细胞培养实验指导4.doc

细胞培养实验指导 陈轶霞 刘俊林 实验报告书写要求：1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况）实验一 细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求【基本原理】细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。【内容与方法】1通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况2.使用卫生要求。（1）实验室的消毒实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。（2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。（3）操作者进入培养室时要遵守的程序a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。（5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。（6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。注：(不写实验报告)实验二 细胞培养的设备与器材【目的与要求】1.了解细胞培养常用设备与器材；2.掌握常用设备的基本操作程序及使用注意事项【内容与方法】1通过教师讲解了解细胞培养常用设备的种类、使用注意事项以及常用器材。2通过教师讲解和演示，学生进行操作练习。常用设备：C02培养箱、电热干燥箱、冰箱、倒置显微镜、超净工作台、过滤除菌装置、纯化水装置、细胞冷冻贮存器、离心机、天平、移液器、血球计数板、高压蒸汽消毒装置等。常用器材：玻璃器皿： 培养瓶、培养皿、离心管、注射器、储液瓶、吸管、载玻片、盖玻片、漏斗、烧杯、量筒等。塑料品： 冷冻管、多孔培养板、离心管等。器械： 解剖刀、眼科剪和镊、中号圆头镊、止血钳等。橡胶制品：各种规格胶塞。杂用品： 金属饭盒、试管架、记号笔、搪瓷盘、吸头、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶和火柴等。吸管筒等。注：（不写实验报告）准备实验要求：整理常用器械并置于瓷盘内，以便演示讲解。实验三实验器材的清洗、包装和灭菌【目的与要求】掌握细胞培养常用实验器材的清洗、包装、灭菌方法以及注意事项。【实验原理】离体条件下，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，细胞培养器材清洗的要求要比普通实验的严格的多，应按不同器材的清洗、包装和消毒程序分别、分类处理。【器材与试剂】剪刀、棉绳、棉花、牛皮纸、记号笔、饭盒、吸管筒、烧杯、清洁液、三蒸水等。【内容与方法】1.各实验组准备后续实验所用的器材，如吸管、注射器、培养皿、青霉素瓶、盐水瓶、培养瓶、瓶塞、眼科剪及镊子等。2.清洗步骤浸泡于水中的使用过的玻璃器材、胶塞煮沸，加入适量洗涤剂继续煮10min刷洗流水振荡冲洗沥水清洁液浸泡24小时流水振荡冲洗1520遍沥水蒸馏水冲洗3次50烤干，待包装。3包装清洗后的培养瓶、培养皿、注射器、金属器械等器材用牛皮纸进行严密包装，封闭器材使用端，标记器材手持端，以便于消毒和贮存。吸管的手持端加棉塞后单独包装或放入吸管筒；瓶盖、胶塞包装（5-10个/包）或放入铝饭盒。4消毒湿热灭菌：将包装好的物品放入压力蒸汽灭菌器内，15磅，20min。干热消毒：主要用于玻璃器皿消毒， 160维持90120min。注：（不写实验报告）准备实验要求：1、将清洗场所摆置整齐，比如清洗用洗盆、凳子、毛刷摆放整齐；2、放置3桶纯净水，并做好顺序标记以方便学生完成冲洗流程；3、配置好清洁液，并事先放入适量玻璃器皿以备教学之用；4、安排好烘干烤箱，并分别张贴好：“自来水冲洗烘干烤箱”和“纯净水冲洗烘干烤箱”；5、准备好包装所用的用品及器械，供教学时演示。实验四 细胞培养用液的配制 【目的与要求】1. 掌握完全培养液、Hanks液等常用细胞培养用液的配置及过滤除菌方法。2. 培养无菌意识和无菌操作。【实验原理】细胞培养离不开细胞在体外生存和生长的各种溶液，即培养用液。培养用液主要包括培养液、平衡盐溶液、血清以及消化液、pH调整液和抗生素液等。配置容器要严格清洗、消毒。要明确标注所配液体名称及配制日期。制备好的培养用液要及时消毒除菌并分装, 在适当的条件下贮存。【器材与试剂】过滤器、试剂瓶、烧杯、容量瓶、吸管、移液器、KCl、KH2PO4、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4.7H2O、酚红、DMEM、血清、双抗、5.6%的NaHC03 溶液、三蒸水等【内容与方法】1. 各组配制500mL D-Hanks液（1）用数滴5.6%的NaHC03 溶液溶解0.01g酚红；（2）称取0.2g KCl、0.03g KH2PO4、4g NaCl、0.175g NaHCO3、0.03gNa2HPO4.7H2O依次溶解于适量三蒸水中( 注意应待前一种试剂完全溶解后，再溶解下一种成分)。（3） 将（1）加入（2）中；（4） 将（3）移入容量瓶中，定容至500mL；（5）分装，10磅20分钟高压蒸气灭菌，4冰箱内保存。2. 各组练习配制30mL完全培养液，培养无菌操作意识。在超净台内按照无菌操作要求取27mL DMEM液，加入3 mL血清、300L双抗，练习过滤除菌方法。注：（不写实验报告）准备实验要求：在超净台内放置好做好标记的DMEM液、血清、双抗（3种都可用替代品）、用过的过滤器（平时注意收集）、吸管、洗耳球、烧杯及培养瓶等。实验五培养细胞的观察【目的与要求】掌握倒置显微镜观察贴壁型细胞的方法。【实验原理】细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞的生长状态。活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光学显微镜无法看清未经染色的活细胞。倒置显微镜利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。因此，体外培养细胞的观察必须要用倒置显微镜。【器材与试剂】 倒置显微镜、生长良好的细胞。【内容与方法】在倒置相差显微镜下对培养细胞的生长状况进行观察。注：（本实验不写实验报告）准备实验要求：准备几瓶细胞供学生练习观察实验六 细胞计数及活力检查 【目的与要求】掌握细胞计数及活力检查的原理和方法。【基本原理】培养的细胞接种合适的密度才能生长良好，细胞计数是调整细胞密度的依据。细胞活力测定是了解细胞状态的重要手段。用台盼蓝染细胞时，由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入不能排出被染成蓝色；活细胞能排出染料，不易着色。【器材与试剂】移液器、血球计数板、盖玻片、吸管、吸耳球、dorf管、离心管、SP2/0-Ag14悬浮细胞、0.4%台盼蓝液等。【内容与方法】1. 细胞计数计数板计数法(1)将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板的2个小室上。(2)加样：细胞悬液吹匀后，用200l加样枪吸出滴加在盖片边缘与计数板交界处，使细胞悬液进入小室，并充满盖玻片和计数板的间隙。(3) 用10物镜镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞计左侧和上方者。按下式计算： 细胞数/mL4大格细胞总数/4104 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。2. 染色法检查细胞活力 (1) 分别滴一滴细胞悬液和0.4%台盼兰染液于载玻片上，用盖玻片角混匀。 (2) 45度盖上盖玻片，计数200个细胞。 (3) 计算细胞活力。细胞活力（%）= 活细胞数/（活细胞数+死细胞数）100%（完成实验报告）准备实验要求：将本实验用器材、液体、待计数的细胞做好标记放置于普通光学显微镜旁边，以方便学生操作。实验七 细胞生长曲线的绘制【目的与要求】 掌握细胞生长曲线绘制的方法.【实验原理】细胞生长曲线是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标,它以培养时间(d)为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。【器材与试剂】吸管、吸耳球、血球计数板、微量加样器、96孔培养板、SP2/0-Ag14细胞悬液等。【内容与方法】1. 在超净台中，将浓度为1.0104个/mL SP2/0-Ag14细胞悬液，用微量加样器接种96孔细胞培养板，每孔200L，接种24孔，置CO2培养箱培养。2从培养第24h开始，每24h分别于超级工作台上吸出3孔的细胞进行计数，计算其平均值。（注意，每天取计数细胞时将待取培养孔中的细胞吹打几下，确保沉于孔底的细胞全部吸出，此过程要保证无菌操作，以免污染细胞，导致细胞死亡，实验失败）3以细胞浓度为纵坐标、细胞生长时间为横坐标绘制生长曲线。注意：每2组或3组用一块培养板。（完成实验报告）准备实验要求：将接种细胞事先计数浓度，然后预先稀释成1.0104个/mL的细胞悬液，吹吸混匀后为各小组分装一份，做好标记放置于超净工作台内。实验八 细胞融合 【目的与要求】掌握聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合的操作方法。【实验原理】两个或两个以上的同种或不同种细胞在诱导物的作用下，细胞膜发生一定变化，融合成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合。聚乙二醇（PEG）是常用的化学诱导剂，它可促使细胞凝结，并破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，使细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个双核或多核融合细胞。【器材与试剂】移液器、吸管、离心管、载玻片、盖玻片、50%PEG、次甲基蓝染液、Hanks液、SP2/0-Ag14细胞、 DMEM完全培养液等。（50%PEG的配制方法：称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50的PEG溶液。放入37水浴中待用）。【内容与方法】 1将SP2/0-Ag14细胞悬液5 mL置于离心管中充分混匀，1000rpm离心5min，弃上清，再小心地吸尽残液。用指弹法弹散细胞，在37水浴条件下吸取0.125mL 50PEG，逐滴加入离心管内，并不断地轻轻摇动，整个过程约90s。然后缓慢加入2mL Hanks液以终止PEG的作用。加入0.25mL 完全培养液，在37水浴静置30min。 2观察：细胞温育时，分别于5、15、30min取细胞悬液1滴滴在载玻片，加1滴次甲基蓝染液染色混合，加上盖玻片镜下观察细胞融合过程。（拍下细胞融合过程，打印附于实验报告）准备实验要求：将本实验用器材、液体、待融合的细胞样品做好标记放置于普通光学显微镜旁边，以方便学生操作。实验九 细胞系传代培养 【目的与要求】掌握细胞系传代培养技术。【实验原理】体外培养的贴壁细胞当密度达到铺满整个瓶底，且超出培养基的能力时，细胞生长停止或生长速度大大放缓，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代培养。传代培养也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。【器材与试剂】细胞培养瓶、吸管、吸耳球、移液器、DMEM完全培养基、0.125%胰蛋白酶、致密单层BHK21细胞等。【内容与方法】1.取一瓶生长良好的致密单层BHK21细胞，倾出旧培养液,加入0.125%胰蛋白酶溶液1mL（覆盖住细胞即可）轻缓漂洗培养物1次。2. 在细胞培养瓶内重新加入0.125%胰蛋白酶溶液2mL消化细胞。（细胞消化的程度可以通过倒置显微镜直接观察判断，一般以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度。也可以通过肉眼观察，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化）3.终止消化吸去或者倾倒出消化液，拍打细胞瓶使细胞脱落，加入3 mL完全培养液。4.吹打分散细胞用吸管吸取培养液，反复吹打细胞生长面瓶壁，使细胞脱离细胞瓶壁。吹打过程须有序进行，即要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的边缘地带和四角处，确保瓶壁各处的细胞均被吹打脱离，细胞吹打脱离瓶壁后，再吹打1520次后，得到细胞悬液。（吸取出1.5mL细胞悬液于离心管中，用于下一个冻存实验）。吹打时吹出液体的力度要适中，否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。5.将剩余细胞悬液接种在新的培养瓶内（预先已经加了所需的完全培养液），送入CO2培养箱中继续培养。6于培养的48h或72h分别观察传代细胞生长情况。 （拍下48h或72h时的细胞生长情况图，打印附于实验报告）准备实验要求：将预先已经加了所需的完全培养液的细胞培养瓶（约15mL）、本实验所需的其他液体做好标记，连同所需器械（如离心管等）放入超净工作台内，每一小组准备一份。由于本实验的细胞还要用于冻存，因此准备实验时还要在超净工作台内放置好冻存管以及离心管、冻存液（务必做好标记，否则和其他液体无法区分）等细胞冷冻保存实验所需的物品。实验十 细胞冷冻保存 【目的与要求】掌握细胞冻存的操作过程【实验原理】冻存保存就是将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70的超低温条件）长期保存的过程。向细胞培养液中加入甘油或DMSO等冷冻保护剂后，使冰点降低，在缓慢冻结条件下，能使细胞内水分子在结冰前透出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，减轻冰晶造成的细胞损伤。【器材与试剂】移液器、冻存管、冷冻保护液（以7份DMEM、2份小牛血清与1份二甲基亚砜混合而成）、BHK21细胞悬液等。【内容与方法】1. 将上个实验制备好的BHK21细胞悬液以8001000r/min离心5min，弃上清液。2. 向沉淀物中加入冷冻保护液1.5mL，轻轻吹打均匀，移入冻存管内，拧紧管盖。3. 在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。4. 冷冻程序： 4，20min -20,20min -80过夜 次日投入液氮罐中。（本实验的实验报告和细胞复苏实验合起来写）实验准备见细胞传代实验实验十一细胞复苏 【目的与要求】掌握细胞复苏技术。【实验原理】复苏就是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。复苏时，一般以很快的速度升温，12min内恢复到常温，这样细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生。【器材与试剂】细胞培养瓶（带盖或塞）、吸管、离心管、吸耳球、移液器、DMEM完全培养液等。【内容与方法】1.调配3740的温水，或将恒温水浴锅的温度调至3740。2.从液氮中取出冻存小管，立即投入3740温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在12min内完成。3.将细胞冻存悬液移人离心管，加入约5mL培养液，轻轻吹匀。4.将细胞悬液经8001000r/min离心5min，弃上清液。5.给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内进行培养。6.于培养的48或72小时观察细胞生长情况。（拍下48h或72h时的细胞生长情况图，打印附于实验报告）准备实验要求：为每组准备一个离心管（里面加入5mL培养液）、一个培养瓶（里面加入约10mL完全培养液）做好标记放入超净工作台内。实验十二细胞原代培养酶消化培养【目的与要求】掌握组织取材、剪切、酶消化分离细胞的方法【实验原理】酶消化原代细胞培养是将动物机体的各种组织从机体中取出，经酶消化（常用胰蛋白酶）分散成单细胞，置于合适的培养基中培养，使细胞生长和繁殖。 【器材与试剂】细胞培养瓶（带盖或塞）、青霉素瓶（带塞）、100目不锈钢筛网、吸管、眼科剪、眼科镊、离心管（10mL）、烧杯、培养皿、DMEM完全培养基、0.125%胰蛋白酶、D-Hanks液、10日龄鸡胚等。【内容与方法】（1）用 75% 乙醇消毒鸡胚, 气室端向上放于小烧杯内。（2）用无菌镊打破卵壳, 剥离卵壳直到气囊的边缘。（3）重新消毒镊子(浸入乙醇, 烧干乙醇, 于无菌的Hanks液中冷却)后用镊子剥离白色的壳膜，显露下面的绒毛尿囊膜及血管。（4）用弯镊子刺破绒毛尿囊膜, 轻轻夹住头部下方, 提出胚胎, 不要完全闭合镊子，避免颈部受损。将鸡胚放入平皿中.（5）去除头部及内脏等，保留实验所需组织，用D-Hanks液洗涤3次。将洗涤后的组织分成2部分，一半用于酶消化，一半用于组织块培养。（6）将用于酶消化的组织转移至青霉素瓶（带塞）中，剪切成0.5mm3左右的小块，可再用D-Hanks液洗一次。（7）视组织块量加入56倍的0.125%胰蛋白酶，37，消化，每隔5min振荡一次，使细胞分离。直至组织块发白，出现絮状，加入35mL DMEM完全培养液终止消化作用。（8） 静置510min，使未分散的组织块下沉，尽量多地弃去上清液，再加入5mL DMEM完全培养液，用吸管轻轻吹打。（9）用100目不锈钢筛网过滤细胞至离心管中， 1000r/min，离心10min，弃上清液。（10）加入培养液l2 mL（视细胞量），血球计数板计数。（11） 将细胞调整到5.0105个/mL1.0106个/mL左右，转移至细胞培养瓶中。（12）分别于48h或72h观察细胞生长情况。（实验报告和下一个实验一起写）实验十三细胞原代培养植块培养法【目的与要求】掌握细胞植块培养的方法。【实验原理】植块培养是比较简单的培养方法，其技术要点就是将从动物体内所取得的组织切割成一定大小的植块，再将植块接种到培养皿内，加入培养液，然后将培养瓶皿送入培养箱中进行培养。【器材与试剂】略【内容与方法】（1）将用于组织块培养的另一半鸡胚组织剪切成1mm3左右的小块。（2）将剪切好的组织小块送入培养瓶中，均匀摆置在培养瓶生长面，每小块间距5mm左右。（4）组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让生长面朝上，向瓶内注入10mL完全培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在CO2培养箱内。（5）放置6-12h待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。此过程动作要轻巧，让液体缓缓覆盖组织小块。严禁动作过快使液体产生冲力将粘贴的组织块漂起而造成原代培养失败。（6）分别于48h或72h观察鸡胚细胞的生长情况 （将以上2个实验合写成一个实验报告，拍下48h或72h时的细胞生长情况图，打印附于实验报告）实验准备要求：为每一实验小组分装实验所需的鸡胚、各种试剂，并做好标记，实验时分发到各实验小组。为每一小组备好足够量的实验所需的各种器械。实验十四 原代细胞首次传代培养 【目的与要求】掌握原代细胞的首次传代技术。【实验原理】原代细胞的首次传代是建立细胞系关键的时期。细胞没有生长到足以覆盖瓶底大部分表面以前不要传代。首次传代细胞数量要多。【器材与试剂】细胞培养瓶、吸管、吸耳球、移液器、DMEM完全培养基、0.125%胰蛋白酶等。实验材料：各组上次实验培养的致密单层鸡胚成纤维细胞。【内容与方法】1.取一瓶生长良好的致密单层鸡胚成纤维细胞，倾出旧培养液,加入0.125%胰蛋白酶溶液1mL（覆盖住细胞即可）轻缓漂洗培养物1次。2. 在细胞培养瓶内重新加入0.125%胰蛋白酶溶液2mL消化细胞。（细胞消化的程度可以通过倒置显微镜直接观察判断，一般以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度。也可以通过肉眼观察，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化）3.终止消化吸去或者倾倒出消化液，拍打细胞瓶使细胞脱落，加入3 mL完全培养液。4.吹打分散细胞用吸管吸取培养液，反复吹打细胞生长面瓶壁，使细胞脱离细胞瓶壁。吹打过程须有序进行，即要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的边缘地带和四角处，确保瓶壁各处