蒙古大学硕士学位 毕业 论文 表3 取材月份对外植体成活的影响 t a b l e3e f f e c t so fd i f f e r e n tm o n t h so nt h ee x p l a n ts u r v i v i e so fn s i b i r i c ap a l l 总体来说 采自新生枝条的外植体比采自老枝的生长状况好 因为处于生理状态早期的 幼嫩材料具有较高的细胞分裂能力 因而生长速度快 外植体成活率高 成熟度高的外植体 因其分裂能力降低 所以植株生长缓慢 而且继代过程中容易褐化 但实验材料过于幼嫩成 活率也很低 生长缓慢 容易黄化 3 1 3 继代增殖培养 以m s 为基本培养基 根据预试验 把n a a 固定在o 2m g l 1 浓度条件下 研究不同浓 度的6 b a 对白刺继代增殖的影响 进而筛选出最佳的增殖培养基 表4 不同浓度的6 b a 对西伯利亚白刺继代增殖的影响 t a b l e4e f f e c t so fd i f i e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f6 b ao nt h es u b c u l t u r eo f s i b i r i c ap a l l 由表4 可以看出 不同浓度的6 b a 对白刺继代增殖的效果不同 6 b a 浓度为1 0m g l 1 时 可获得较多的有效无菌苗 增殖系数为4 5 3 并且接种3 0d 后芽平均高度高达3 0 4 0 c m 试管苗长势好 图版3 在6 b a 浓度为o 5m g l 1 时 茎段底部愈伤组织增多 图版4 对茎 芽的生长不利 接种3 0 d 后芽平均高度仅为1 啦 5c m 在6 b a 浓度为1 5 2 0m g l 1 时 增殖系数较6 b a1 0m g l 1 浓度时分别降低了4 7 9 0 和3 9 9 6 由此可见 6 b a 与n a a 两者的比例决定着芽的增殖情况 一般来说 要求6 b a n a a 的绝对量达到某一水平时 随着生长素 细胞分裂素比值减小 越利于芽的增殖 结果表明 继代增殖以培养基m s 6 一b a l 0m g l o n a a o 2m g l 1 为最佳 1 0 西伯利亚白刺离体培养体系建立及试管苗耐盐性研究 3 1 4 生根培养 用白刺继代苗茎段进行生根培养 使用的培养基激素浓度配比及培养4 0d 的生根试验结 果见表5 图l 3 表5 不同浓度i b a 对白刺试管苗生根的影响 t a b l e5e f