（微生物学专业论文）瑞氏木霉纤维二糖水解酶cbhⅠ丝状真菌表达体系的构建.pdf

山东大学硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：避日期：皇兰! ! ：三! 兰。 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件 和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：避导师签名： 山东大学硕士学位论文 目录 摘要i a 】b s t r a c t i i i 缩写词( a b b r e v i a t i o n ) v i 第一章绪论。l 1 1 纤维素的微生物降解与纤维素酶2 1 1 1 纤维素的性质与结构2 1 1 2 纤维素的微生物降解3 1 1 3 纤维素酶系组成、性质及降解机制5 1 1 4 纤维素酶的转录调控8 1 1 5 纤维素酶的应用前景9 1 2 瑞氏木霉纤维二糖水解酶1 0 1 2 1 纤维二糖水解酶的结构和功能研究1 0 1 2 2 瑞氏木霉纤维二糖水解酶的表达研究1 5 1 3 丝状真菌转化系统与外源蛋白表达研究进展一1 7 1 3 1 丝状真菌转化系统1 8 1 3 2 丝状真菌蛋白表达策略探讨2 2 1 4 本论文研究目的及意义2 5 第二章黑曲霉原生质体的制各与转化2 6 2 1 实验材料2 6 2 1 1 菌种和质粒2 6 2 1 2 培养基2 7 2 1 3 主要试剂2 7 2 2 实验方法2 8 2 2 1 菌种保藏技术2 8 2 2 2 孢子悬液制备2 8 2 2 3 引物设计2 8 2 2 4p c r 扩增2 8 2 2 5 原生质体制备及转化2 9 2 2 6 培养方式及菌龄的选择2 9 2 2 7 再生数计算2 9 2 2 8 真菌基因组的提取3 0 2 3 实验结果3 1 2 3 1 不同裂解酶及浓度对黑曲霉原生质体形成的影响3 l 2 3 2 茵丝培养方法及菌龄的选择3 2 2 3 3 黑曲霉原生质体形成过程观察3 4 2 3 4 黑曲霉原生质体的转化3 5 2 z l 讨论：1 6 本章总结：3 6 第三章黑曲霉中表达c b hi 载体的构建3 8 3 1 实验材料一3 8 3 1 1 菌种和质粒3 8 3 1 2 培养基3 9 3 1 3 主要试剂3 9 山东大学硕士学位论文 3 2 实验方法3 9 3 2 1 菌种保藏技术。3 9 3 2 2 大肠杆菌感受态制备3 9 3 2 3 大肠杆菌d h 5 a 转化4 0 3 2 4 质粒提取4 0 3 2 5 引物设计4 0 3 2 6p c r 扩增4 1 3 2 7 限制性内切酶酶切4 1 3 2 8p c r 及酶切d n a 片段的回收。4 l 3 2 9 连接反应4 l 3 2 1 0 重组质粒的筛选与鉴定4 2 3 2 1 1 琼脂糖凝胶电泳技术4 3 3 3 实验结果4 3 3 3 1 葡萄糖淀粉酶g t a a 启动子的p c r 扩增4 3 3 3 2c b h l 基因的扩增4 4 3 3 3c b hi h a h i s 平末端克隆到p u c l 9 4 4 3 3 4 9 l a a 启动子与c b h l 基因的融合4 6 3 3 5 融合片段( g l a a p r - c b hi ) 与p a n 5 6 2 载体的连接4 6 3 3 6 p y r g 表达盒与p a n 5 6 c b h 的连接4 7 3 4 讨论5 0 本章小结5 0 第四章重组转化子的鉴定与重组c b hi 的初步纯化5 2 4 1 实验材料5 2 4 1 1 菌种和质粒5 2 4 1 2 培养基5 3 4 1 3 主要试剂5 3 4 2 实验方法5 4 4 2 1 菌种保藏技术。5 4 4 2 2 孢子悬液制备5 4 4 2 3 黑曲霉原生质体的制备及转化5 4 4 2 4 黑曲霉染色体d n a 的提取5 4 4 2 5p c r 体系和反应程序同2 2 4 5 4 4 2 6 蛋白样品浓缩5 4 4 2 7s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 5 5 4 2 8 黑曲霉转化子的复筛、单孢分离及鉴定5 5 4 2 9w e s t e r nb l o t 检测。5 5 4 2 1 0 发酵液的获得和预处理5 6 4 2 1 1 分子筛层析5 6 4 2 1 2 离子交换柱层析5 6 4 3 实验结果。5 7 4 3 1 目的基因整合率及转化子的分析鉴定5 7 4 3 2 重组表达转化子的筛选5 8 4 3 3 转化子的单孢分离和纯化6 l 4 3 4c b hi 的初步纯化6 2 山东大学硕士学位论文 4 4 讨论6 5 本章小结6 5 第五章c b hi 瑞氏木霉表达体系的构建6 7 5 1 实验材料6 7 5 1 1 菌种和质粒6 7 5 1 2 培养基。6 7 5 1 3 主要试剂6 8 5 2 实验方法。6 8 5 2 1 菌种保藏技术6 8 5 2 2 瑞氏木霉孢子悬液制备6 8 5 2 3p c r 体系和反应程序，限制性内切酶酶切等分子克隆技术6 8 5 2 4 引物设计6 9 5 2 5 瑞氏木霉原生质体的制备及转化6 9 5 2 6 瑞氏木霉染色体d n a 的提取6 9 5 2 7 蛋白样品浓缩6 9 5 2 8s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p ：a g e ) 6 9 5 2 9 瑞氏木霉转化子的复筛、单孢分离及鉴定6 9 5 2 1 0w e s t e r nb l o t 检测7 0 5 3 实验结果。7 0 5 3 1 瑞氏木霉p y r g 表达盒的获取和连接7 0 5 3 2c b h l 基因的连接7 l 5 3 3 瑞氏木霉t u 6 的转化及转化子的鉴定7 3 5 4 讨论7 z l 本章小结7 4 总结及展望 7 5 参考文献。 致谢 7 7 i i l 山东大学硕士学位论文 摘要 结晶纤维素的降解是提高纤维素利用效率的关键之一。瑞氏木霉可以分泌产 生高效降解结晶纤维素的酶系，其中纤维二糖水解酶( c b hi ) 约占其胞外分泌总 蛋白的6 0 。c b hi 能够从结晶纤维素的还原端连续催化形成纤维二糖，是高 效降解结晶纤维素的重要的酶组分。但现有纤维素酶作用于天然纤维素高分子底 物时，酶解效率较低，难以满足工业化转化的需要。随着基因工程和蛋白质工程 的发展，利用定点突变等方法研究纤维素酶的催化关键氨基酸及催化机制，分析 酶解效率的限制性因素，可以为提高纤维素的酶解效率提供理论基础。 瑞氏木霉纤维二糖水解酶双结构域的结构组成，在分泌过程中的翻译后修饰 及其复杂的折叠过程被认为是纤维二糖水解酶异源表达困难的主要原因。研究表 明，大肠杆菌和酵母菌都不是纤维二糖水解酶表达的合适宿主。在大肠杆菌中缺 乏必要的翻译后修饰，表达容易形成包涵体。而在酵母中存在过度糖基化问题， 表达的纤维二糖水解酶的活性较低。哺乳动物表达系统存在重组蛋白表达量低， 培养时间长及成本昂贵等问题。纤维素酶特别是纤维二糖水解酶的高效异源表达 一直是制约其结构功能关系深入研究的瓶颈。丝状真菌具有很高的蛋白分泌能 力，具有高效的蛋白折叠分泌体系。因此，丝状真菌可能是包括纤维二糖水解酶 在内的纤维素酶良好的表达宿主。 本文通过在黑曲霉和瑞氏木霉中重组表达纤维二糖水解酶( c b hi ) ，从而 尝试建立重要纤维素酶组分的高效丝状真菌表达体系。本文首先构建了黑曲霉高 效转化体系，研究了影响黑曲霉原生质体制备的裂解酶，培养方式及菌龄等因素。 结果表明，l y s i n ge n z y m e 可以用来有效地制备瑞氏木霉原生质体，但是对黑曲 霉的细胞壁几乎没有裂解作用。c e l l u l a s e 的作用同样很微弱，而s n a i l a s e 可以裂 解黑曲霉产生少量原生质体( 1 0 4 m 1 ) 。l y w a l i z y m e 可以裂解黑曲霉细胞壁， 释放大量原生质体( - - - 1 0 1 m 1 ) 。利用l y w a l l z y n e 和s n a i l a s e 混合酶系统制备黑 曲霉原生质体效果最佳。黑曲霉液体培养极易形成菌丝球，不利于原生质体的制 备。高速振荡培养( 3 0 0r p m ) 和静置培养都可以得到较为松散的菌丝，但是高 速振荡培养制备原生质体的效果较静置培养效果好。菌龄是影响原生质体制备的 山东大学硕士学位论文 重要因素。研究发现，菌龄为1 4h 制备原生质体数量最多，而菌龄为1 6h 制备 的原生质体再生数量最多。幼嫩的菌丝得到原生质体数量较多，但是原生质体较 脆弱，再生能力较低，1 6h 制备原生质体效果最佳。综合以上实验，确定黑曲霉 原生质体制备的最佳条件为：在渗透压稳定剂( 1m 山梨醇，1 0m m k h 2 p 0 4 - k 2 h p 0 4p h5 8 ) 存在下，1 0m g m ll y w a l l z y m e + 1 0m g m ls n a i l a s e 在3 0 c 下作用于3 0 0r p m 震荡培养1 6h 的菌丝2h ，原生质体的制备效率可达1 07 1 0 8 个m l 。我们进一步利用p e g c a c l 2 介导的原生质体转化方法将质粒p a b 4 1 ( 含 p y r g 基因) 成功转化黑曲霉m g g 0 2 9 得到转化子，转化率为2 0 0 个鹏d n a 。 在成功构建黑曲霉转化系统的基础上，通过融合p c r 的方法将c b hi 基因 置于黑曲霉强启动子葡萄糖淀粉酶( g l a a ) 启动子的下游，构建了c b hi 在黑 曲霉中的表达质粒p a n 5 6 c b h ，进一步将黑曲霉p y r g 的表达盒连接到 p a n 5 6 - c b h 上获得质粒p a n 5 6 一c b h - p y m ，以便于黑曲霉的转化。通过 p e g c a c l 2 介导的原生质体转化方法将c b hi 的表达载体p a n 5 6 c b h p y r g 转 入黑曲霉m g g 0 2 9 ，得到约2 0 0 株转化子。转化子经过w e s t e mb l o t 筛选验证得 到了c b hi 表达的转化子。对重组表达的c b hi 进行了初步纯化，其分子量约 在5 8 8 0 k d a 之间，以p n p c 及a v i c e l p i l l 0 1 为底物测定酶活表明重组表达的c b h i 有活性。 瑞氏木霉和黑曲霉分泌蛋白的糖基化形式有差异，在黑曲霉中表达瑞氏木霉 c b hi 出现的过度糖基化修饰可能对c b hi 的性质会有影响。因此我们还尝试 进一步构建瑞氏木霉表达体系。利用组成型启动子丙酮酸激酶启动子( p k o 和c b h 2 终止子构建了在瑞氏木霉中的组成型表达载体p r l m e x c b hi p y r 4 ，利用 p e g c a c l 2 介导的方法转化尿苷缺陷型的瑞氏木霉宿主t u 6 。瑞氏木霉转化子经 过单孢分离后，p c r 验证表明已经整合了重组的c b h l 基因。 关键词：纤维二糖水解酶( c b hi ) ；黑曲霉；瑞氏木霉；p y r g ；原生质体 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ed e g r a d a t i o no fc r y s t a l l i n ec e l l u l o s ei st h ek e yp r o b l e mt oi m p r o v et h ee f f i c i e n c y o fc e l l u l o s eu t i l i z a t i o n t r & h o d e r m ar e e s e is e c r e t e ss e r i e sc e l l u l o l y t i ce n z y m e s k n o w nt op a r t i c i p a t es y n e r g i s t i c a l l yi nt h ed e g r a d a t i o no fb i o m a s s ，6 0 o ft o t a l e x t r a c e l l u l a rp r o t e i ni sc b hi c b hic a nh y d r o l y z et h ec r y s t a l l i n ec e l l u l o s ef r o m t h e r e d u c i n ge n dt o r e l e a s ec e l l o b i o s ea n di sc o n s i d e r e dt ob et h ek e ye n z y m e c o m p o n e n to fc e l l u l a s e si nt h ed e g r a d a t i o no fc r y s t a l l i n ec e l l u l o s e h o w e v e r , t h e e n z y m a t i ce f f i c i e n c yo fc e l l u l a s e si sf a i r l yl o wi nt h ed e g r a d a t i o no f t h el a wc e l l u l o s e m a t e r i a l si nn a t u r e ，w h i c hc o u l dn o tm e e tt h en e e do fi n d u s t r i a l i z a t i o nt r a n s f o r m a t i o n w i t ht h ed e v e l o p m e n to fg e n ee n g i n e e r i n ga n dp r o t e i ne n g i n e e r i n g ，w ec a nu s e m e t h o d ss u c ha ss i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i si nt h er e s e a r c ho ft h ek e ya m i n oa c i d sa n d t h ec a t a l y t i cm e c h a n i s mo fc e l l u l a s e sa n da n a l y z et h el i m i t i n gf a c t o r so ft h ee f f i c i e n c y o fc e l l u l o s eh y d r o l y s i s t h e s e ss t u d i e sw o u l dp r o v i d et h eb a s i sf o ri m p r o v i n gt h e e f f i c i e n c yo f c e l l u l o s eh y d r o l y s i s t h ed u a ld o m a i ns t r u c t u r e ，p o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n sd u r i n gs e c r e t i o na n dt h e c o m p l i c a t e df o l d i n gp r o c e s so fc b h ia r ec o n s i d e r e dt ob et h em a i nr e a s o nf o rt h e d i f f i c u l t yo f h e t e r o l o g o l o u se x p r e s s i o no fc b h i ec o l ia n dy e a s th a v e b e e np r o v e n t ob en o tt h es u i t a b l eh o s tf o rt h ee x p r e s s i o no fc b hi c b h1w a sp r o d u c e da s i n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d i e si ne c o l io w i n gt ot h el a c ko fn e c e s s a r yp o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o nw h i l ei ny e a s tc b h1w a sh y p e r g l y c o s y l a t e dw i t hl o w e ra c t i v i t y i n m a m m a l i a ne x p r e s s i o ns y s t e m ，t h er e c o m b i n a n tp r o t e i np r o d u c t i o ni sl o w , t h e c u l t u r i n gt i m ei sl o n ga n dt h ec o s ti sh i g h e r w i t hh i g hp r o t e i ns e c r e t i o nc a p a c i t y , e u k a r y o t ep r o t e i nt r a n s l a t i o n ，f o l d i n ga b i l i t y a n dp o s t - t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n ， f i l a m e n t o u sf u n g ia r er e c o g n i z e da sb e i n gt h es u i t a b l ee x p r e s s i o nh o s tf o rc e l l u l a s e s i n c l u d i n gc b h i i nt h i ss t u d y , w et r i e dt oe x p r e s sc b hii na s p e r g i l l u sn i g e ra n dt r i c h o d e r m ar e e s e i , 1 1 1 山东大学硕士学位论文 t h u sa t t e m p t st oe s t a b l i s ht h ee f f e c t i v ef i l a m e n t o u sf u n g ie x p r e s s i o ns y s t e mf o r c e l l u l a s e s w ef i r s tc o n s t r u c t e dah i g h l ye f f i c i e n tt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f a s p e r g i l l u s n i g e r w es t u d i e dd i f f e r e n tf a c t o r st h a tm i g h ta f f e c tt h ep r e p a r a t i o no fp r o t o p l a s t so f a s p e r g i l l u sn i g e ri n c l u d i n ge n z y m e s ，c u l t u r i n gc o n d i t i o na n ds p a w na g e d i g e s t i n g a s p e r g i l l u sn i g e rm g g 0 2 9m y c e l i u mw i t hl y w a l l z y m ec o u l dg e n e r a t e 107 m l p r o t o p l a s m ，b u ts n a i l a s ec o u l dp r o d u c eas m a l la m o u n to fp r o t o p l a s t sa b o u t10 4 m 1 l y s i n ge n z y m ew h i c h i se f f i c i e n ti nt h ep r e p a r a t i o no ft r i c h o d e r m ar e e s e ip r o t o p l a s t s h a dn oe f f e c ta n dc e l l u l a s ea l s oh a dn oe f f e c tt h eo p t i m u me n z y m e st op r e p a r et h e a s p e r g i l l u sn i g e rp r o t o p l a s ti st h el y w a l l z y n ea n ds n a i l a s em i x e de n z y m es y s t e m h i g h - s p e e ds h a k i n gc u l t u r e ( 3 0 0r p m ) a n ds t a t i cc u l t u r ec a no b t a i nl o o s em y c e l i u m h e n c em o r ep r o t o p l a s t s t h eh i g h - s p e e ds h a k i n gc u l t u r e ( 3 0 0r p m ) c o u l dg e n e r a t e m o r ep r o t o p l a s t st h a ns t a t i cc u l t u r e s p a w na g ei sa ni m p o r t a n tf a c t o ri np r o t o p l a s t p r e p a r a t i o n t h el a r g e s tn u m b e ro fp r o t o p l a s t sw a so b t a i n e dw i t h 14hm y c e l i u m w h i l et h el a r g e s tn u m b e ro f r e g e n e r a t i v ep r o t o p l a s t sw a so b t a i n e dw i t h16hm y c e l i u m t h ey o u n g e rt h es p a w ni s ，t h em o r ep r o t o p l a s t sc a nb eo b t a i n e db u tw i t hl o w r e g e n e r a t i v ea c t i v i t y w es e l e c t e dt h es p a w na g eo f16h a st h eb e s ts p a w na g e t a k i n g a l lt h ea b o v er e s u l t st o g e t h e r , t h eo p t i m a lp r e p a r i n gc o n d i t i o n sf o rt h ea s p e r g i l l u s n i g e rp r o t o p l a s t si sa sf o l l o w s ：t h e16hm y c e l i u mw a so b t a i n e dw i t ht h eh i g h - s p e e d s h a k i n gc o n d i t i o na t3 0 0r p ma n dd i g e s t e dw i t h10m g m ll y w a l l z y m e + 1 0m g m l s n a i l a s ei nt h eo s m o t i cs t a b i l i z e r ( 1ms o r b i t o l ，10 m mk h 2 p 0 4 - k 2 h p 0 4p h5 8 ) f o r2 hu n d e r3 0 w i t ht h i sm e t h o dw ec o u l do b t a i n e d10 7 - - 1 0 8p r o t o p l a s t s m 1 u s i n g t h ep e g c a c l 2 - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d ，w es u c c e s s f u l l yt r a n s f o r m e dt h e a s p e r g i l l u sn i g e rm g g 0 2 9w i t ht h ep l a s m i dp a b 4 1 ( c o n t a i n i n gp y r og e n e ) t h e t r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yw a s2 0 0t r a n s f o r m a n t s 岭d n a a r e rc o n s t r u c t i o no fa s p e r g i l l u sn i g e rt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，t h ee x p r e s s i o nv e c t o r ( p a n 5 6 一c b h p y r g ) w a sc o n s t r u c t e db a s e do nt h ep a n 5 6 - 2p l a s m i d h i s - t a ga n d h a t a gw e r ef u s e dt ot h ec - t e r m i n u so fc b hi c b hlg e n ew a st h e nf u s e dt og t a a p r o m o t e rw h i c hi sas t r o n gp r o m o t e ri na s p e r g i l l u sn i g e r t h ep y r ge x p r e s s i o n 山东大学硕士学位论文 c a s s e t ew a sf u r t h e ri n s e r t e di nt h e p l a s m i d t h ec b hie x p r e s s i o n v e c t o r ( p a n 5 6 - c b h - p y r g ) w a st r a n s f o r m e di n t oa s p e r g i l l u sn i g e rm g g 0 2 9w i t ht h e p e g - c a c l 2 - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o da n d2 0 0t r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e d t h et r a n s f o r m a n t st h a th a di n t e g r a t e dt h ec b hlg e n ew e r es e l e c t e db yp c rw h i l et h e e x p r e s s i o no fc b h 1w a sf u r t h e rc o n f i r m e db yw e s t e r nb l o t t h er e c o m b i n a n tc b h1 w a sp r i m a r i l yp u r i f i e d i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a sb e t w e e n5 8a n d8 0 kd a t h ea c t i v i t y o ft h er e c o m b i n a n tc b h1w a sd e t e r m i n e du s i n gp n p ca n da v i c e lp i ll01a s s u b s t r a t e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tc b hi a r ea c t i v e t h ed i f f e r e n tg l y c o s y l a t i o nf o r m so ft r i c h o d e r m ar e e s e ia n da s p e r g i l l u sn i g e rc a u s e d t h eo v e r - g l y c o s y l a t i o np h e n o m e n o ni nt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o no fc b hii n a s p e r g i l l u sn i g e r , w h i c hm a ya f f e c t et h ea c t i v i t yo fc b hi t h e r e f o r e ，w ef u r t h e r c o n s t r u c t e dt h et r i c h o d e r m ar e e s e ie x p r e s s i o ns y s t e m w eu s et h ep y r u v a t ek i n a s e p r o m o t e r ( p k i ) w h i c hi sc o n s t i t u t i v ep r o m o t e ra n dc b h 2t e r m i n a t o rt oc o n s t r u c tt h e t r & h o d e r m ar e e s e ie x p r e s s i o nv e c t o r ( p r l m e x - c b hi - p y r 4 ) t h ev e c t o rw a s t r a n s f o r m e di n t ot h eu r i d i n e d e f i c i e n th o s tt r i c h o d e r m ar e e s e it u 6 t h e t r a n s f o r m a n t sw e r ec o n f i r m e db yp c r t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h et r a n s f o r m a n t sh a d i n t e g r a t e dt h ec b h lg e n e k e yw o r d s ：c e l l o b i o h y d r o l a s e ( c b hi ) ；a s p e r g i l l u sn i g e r ；t r i c h o d e r m ar e e s e i ； p y r g ；p r o t o p l a s t v j 山东大学硕士学位论文 缩写词( a b b r e v i a t i o n ) 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 资源和环境问题是人类在2 l 世纪面临的最主要的挑战。生物资源是可再生 性资源，地球上每年光合作用的产物高达1 5 l o 2 o 1 0 t ，是人类社会赖以 生存的基本物质来源。其中9 0 以上为木质纤维素类物质，其中的纤维素是地 球上最丰富的多糖物质，这类物质是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富、 最廉价的可再生资源( 高培基，2 0 0 3 ) 。我国的纤维素资源极为丰富，每年农作 物秸秆的产量达5 7 1 0 8t ，约相当于我国北方草原年打草量的5 0 倍。目前这部 分资源尚未得到充分的开发利用，主要用于燃料，畜牧饲料与积肥，不仅利用率 低，还对环境造成一定的污染( 高风菊，2 0 0 5 ) 。 另一反面，随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭，开发高效转 化纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的 燃料、饲料、化工产品功能食品及其药物，补充化石等不可再生资源的缺口，正 成为一种新的发展趋势，很多国家特别是发达国家己将此列为经济和社会发展的 重大战略( 赵荣乐，2 0 0 5 ) 。对我国这样一个化石资源短缺、人口众多、经济持续 快速发展的大国，推动纤维素资源的高效转化利用具有更突出的迫切性。 在对纤维素资源进行综合转化利用时，关键是将纤维素降解为葡萄糖，然后 以葡萄糖为原料作为食品添加剂或作为酵母发酵酒精的原料。人们曾一直使用化 学和物理方法来降解纤维素，而传统的化学降解、物理降解纤维素有许多不利处， 如反应条件剧烈、设备昂贵、后处理存在环境污染以及生产成本高等问题，因此 利用微生物及其产生的纤维素酶降解纤维素成为当前纤维素酶及其应用研究领 域的主要热点。对纤维素酶进行深入的基础研究，寻求有效的手段提高纤维素酶 的酶解效率，以找到清洁有效的途径实现纤维素资源的高效转化利用。 自1 9 0 4 年在蜗牛的消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究至今已经 经历了三个发展阶段，第一个阶段是8 0 年代以前，主要是利用生物化学的方法 对纤维素酶进行分离纯化，但是由于纤维素酶来源广泛、组分复杂、纯化困难， 进展缓慢。第二个阶段是8 0 年代，主要工作是利用基因工程的方法对纤维素酶 基因进行克隆和一级序列的测定。第三阶段是1 9 8 8 年至今，主要工作是利用结 山东大学硕士学位论文 构生物学和蛋白质工程的方法对纤维素酶分子的结构和功能进行研究，包括功能 氨基酸的解析，催化机制的阐明及纤维素酶的分子改造( 刘家建等，1 9 9 5 ) 。 目前对纤维素降解及纤维素酶的研究逐渐转向群体水平，即纤维素降解利用 的综合策略如生物炼制，纤维素酶的协同，纤维素降解微生物及纤维素酶的多样 性及其应用等。但对单个酶的研究，对纤维素降解过程中的限制性因素，催化机 制及解决策略的探讨仍然具有重要意义，而纤维素酶的表达是纤维素酶催化机制 及功能氨基酸研究的关键。 1 1 纤维素的微生物降解与纤维素酶 1 1 1 纤维素的性质与结构 高等植物和藻类的光合作用是产生纤维素的重要方式，但也有研究非光合生 物如某些细菌及海洋无脊椎动物等也可以产生纤维素。纤维素是由p d 葡萄糖分 子以p ( 1 ，4 ) 糖苷键以c 1 椅式构象连接而成的纤维二糖高分子聚合物。但是从 结