实验：总维生素C的测定—2,4-二硝基苯肼比色法.doc

实验：总维生素C的测定2，4-二硝基苯肼比色法一、实验目的1.了解天然维生素C 的结构功能以及天然存在形式。2.掌握测定总维生素C 的原理与方法。二、实验原理总抗坏血酸包括还原型Vc、脱氢型Vc 和二酮古龙糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4 -二硝基苯肼作用生成红色脎。脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，由此通过比色可对样品中总坏血酸进行定量。三、仪器和试剂仪器：恒温水浴锅（370.5）、紫外-可见分光光度计、组织捣碎机。试剂：本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。1、4.5mol/L 硫酸：小心将250mL 硫酸(比重1.84)加入到700mL 水中，冷却后用水稀释至1000mL。2、(9+1)硫酸：小心将900mL 硫酸(比重1.84)加入到100mL 水中，搅拌均匀。3、2% 2，4-二硝基苯肼溶液(20g/L2，4 -二硝基苯肼溶液)：溶解2g 2，4 - 二硝基苯肼于100mL 4.5mol/L 硫酸内，过滤使用（不用时存于冰箱内，每次用前过滤）。4、2%草酸溶液(20g/L草酸溶液)：溶解20g 草酸()于700mL 水中，再加水稀释至1000mL。5、1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)：稀释500mL 2%草酸溶液到1000mL。6、1%硫脲溶液(10g/L硫脲溶液)：溶解5g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。7、2%硫脲溶液(20g/L硫脲溶液)：溶解10g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。8、1mol/L 盐酸：取100mL 盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。9、抗坏血酸标准溶液(1mg/mL)：溶解100mg 纯抗坏血酸于100mL 1%草酸中。10、活性炭：将100g 活性炭加到750mL 1mol/L 盐酸中，水浴回流1-2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（）为止，然后置于110烘箱中烘干。检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾（20g/L亚铁氰化钾）与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。四、操作步骤（全部实验过程应避光）(一)样品的测定1.浸提：鲜样的制备：称100g 鲜样和100g 2%草酸溶液(20g/L草酸溶液)，倒入捣碎机中打成匀浆，取10-40g 匀浆(含1-2mg 抗坏血酸)倒入100mL 容量瓶中，用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)稀释至刻度，混匀。将浸提液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。干样制备：称1-4g 干样(含1-2mg 抗坏血酸)放入乳钵内，加入1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)磨成匀浆，倒入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)稀释至刻度，混匀。将浸提液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。2.氧化处理：取25mL 上述滤液，加入2g 活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL 此氧化提取液，加入10mL 2%硫脲溶液(20g/L硫脲溶液)，混匀（得到样品氧化液）。3.呈色反应：编号123样品氧化液/ml4442% 2，4 -二硝基苯肼溶液/ml-11加盖在370.5水浴保温3h，3h后取出，除空白管外，所有试管放入冰水中2% 2，4 -二硝基苯肼溶液/ml1-1号管在室温中放置1015min 后放入冰水内(9+1)硫酸/ml（边加边摇动试管滴加时间至少需要1min）555硫酸滴加完毕，将试管自冰水中取出，在室温准确放置30min 显色4.比色用1cm 比色杯，以空白液调零点，于500nm 波长测吸光值。(二)标准曲线绘制1、加2g 活性炭于50mL 标准溶液中，摇动1 min，过滤。2、取10mL 滤液放入500mL 容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液(10g/L草酸溶液)稀释至刻度（抗坏血酸浓度20g/mL）。3、取5，10，20，25，40，50，60稀释液，分别放入7个100mL 容量瓶中，用1%硫脲溶液(10g/L硫脲溶液)稀释至刻度，（最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10，12 g/mL）按样品测定步骤形成脎并比色。 4、以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度(g/mL)为横坐标绘制标准曲线。五、计算式中： X样品中总抗坏血酸含量，mg/100g；c由标准曲线查得或回归方程算得样品氧化液