（微生物学专业论文）酸性α淀粉酶产生菌的筛选及其酶学性质研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明 使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目 酸性q 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性 质研究 学位 级别 导师 姓名 硕士 学生 姓名 学位论文 是否保密 阮森林 l 喜翌i 微生物 陈红歌 如需保密 解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果 除了文中 特别加以标注和致谢的地方外 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果 也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料 指导教师对此进行了审定 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明 并表示了谢意 特此声明 研究生签名 雨b 惑株导师签名 7 东乒 融 日期 础年g 月o r 日 日期 矽序石月方日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存 使用学位论文的规定 即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本 并提供目录检索和阅览服务 可以采用影印 缩印或扫描等 复制手段保存 汇编学位论文 本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 本人完全了解 河南农业大学知识产权保护办法 的有关规定 在毕业离 开河南农业大学后 就在校期间从事的科研工作发表的所有论文 第一署名单 位为河南农业大学 试验材料 原始数据 申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有 否则 承担相应的法律责任 注 保密学位论文在解密后适用于本授权书 研究生签名 诽导师签名 依办彳弦 学院领导签 日期沙8 年6 月 日日期滞厂脚 日期 d p 年 致谢 转眼之间三年的时光已经过去 回首过往 研究生的生活的点点滴滴依然如 此鲜活的浮现在眼前 以此文献给我的老师 同学和朋友们 本文是在我的导师陈红歌副教授的严格教诲和悉心指导下完成的 论文选 题 实验开展 以及论文的撰写无不倾注着陈老师的心血和智慧 三年来陈老师 在科研能力和科学思想方面对我的培养和启迪使我终生受益 陈老师渊博的知 识 严谨的工作和科研态度 简朴的生活作风和对科学研究孜孜不断的追求是我 生活和学习中的榜样 借此机会 我忠心的我向的导师致以深深的敬意和诚挚的 感谢 在实验过程中 贾新成教授 吴坤教授 邱立友教授 宋安东副教授 申进 文教授 刘亮伟副教授 张世敏副教授等就论文中出现的问题提出过不少建议 王明道老师 刘新育老师 戚元成老师等对我在实验过程中的问题进行指导 还 有微生物实验室的赵柏叶老师 赵丽萍老师 胡渝老师等都给予我各方面的支持 为我顺利完成学业提供了很大帮助 在此向他们送上我最诚挚的感谢和祝福 同时也十分感谢实验室的师兄师姐和师弟师妹们 感谢师姐师兄张健 吕帅 康静 张品品 鲁晓娟 师弟师妹靖梅贞 刘艳芳 管宁 张勇伟 还有师弟安 弋在实验中的帮助 我还要感谢三年来朝夕相处的同学黄慧惠敏 李岳桦 张东 升 冯锋 张小强 冯云 田建军 史小利 王慧琴 王斐 王艳颖 陈伟 裴 广庆 诸长彬 与他们之间的友谊是我一生最宝贵的财富 感谢寝室的兄弟付小 记和王庭梁在生活中的帮助 最后要感谢我的家人和朋友 在我三年求学生涯中 他们的爱一直是我前进 的动力 他们的鼓励和支持使我克服了许多困难并顺利完成了我的学业 微生物学硕士论文 酸性d 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 摘要 随着以淀粉质为原料的工业地发展 酸性a 一淀粉酶的工业应用价值不断的受到人们的 重视 而目前筛选出的酸性 i t 一淀粉酶产生菌多为真菌 本课题旨在通过筛选得到一株产生 酸性a 一淀粉酶的细菌 本试验以淀粉厂污泥和醋厂醋渣作为含菌材料 通过在酸性培养基平板上进行初筛和复 筛 筛选出了三株在酸性条件下有较强t 1 淀粉酶活力的菌株 b 1 b 5 和b 6 测定三株 菌粗酶液的最适p h 只有b 5 的最适p h 在酸性范围内 属于酸性a 淀粉酶 同时b 5 粗 酶液的生淀粉降解试验结果表明 它还具有一定的生淀粉酶活力 我们选择 5 进行进一步 的研究 通过对b 5 形态特征和生理生化特性的研究 初步鉴定其为浸麻芽孢杆菌 b a c t e r i a m a c e r a n s b 5 产生的酸性伽淀粉酶的酶学性质研究显示 该酶的最适反应温度为7 0 最适p h 为5 0 在p h 4 0 6 0 之间有很高的稳定性 但热稳定性不高 通过b 5 粗酶液的酶谱分析我们发现 它只产生一型酸性m 淀粉酶 将粗酶液切胶纯 化 由s d s p a g e 检测其纯度 证实该酶达到电泳均一纯 酶的分子量大约为4 6 7k d 关键词 酸性q 一淀粉酶生淀粉酶浸麻芽孢杆菌酶学性质 微生物学硕士论文酸性q 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 1 文献综述 1 1q 一淀粉酶简介 t t 淀粉酶是一类用途十分广泛的酶 在粮食加工 食品工业 酿造 发酵 纺织品工业 和医药行业等领域都有重要的用途 c t 淀粉酶 e c 3 2 1 1 作用淀粉时可从分子内部切开 a 1 4 糖苷键 生成小分子糊精和还原糖 由于产物末端葡萄糖残基c l 碳原子为a 构型 故称仅 淀粉酶 洳淀粉酶不能切开支链淀粉分支点的小l 6 键 也不能切开甜l 6 键附近 的t z 1 4 键 水解产物中除了葡萄糖和还原糖外 残留a 1 6 键极限糊精和含4 个以上葡 萄糖残基的低聚糖 l 泓淀粉酶通常在p h5 5 8 0 稳定 大多数 淀粉酶最适温度是5 0 6 0 分子量范围是1 56 0 0 1 39 0 0d a 通常为4 50 0 0 6 00 0 0d a 2 1 目前g e n e b a n k 中已有51 6 9 个洳淀粉酶基因序列 有21 1 8 个蛋白质序列 由于工业 生产葡萄糖和麦芽糖以及提高经济动物和作物的产量的需要 许多产酶微生物和经济动植物 的o 淀粉酶基因得到克隆测序及表达调控研究 3 8 1 a 淀粉酶作为在工业生产中应用最广泛的一种酶 已用于淀粉加工业 面包工业 发酵 工业 纺织退浆和造纸工业等方面 不同来源的伽淀粉酶 具有不同的性质 不同性质的酶 具有不同的用途 黑曲霉酸性a 淀粉酶适用于制造助消化的药物 米曲霉的小淀粉酶耐热性 较差 用于面包工业 在制作面包过程中 若加入甜淀粉酶 把淀粉变成单糖 双糖 帮助 面团醒发 可提高面包质量 耐热性强的细菌a 淀粉酶 由于液化完全 用酶量少 操作较 容易 适于淀粉液化及棉布退浆 酶法生产葡萄糖以及石油压裂 在啤洒酿造中添加伽淀粉 酶使其较快液化以取代一部分麦芽 使辅料增加 成本降低 使啤酒行业的综合经济效益得 到进一步提高 由于反应条件更加的温和 不少酶制剂加入到了洗涤剂中 现在9 0 的洗 涤剂中加入了 淀粉酶 1 2 特殊q 一淀粉酶的研究开发 从淀粉酶的发现至今m 淀粉酶的种类已越来越多 按其使用条件可分为中温型 高温型 耐酸耐碱型 按其来源可分为细菌淀粉酶 真菌淀粉酶 植物和动物淀粉酶 按产物不同可 将其分为糖化型和液化型两种 液化型m 淀粉酶能将淀粉快速液化 其终产物为寡聚糖和糊 精 而糖化型小淀粉酶有较强的酶切活性 在水解可溶性淀粉时 随水解时间的延长而产生 寡聚糖 麦芽糖直至葡萄糖 9 1 随着淀粉工业及相关产业的不断发展 对淀粉酶的需求又有了更加广泛和专业的要求 原有的淀粉酶已经不再能够满足新的需求 具有不同的特性的特殊泓淀粉酶的开发和应用成 为了新的热点 1 耐高温a 淀粉酶 耐高温a 淀粉酶具有作用温度高 作用力强 反应速度快的特 2 微生物学硕士论文酸性q 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 征 其作用的最适温度为9 0 9 5 最适使用范围为9 5 1 0 5 由于耐高温在工业用酶方面具有的优越性 产耐高温淀粉酶的耐高温微生物是研究的热 点 最近关于耐高温淀粉酶特别是甜淀粉酶的的研究主要集中在耐高温或极端耐高温方面 l o n s a n e 和r a m e s h 总结了固态发酵生产菌b a m y l o 均u e f a c i e n s 和b 1 i c h e n i f o r m i s 的耐高 温细菌淀粉酶工艺 指出固态发酵过程使生产酶和淀粉水解最经济适用的方法 我国从8 0 年代开始研究耐高温伽淀粉酶的生产 上海工业微生物研究所以地衣芽孢杆菌 为出发菌株经过各种诱变处理得到一株菌 但是与一般的细菌叶淀粉酶相比 活性还很低 目前我国刚刚开始用微生物发酵法生产商品耐高温弘淀粉酶 生产工艺不完善 成本高 耐高温a 淀粉酶可在食品工业的啤酒 酒精 淀粉糖 酿造及发酵工业等得到广泛的应 用 并起到推动新工艺新技术的运用与研究 降低消耗 降低成本的作用 2 耐碱性伽淀粉酶 嗜碱性微生物作为极端环境中的一种微生物 是一类仅能在碱性条件下 p h9 0 1 1 o 生长的微生物的总称 由于其具有许多特殊性能 日益受到人们的关注 这类微生物研究最 多的是碱性芽孢杆菌 由嗜碱微生物产生的胞 l a 淀粉酶具有在高p h 值条件下保持高活 性的特点 人们对碱性洳淀粉酶的研究始于7 0 年代 首先由日本学者分离获得一株可在p h1 0 5 条 件下产a 淀粉酶的芽孢杆菌 由于这类酶的最适反应p h 在碱性范围内 与其它酶配合可以 做为洗涤剂的添加剂 因此 随着洗涤剂用酶量的增加 近年来有关这方面的研究报告也越 来越多 8 0 年代末期 印度学者从土壤中分离出一株耐碱a 淀粉酶的菌株 1 9 9 1 年中科院 田新玉等人对碱性小淀粉酶特性做了初步研究 1 0 1 因此开发碱性a 淀粉酶作为洗涤剂用酶很 有意义 除了在洗涤剂方面的应用之外 耐碱性a 淀粉酶其它的主要应用领域为 纺织工业 人 造棉 人造丝的退浆 进行垃圾处理等 随着酶技术及相关工业的发展 酎碱性静淀粉酶的 应用范围将不断扩大 3 低温m 淀粉酶 低温淀粉酶 c o l dt e m p e r a t u r e a m y l a s e 是一个相对的概念 经大量研究发现低温酶与 中温酶相比有以下特点 1 1 酶的最适反应温度较同功能的中温酶低0 c 3 0 在 较低温度下 4 0 酶的转换数 k a t 值 或者生理系数 k c a t k m 高于来自中温菌中的 同类酶 低温酶的热稳定性差 低温酶主要是低温微生 c o l d a d a p t e d m i c r o o r g a n i s m s 产生的 由于地球表面上存在大量的低温环境 使低温微生物分布极为广泛 在生态系统中 起着重要作用 对低温微生物及其产生的低温酶的冷适应机制的研究有着重要的生物学意 义 同时 由于低温酶能在低温下有效发挥催化作用的特点 使其在生物工程领域有着广泛 3 微生物学硕士论文酸性a 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 的应用前景 因此 对低温微生物的研究无论在理论上还是在实践上都有重要意义 近年来 有关低温酶的研究日益增多 相信随着研究的持续深入以及生物工程技术的充分利用 低温 淀粉酶工业应用前景将会更广阔 4 酸性似淀粉酶 酸性a 淀粉酶是指在低p h 条件下仍能保持高酶活的a 淀粉酶 一般中性 淀粉酶最适 p h 值为6 0 7 0 酸性a 淀粉酶的最适p h 值为4 0 一5 0 1 3 酸性 一淀粉酶的研究现状 随着淀粉质原料深加工工业的发展 工艺条件的改变 要求酶制剂工业不断更新和完善 淀粉酶的种类以满足工业生产的需求 日前 国内外市场中两类常用的淀粉酶为中温和高温 甜淀粉酶 其适用p h 范围为6 0 7 0 在酸性条件下其酶活明显降低 己不能满足一些酸性 条件下淀粉原料的深加工工艺的要求 于是 酸性a 淀粉酶应运而生 它的酸稳定性明显高 于中性q 淀粉酶 酸性a 淀粉酶的最适p h 范围在2 0 5 5 显著的耐酸性使其具有很大的 应用潜力和开发前景 可广泛应用于青贮饲料 发酵饮料 药物的生产以及工业副产品的加 工 废料的处理等多种领域 1 3 1 酸性q 一淀粉酶的产生菌株 早在1 9 6 3 年 日本的y a s u j im i n o d a 等人就发现可以用真菌生产酸性洳淀粉酶 以后 欧洲 美国 韩国 中国等国家都对酸性a 淀粉酶的菌株进行了研究 目前工业用的酸性n 淀粉酶大多来源于微生物 产酸性0 淀粉酶的微生物主要是芽孢杆菌和曲霉 例如 a l i c y c l o b a c i l l u s 口c 胁c 口m 州螂 1 2 a s p e r g i l l u sn i g e r 1 3 a s p e r g i l l u sc i n n a m o n e u s a s p e g i l l u s k a w a c h i i 1 4 1 t h e r m o m y o e sl a n u g i n o s u s b 1 b a c i l l u ss t e o r o t h e r m o p i l i u s 1 6 1 b a c i d o c a l d a r i u s a 2 口 口c 趔如枷蛔a t c c 2 7 0 9 1 7 t b 1 i c h e n i f o r m i s 1 8 1 等 尼日利亚的研究者从腐烂的木薯中分离得至i j a s p e r g i l l u sn i g e r 它能产生一种能降解生淀 粉的酸性a 淀粉酶 此酶可以作用于未经糊化的生淀粉 如木薯 玉米 高粱等等 其最适 p h 为3 5 4 0 使用p h 范围为3 0 7 0 f 1 9 1 日本的研究者从温泉中分离得到一株酸热芽孢杆菌b a c i l l u sa c i d o c a l d a l i u sa 2 它所产 生的酸性弘淀粉酶具有较高的耐热性 此酶在p h2 0 7 0 1 2 条件下恒温3 0 分钟 残余酶活 为7 0 在p h4 5 9 0 条件下恒温3 0 分钟 残余酶活为9 0 2 0 l 这些微生物都能产生酸性a 淀粉酶 但是不同的酶在耐酸性和淀粉水解能力上都有着不 同程度的差别 它们产生的m 淀粉酶的最适温度和p h 差异如表1 所示 4 微生物学硕士论文酸性a 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 表1 产酸性淀粉酶的微生物和酶的特性 t a b 1a c i d e s t a b l ea m y l a s ep r o d u c i n gm i c r o o r g a n i s ma n dc h a r a c t e r i s t i c s 1 3 2 酸性a 一淀粉酶的组分差异 微生物所分泌的酸性a 淀粉酶组分多样性主要出现在真菌中 m i k a m i t 2 9 等人对于 a s p e r g i l l u sk a w a c h i i 研究发现该菌也能产生两种酸性a 淀粉酶组分i 和i i 它们的分子量 分别为1 0 40 0 0 和6 60 0 0 等电点分别是4 2 5 和4 2 9 7 年 y a s u h i r ok a j i w a r ap o 等人也从 a s p e r g i l l u sk a w a c h i i 中纯化到两种酸性小淀粉酶 分子量分别为1 0 80 0 0 和88 0 0 且在p h 3 0 下具有较好的稳定性 a k i h i r ok a n e k 0 1 3 1 等人对菌株彳印p 枇k a w a c h i ii f 0 4 3 0 8 产生 的酸性淀粉酶进行研究 发现从n 端开始到4 7 9 个氨基酸序列同a s p e r g i l l u sn i g e r 产生的 酸性淀粉酶c 端4 8 0 个氨基酸有9 7 的同源性 包括生淀粉吸附位点 1 3 3 酸性a 一淀粉酶的特性 酸性0 t 淀粉酶与中性洳淀粉酶对淀粉的作用机制相似 但它可以在低p h 条件下 以随 机方式切断淀粉分子内的洳l 4 葡萄糖苷键 水解位于分子中间的小1 4 键的概率比水解位 于分子末端的概率大 不能水解支链淀粉的a i 6 键 也不能水解紧挨i 6 分支的舻1 4 键 不能水解麦芽糖 但可以水解含有3 个或3 个以上静1 4 糖苷键的低聚糖 它水解淀粉的终产 5 微生物学硕士论文酸性q 淀粉酶产生茵的筛选及酶学性质研究 物为麦芽糖 低聚糖 含小l 6 键的糊精 这些产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为1 2 构 型 大多数的酸性弘淀粉酶的最适反应温度为5 0 6 0 1 2 江南大学筛选得到的b a c i l l u s s t e o r o t h e r m o p i l i u s 在发酵过程能产生两种耐酸性a 淀粉酶 它们的最适反应温度均为6 0 1 2 在早期的研究中 日本的y a s u j im i n o d a 等人对产e l a s p e r g i l l u sn i g e 的2 种泓淀粉酶进行了耐 热性研究 在4 0 以下能保持1 0 0 的酶活 5 0 时剩余酶活为9 5 6 0 时 还 有8 8 温度升到7 0 时 酶活力下降至2 7 杨辉等所得到的酸性叶淀粉酶 其 耐热能力达到9 5 最近 日本的研究者又分离得到一株b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 它所生 产的酸性小淀粉酶具有更好的耐热性 此酶的适用条件为 p h4 0 5 5 温度9 0 1 1 0 可以在9 0 1 2 p h 5 5 的条件下水解淀粉 生产糊精 可以看出 酸性1 2 淀粉酶有一定的 耐热性 酸性a 淀粉酶的酸稳定性明显高于中性洳淀粉酶 中性伽淀粉酶的最适p h 值一般为 6 0 7 0 酸性伽淀粉酶的最适p h 值为4 0 5 0 日本早期的研究者y a s u j im i n o d a m o t o oa r a i 等对a s p e r g i l l u sn i g e r 分泌的两种淀粉酶比较p 2 1 如表2 所示 表2 酸性淀粉酶的酸稳定性 t a b 2p hs t a b i l i t yo f a c i d a m y l a s e 金属离子在产酶中也起到一定作用 如c a 2 和n a 可以激活中性a 一淀粉酶 并j j c a 2 对酶活还有一定的促进作用 但是酸性a 淀粉 斡j c a 2 的依赖作用很小 产 刍a s p e r g i l l u s n i g e r 的耐酸性甜淀粉酶的酶活力为3 7u m l 添加了微量的c a 2 后 酶活力降低到2 8 u m l h g p b 2 这两种重金属离子对a s p e r g i l l u sk a w a c h i i 产生的两种酸性 淀粉酶有显 著的抑制作用 1 3 4 酸性q 一淀粉酶耐酸性机制 6 微生物学硕士论文酸性q 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 很多人对酸性i f 淀粉酶能够在酸性环境中保持活性很有兴趣 对酶蛋白进一步分析其氨 基酸序列 从中发现酸性a 淀粉酶中的酸性和碱性氨基酸的含量比中性弘淀粉酶少t 3 0 以此人们推测 酶蛋白的耐酸性和在低p h 条件下的所带的电荷性质有关 当p h 低于等 电点时 碱性氨基酸残基带有正电荷 大量正电荷互相排斥 导致蛋白质结构展开 从而影 响催化中心的活性 如果酶蛋白中的酸性和碱性氨基酸的含量较低 则带电量小 p h 的变 化对酶活的影响不大 所以 带电氨基酸的含量较低的可能是酸性洳淀粉酶具有酸稳定的特 点的原因 在这方面的研究还有待于进一步的研究p 3 1 4 酸性d 一淀粉酶的生产与应用 1 4 1 高产菌株的选育 对野生菌株的筛选和诱变 生产上应用的菌种 最早都是来自自然界中 由于酸性a 淀粉酶的工业应用性很大 所以不但通过筛选得到很多好的原始菌株 而且还通过很多其他 方法 改变菌种特性 提高酶活力 通常使用的诱变方法有 紫外线 激光 x 射线 p 射线等物理方法和烷化剂 天然碱基类似物亚硝酸 氯化锂等化学因素 欧洲的相关研究 用亚硝基胍处理a s p e r g i l l u s n i g e r 从中挑选出了仅产生酸性弘淀粉酶的菌株 使得发酵液 不含其它淀粉酶有利于提纯 诱变育种梧比于其它育种方法 具有速度快 收益大 方法简 单的优点 是一种普遍应用的方法 杂交育种 通过杂交育种可以将不同遗传性状的菌株间杂交 是遗传物质进行交换和重 新组合 改变亲本的遗传物质的基础 扩大变异范围 获得新的品种 同时不仅可克服因长 期诱变造成的菌株活力下降 代谢缓慢等缺陷 也可以提高对诱变剂的敏感性 降低对诱变 剂的 疲劳 效应瞰 但是 现在似乎未见到该育种技术在筛选产酸性淀粉酶菌株的应用 基因工程应用 随着基因工程技术的发展 人们可以按照需要来定向改造酶 科研者研 究了对酶的催化活性中心至关重要的氨基酸残基 试图用基因定点诱变使编码a 淀粉酶的 d n a 序列发生突变 从而通过特异的氨基酸的缺失和插入来获得突变体蛋白质 酸性n 淀粉酶 目前 欧洲的研究者己采用此技术 使a 淀粉酶蛋白氨基酸序列中的一个或几个天 冬氨酸残基或蛋氨酸残基缺失或被其它氨基酸所替代 得到各种酸性a 淀粉酶 美国的研究者将b a c i l l u sa c i d o c a l d a r i u s 的酸性洳淀粉酶基因克隆到芽孢杆菌和乳酸杆 菌中 得到高产菌株 其产物用于淀粉液化和青贮饲料的生产 日本的研究者将a s p e r g i l l u s k a w a c h i i 的酸性弘淀粉酶基因克隆到原菌株中 3 5 增加其基因表达 所得到的转化株产酶 能力是原来的3 5 倍 美国的研究者将b a c i l l u sa c i d o c o l d a r i u s 的酸性a 淀粉酶基因克隆到 芽孢杆菌和乳酸菌中 得到高产菌株 其产物用于淀粉液化和青贮饲料的生产 2 0 0 3 年 王海燕函1 等用p c r 合成的黑曲霉 a s p e r g i l l u sn i g e r 酸性a 淀粉酶的c d n a 构建了酵母醇脱氢酶 a d h i 启动子和终止子引导表达 酸性a 淀粉酶自身信号肽序列引 导分泌的表达元件 与黑曲霉糖化酶c d n a 的表达元件同时插入由酵母r d n a 序列引导 同源整合的酵母y i p 型表达载体p w h y 中 构成双基因表达分泌质粒p w a g 采用 7 微生物学硕士论文酸性q 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 p w a g 与酵母y e p 型g 4 1 8 抗性表达质粒的共转化 将两个基因表达元件整合到酒精生 产酵母菌株a s 2 3 4 6 的染色体r d n a 序列中 获得同时表达胞外酸性母淀粉酶和糖化酶的 双功能酒精酵母工程菌 2 0 0 5 年 h e n gc a i 3 7 1 等利用定点诱变技术从b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 中诱变仅 淀粉酶的基因 以提高其耐酸的稳定性 突变基因在载体b a c i l l u ss u b t i l l i s 中表达 此载体中插入b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 的弘淀粉酶引导肽 并由s a c b 基因的启动来控制表达 基因工程的应用使得对酸性淀粉酶的选育工作效率 得到了巨大的提高 1 4 2 发酵产酶 以日本酿造研究所的研究为例 他们使用a s p e r g i l l u sk a w a c h i i 进行液态发酵和固态发 酵生产酸性似淀粉酶 并发现 固态发酵的产酶量明显高于液态发酵畔 液态发酵中 由于受到培养基中葡萄糖浓度的影响 高浓度的葡萄糖会在一定程度上抑 制产酶 当向培养集中流加葡萄糖时 会在浓度高时抑制产酶 而在固态发酵中 葡萄糖对 产酶几乎没有抑制作用 培养集中较高的葡萄糖含量也不影响产酶 究其原因 推测可能是 在液态发酵中茵体含糖量的降低和培养集中葡萄糖的浓度共同控制产酶 而在固态发酵中菌 的产酶只与菌体含糖有关 1 4 3 酸性q 一淀粉酶的应用 酸性a 淀粉酶作为一种极端环境酶 日益受到人们的广泛关注 随着酸性a 一淀粉酶的分 子组成 酶学特性等更加的了解和研究 它的价值也日渐的被人们认识p 9 1 淀粉深加工是农副产品升值的重要途径 其进行的基础是淀粉质原料的水解 在传统工 业上一般分为液化和糖化两个阶段 常规的a 淀粉酶液化淀粉的最适p h 为6 0 6 5 低于此 淀粉酶自然p h 值必须调碱 液化后再用糖化酶糖化时又将p h 从6 0 6 5 调到4 5 工序繁杂 不经济 且色泽深 使用酸性a 淀粉酶的最适p h 为4 0 得到d e l 0 的液化液 分两段液化 粉浆浓度3 0 1 0 5 c 下加热5m i n 为第一次液化 9 0 下加热1 5 2h 为二次液化 4 u j 液化液过滤性好 粘度低 不易老化 收率高 副产品麦芽糖和异构麦芽糖低 有利于出糖 率提高与发酵产物的有效转化 对酿造工业降低劳动强度 增加原材料的利用率 提高生产 效益等方面都无疑会起到促进作用 耐酸性a 淀粉酶和耐热性洳淀粉酶结合将使此工艺近乎 完美 酸性a 淀粉酶在酒精 食品 饲料 医药等领域都可以得到充分的利用和发挥 酒精厂废液的处理 是制约酒精发酵的障碍之一 利用酸性小淀粉酶发酵酒精废液 使 之有效转化 且可以使转化液生产酒精可以在同一p h 环境下液化和糖化 确保酒精生产质 量 降低生产成本 实现企业低废排放 使企业获得良好的经济效益和社会效益 4 l l 在淀粉工业特别是酿造工业中 发酵过程中的环境通常是酸性的 p h5 0 以下 然而 由于糖化酶和淀粉酶通常是偶联作用的 虽然有在p h3 5 5 5 下作用的糖化酶 但没有与 其向协同作用的淀粉酶 一般的淀粉酶在低的p h 下极易失活 所以 在酿造过程中加入在 8 微生物学硕士论文酸性q 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 低p h 下仍然有最适酶活的弘淀粉酶 不但可以降低工作强度 还能够提高原料利用 以及 生产效率 在日本烧酒的生产中 原料的糖化和溶解以及发酵都是在强酸条件下进行的 烧酒发酵 醪p h 为3 2 4 3 在此环境中中性弘淀粉酶活性很低 而酸性a 淀粉酶的活性较高 酸稳 定性好 产自a a w a m o r i 的酸性a 淀粉酶在发酵醪 p h3 2 3 5 中的活性为8 0 9 0 可以用于原料的加工以及发酵阶段原料的分解利用 大大降低了原料的浪费 在我国传统的白酒酿造中 原料中6 5 的淀粉大约有1 2 不能被利用 这可能是 由于随着发酵的进行 酸度不断增加 p h 不断下降 使酶的活性降低 淀粉的水解不彻底 在此情况下 酸性钟淀粉酶的应用可以充分利用剩余淀粉 提高出酒率 降低成本 在烘烤工业上 面包的发酵需要还原糖 加入酸性真菌a 淀粉酶 在发酵过程中能够稳 定地生成糊精和麦芽糖 由于面包的烘烤温度很高 超过6 0 淀粉酶会很快失去活性 防止淀粉的过度糊化 从而烘焙出质量优良 内部结构均匀 体积膨大 口感极佳的面包 不仅可以加快发酵速度缩短发酵时间 缩短了生产周期 而且可以替代国内现有的面包改良 剂中有致癌作用的溴酸钾 更加安全 4 2 1 在制作面包时其主要作用表现以下几个方面 一是 加快了面团发酵速度 缩短了发酵时间 二是改善了面包内部的组织结构 使面包具有较 好的松软度 三是增大了面包体积 使面包表皮色泽良好而稳定 四是减缓了淀粉的老化 延长了面包的保鲜时间 在医药方面 他卡淀粉酶是在各国广泛流行的消化药 但米曲霉n 淀粉酶的适宜p h 4 5 6 0 在胃中易受胃酸 p h2 o 的破坏 致使医疗效果大为降低 为此可用耐酸性 淀粉酶来制造消化剂嘲 在饲料加工工业中 配合饲料中含有淀粉 蛋白质 脂肪 纤维素等多种营养成分 这 些营养成分都是由生物多聚物组成 必须依靠酶类将其酶解 才能被动物肠道吸收 幼畜的 自身酶系不全 酶活力不足 处于快速生长阶段 而酸性仅 淀粉酶可以降解生物多聚物 强 化消化功能 提高饲料利用率 促进幼畜的生长发育畔 1 5 生淀粉酶 生淀粉酶至今还没有一个严格的定义它为哪一种酶 一般来说是指可以直接作用 水解 或糖化未经蒸煮的淀粉颗粒的酶 4 5 1 生淀粉酶具有可将传统工艺的淀粉糊化 液化 糖化 合并为一步直接糖化的优点 生淀粉酶所涉及的酶有好几种 a 淀粉酶 b 淀粉酶 葡萄糖 淀粉酶 脱枝酶中都有对生淀粉作用的成分m 渤l 猪胰脏洳淀粉酶对生淀粉具有较好的水解 能力 霉菌的甜淀粉酶分解生淀粉的能力较弱 倒是其葡萄糖淀粉酶能较好地分解生淀粉p 经过多年的研究探索 科研人员发现能够产生淀粉酶的菌比较多 但报道最多的是曲霉 a s p e r g i l l u s 芽孢杆菌 b a c i l l u s 根霉 r h i z o p u s 除微生物外已知的生淀粉酶来源有5 0 多种 1 5 1 生淀粉酶作用机制 9 微生物学硕士论文酸性a 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 就生淀粉洳淀粉酶来说 虽然国外研究人员已经将近5 0 种不同来源的a 淀粉酶的肽 链进行了空间结构 氨基酸序列分析 并将相应的d n a 序列破译 5 2 但是对n 淀粉酶水 解生淀粉的作用机理还不十分清楚 国内外的报道也很少 对生淀粉糖化酶的作用机理已有了一定的了解 生淀粉糖化酶水解生淀粉与水解糊化淀 粉的机理与方式有相同的地方 都是从非还原末端外切淀粉的a 1 4 葡萄糖苷键和a 1 6 葡萄糖苷键 但也存在着很大的差别 生淀粉颗粒在水中由于其表面与水分子形成氢键 从 而形成水束 生淀粉颗粒表面大量的水束形成了一层水分子无法通过的水束层 只有当温度 升高时水束层被破坏 水分子渗入淀粉颗粒 使淀粉颗粒膨胀与糊化 人们称之为 水束隔 离模式 w a t e r c l u s t e rd i s s o c i a t i n gm o d e l 因此 酶是否能与生淀粉颗粒表面结合是水解 生淀粉的关键 5 3 1 经过大量的研究证实 生淀粉酶对淀粉的水解能力 还与其它的因素有关 淀粉酶的解支作用瞰 解支能力的大小与水解生淀粉的能力是成正比的 具有更强的 解支活性对生淀粉的水解能力越强 协同作用 某些淀粉分解酶在水解生淀粉的时候起协同作用 如当糖化酶和液化酶混用 时 其水解能力提高近3 倍 这种协同作用对煮沸过的淀粉不起作用 但能把生淀粉完全水 解成葡萄糖 如根霉糖化淀粉酶i 或b 淀粉酶对嗜气杆菌的支链淀粉酶水解生淀粉有促进 作用 吸附作用 淀粉本身具有一定的吸附作用 能吸附一些有机化合物 淀粉遇水后 吸水 膨胀 直链淀粉卷绕螺旋圈伸展 暴露出很多的羟基 o h 该基团为亲水基团 能与其他 有机物形成氢链连结 吸附物质 由于淀粉的吸附作用 酶作为一种催化剂 能够更接近淀 粉粒 其催化作用比完全没有吸附作用时强 1 5 2 生淀粉酶的发展前景 基于节能和工艺简化的要求 生淀粉酶在酿造 食品 造纸 纺织等领域应用中具有潜 在应用价值嘲 生料发酵可节省大量的人力 物力 要实现生料发酵工业化生产 关键在 于获得能使粮食生淀粉进行有效水解的淀粉酶 在传统淀粉加工行业 原料首先要经过糊化 后再加入淀粉酶类进行水解 这将消耗大量的热能 增加了成本 如果采用能够降解生淀粉 的酶类来水解物料 可以简化操作 缩减成本 目前报道的生淀粉酶作用温度一般在3 0 4 0 由于淀粉水解过程中为了防止杂菌污染需要适当加温 至少要达到6 0 哪 因此 这一特性限制了其在淀粉糖等工业的应用 此外 淀粉加水形成的乳浊液的p h 值一般为 5 8 6 5 范围 由于制糖工业中循环工艺的应用 淀粉水解过程中的p h 通常在5 0 左右 具有一定耐热性能和较低作用p h 的生淀粉酶 对现行相关工业的工艺体系的技术升级和 改造 以及对其酶分子的结构特征和催化机制等深入研究均具有重要意义 利用生淀粉酶对淀粉降解能力还可以生产多孔淀粉 通过控制反应条件来控制水解率 从而将淀粉水解成多孔状的多孔淀粉 多微孔淀粉现在也有采用物理 机械及生化方法使淀 1 0 微生物学硕士论文酸性a 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 粉颗粒由表面至内部形成孔洞淀粉 然而酶降解法 明显具有反应快 成本低 易处理的优 势 与天然淀粉相比 其具有较大比孔容 比表面积 低的堆积密度 颗粒密度及良好吸水 吸油 分散等优良性能 可作为微胶囊芯材 吸附剂 包埋剂及脂肪替代物 作为香精香料 风味物质 色素 药剂及保健食品中功能成分的吸附载体 成本低 可自然降解 现已广泛 应用于食品 医药 化工 农业 保健品等领域 微生物学硕士论文酸性o 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 2 引言 淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖 麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称 在淀粉 糖工业 食品工业以及酿酒行业中被广泛应用 它是最早用于工业化生产并且迄今仍是用途 最广 产量最大的酶制剂产品之一 不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的糖类产物 根 据淀粉水解生成糖类产物的异头碳原子构型的不同可将淀粉酶分为q 淀粉酶和p 淀粉酶 a 淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端 生成麦芽糖 麦芽三糖 糊精等还原糖 这些产物 的还原性末端葡萄糖单位碳原子为耐句型 同时该酶能使淀粉浆的粘度下降 因此又称为液 化酶 p 淀粉酶每次从淀粉的非还原性末端切下一分子的麦芽糖 又被称为糖化酶 其产物 还原性末端葡萄糖单位碳原子为6 构型 酸性弘淀粉酶是在酸性条件下能水解淀粉的a 淀粉酶 自1 9 6 3 年日本研究者发现 a s p e r g i l l u sn i g e r 可以产酸性o t 淀粉酶以来 许多国家都对其展开了研究 近年来 随着科 学技术和生产力水平的不断提高 我国淀粉年产量由1 9 7 9 年的2 8 万吨提高到了现在的5 0 0 万 吨 这推动了淀粉质原料深加工工业的发展 随着淀粉加工工艺条件的改变 酶制剂行业也 必须不断更新和完善淀粉酶的种类以满足工业生产的需要 目前国内外市场上两类常用的淀 粉酶为中温a 淀粉酶和高温a 淀粉酶 它们的最适p h 范围均为6 0 7 0 在酸性环境中酶活 明显降低 不能满足一些酸性环境淀粉原料的加工 因此酸性洳淀粉酶的开发势在必行 凭 借其特有的耐酸性 酸性i f 淀粉酶可广泛应用于饮料的发酵 青贮饲料的生产 药物的生产 工业副产品的加工以及工业生产废品的利用和处理等领域 酸性小淀粉酶作为一种极端环境 淀粉酶 也越来越受到人们的注意 随着其分子组成 酶学性质的更加清晰 其利用价值也 日益被人们所认识 此外 具有生淀粉降解能力的淀粉酶类也是研究的新方向 在传统淀粉加工行业 原料 首先要蒸煮糊化以后再加入淀粉酶类进行水解 这将消耗大量的热能 增加了生产成本 如 果采用能够降解生淀粉的酶类来水解物料 不但可以简化操作 而且缩减成本 目前相关报 道中这些酶大多来自酵母和霉菌 而来源于细菌的较少 同时 大多数报道中的生淀粉降解 酶类对于低浓度底物具有水解作用 而淀粉酶工业中通常使用1 5 以上的高底物浓度 需 要开发出符合利用要求的酶类 本研究课题是从醋渣中筛选出了一株可以产生酸性洳淀粉酶的菌株 主要对其产生的 这一型酸性a 淀粉酶进行了纯化及酶学性质初步的研究 并对该酶的生淀粉酶活力做了初 步的探讨 1 2 微生物学硕士论文酸性n 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 3 材料与方法 3 1 菌种来源 菌种筛选的含菌样品分别取自以下三处 1 项城莲花淀粉厂排污口泥土 2 河南 长垣醋厂醋渣 3 试验室富集微生物的淀粉溶液 3 2 主要仪器及试剂 3 2 1 主要仪器 可见分光光度计为上海尤尼克公司7 2 0 0 型 扫描电子显微镜为日立公司s 3 4 0 0 ni i 型 d y y 5 稳压稳流电泳仪和d y c z 2 4 d 双垂直电泳槽为北京六一仪器厂 哈那h i s 4 2 4 p h 计 购自意大利h a n n a 公司 3 2 2 主要试剂 蛋白胨和酵母提取物均购自o x o i d 公司 可溶性淀粉等其他化学试剂均为国产分析纯 主要溶液 可溶性淀粉底物溶液 1 称取1g 可溶性淀粉 加入到1 0 0m lp h4 5 磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液中 完全溶解得到底物溶液 磷酸氢二钠 檬酸缓冲液 a 液0 2m o l l 磷酸氢二钠 n a 2 h p 0 4 2 h 2 0 称取磷酸氢二钠3 5 6 1g 用蒸馏水溶解并 定容至1 0 0 0m l b 液o 1m o f l 柠檬酸 c 6 i 1 8 0 7 h 2 0 称柠檬酸2 1 0 lg 用蒸馏水溶解并定容至1 0 0 0m l 配制缓冲液时 a 液与b 液按比例加入 配成不同p h 缓冲液 用p h 计精确测试校 准 稀碘液 0 0 0 5 的碘一碘酸钾溶液 称取0 2 5g 碘 2 5g 碘化钾用研钵研磨后加水溶 解 定容至5 0 0 m l d n s 3 5 一二硝基水杨酸 称取1 0 9 d n s 溶于水中 全部溶解后 加入2 0 9 n a o h 2 0 0g 酒石酸钾钠 加入蒸馏水 使总体积至5 0 0m l 左右 加热溶解后加入2g 苯酚和0 5g 无水亚硫酸钠 加热搅拌至全部溶解 冷却 用水稀释至1 0 0 0m l 储存于棕色瓶中 一周 后使用 非交性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳和s d s p a g e 所用试剂配制参考文献 5 7 1 菌种鉴定所用试剂 1 革兰氏染色液 a 结晶紫液 a m 结晶紫2g 9 5 乙醇2 0m l b 液 草酸铵0 5 9 蒸馏水8 0m l 1 3 微生物学硕士论文酸性d 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 将a b 两液相混合 静置4 8h 后使用 染色液应放置棕色瓶中保存 b 卢哥氏碘液 碘1g 碘化钾2g 蒸馏水3 0 0m l c 复染剂 2 5 蕃红乙醇溶液 蕃红2 5 9 9 5 乙醇1 0 0 m l 复染剂保存于棕色瓶中 用复染剂 2 5 蕃红乙醇溶液 与蒸馏水1 4 混合及得到 革兰氏染色所需的0 5 蕃红水溶液 2 芽饱染色液 孔雀绿染液 孔雀绿 m a l a c h i t eg r e e n 5g 蒸馏水1 0 0m l 3 甲基红 m r 试剂 甲基红0 1 9 9 5 乙醇3 0 0 m l 蒸馏水2 0 0 m l 4 v p 试剂 4 0 n a o h 称取n a o h4 0g 用蒸馏水溶解完全并定容至1 0 0m l 5 糖发酵试剂 牛肉膏5 9 蛋白胨1 0g 氯化钠3g 磷酸氢二钠 n a 2 h p 0 4 2 h 2 0 2g 0 2 滇麝香 草酚蓝溶液1 2m l 蒸馏水1 0 0 0m l p h7 4 3 3 培养基 3 3 1 初筛平板筛选培养基 可溶性淀粉1 n h 4 2 s 0 40 2 5 m g s 0 40 0 2 k h 2 p 0 40 3 f e s 0 47 h 2 00 0 0 2 5 c a c l 26 h 2 0 0 0 2 5 琼脂2 p h 4 5 3 3 2 复筛平板培养基 可溶性淀粉1 蛋白胨1 酵母提取物0 5 n a c i1 琼脂2 p h 4 5 3 3 3 斜面保藏培养基 可溶性淀粉1 蛋白胨1 酵母提取物0 5 n a c ll 琼脂2 p h 4 5 3 3 4 种子培养基 可溶性淀粉l 蛋白胨1 酵母提取物0 5 n a c l1 p h 4 5 3 3 5 液体发酵培养基 可溶性淀粉l 蛋白胨1 n h 4 2 s 0 40 2 5 m g s 0 40 0 2 k h 2 p 0 40 3 f e s 0 47 h 2 00 0 0 2 5 c a c l 26 n 2 00 0 2 5 3 3 6 糖发酵试验培养基 蛋白胨0 5 牛肉膏0 3 待测糖1 1 6 溴甲酚紫0 1 p h7 2 一p h7 5 3 3 7 甲基红 v p 试验培养液 k h 2 p 0 4 0 5 蛋白胨0 7 葡萄糖0 5 p h7 0 以上培养基均需要1 2 1 3 0 m i n 灭菌 3 4 试验方法 1 4 微生物学硕士论文酸性o 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 3 4 1 酸性q 一淀粉酶产生菌株的筛选 3 4 1 1 菌种初筛 称取1g 样品 加入1 0 0m l 无菌水中 振荡3 0m i n 后静置 取1 0 0p l 上清液n a 筛 选培养平板上均匀涂布 3 7 倒置培养2 4h 长出菌落后滴加稀碘液 挑取有明显透明圈 的菌落 经划线分离得到纯种 筛选流程如图1 所示 3 4 1 2 菌种复筛 将初筛得到的菌株分别点种于复筛平板上 3 7 倒置培养2 4h 滴加稀碘液 观察 透明圈的大小 挑取透明全较大的菌落 斜面保存 样品洗涤 样品涂布 净i t 擎 二 喷洒碘液 一 l 挑l 划 选l 线 菌1 分 株 离 图1 菌种筛选流程 f i g 1 p r o c e s so fs t r a i ns c r e e n i n g 3 4 1 3 酶活力筛选 将复筛得到的菌种分别接种到种子培养基中 3 7 1 8 0r p m 摇床培养2 4 小时 然 后以1 0 的接种量接种到液体发酵培养集中 在相同条件下培养4 8h 发酵液5 0 0 0r p m 离心1 0m i n 取上清液测定酶活力 3 4 2 酸性a 一淀粉酶的酶活力测定 3 42 1 粗酶液的制备 将发酵液以5 0 0 0r p m 离心1 0m i n 取上清液作为粗酶液 3 4 2 2 酶活力测定方法 取5m l 可溶性淀粉底物溶液 在5 5 水浴预热1 0m i n 然后加入适当稀释的粗酶液 1m l 准确反应 0m i n 后 吸取0 5m l 的反应液加入5m l 到0 1m o l l 的h c l 中终止反 应 然后再吸取0 5m l 的反应液 加入到5m l 的稀碘液中 在6 6 0n l n 下测定吸光值 l5 微生物学硕士论文酸性a 淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究 以在沸水中煮沸1 0m i n 的粗酶液代替粗酶液作为空白 以蒸馏水作为比色对照 酶活力根据下式计算 酶活 r o r d 1 0 0 凡为空白值吸光度 r 为样品吸光度 d 为稀释倍数 调整d 值使得 r o r 在0 2 0 7 之间 1 0 0 为系数 在上述条件下 反应1 0m i n 使i 淀粉溶液显蓝强度减低i 所需酶量 为1 个酶活力单位 u 3 4 3 生淀粉的降解 3 4 3 1 淀粉液的制备 选用市售生淀粉 玉米淀粉 以去离子水使淀粉均匀悬浮 然后静置沉淀 弃上清 反复数次 最后得到完全悬浮的生淀粉悬浊液i 3 4 3 2 生淀粉降解 在试管中加入2i i l l2 0 的生淀粉 玉米淀粉 悬浊液 加入lm l 粗酶液后 5 0 水 浴保温3 0m i n 其间不停摇动以保持淀粉悬浮状态 反应结束后离心取上清液 用d n s 法 测定水解产生的还原糖量 以葡萄糖计 生淀粉酶活力定义 在上述条件下 每分钟水解生淀粉产生ip g 葡萄糖的酶量为1 个 酶活力单位 u 3 4 3 3 电子显微镜观察 取上述悬浮状态的生淀粉讲解液 点在载物台上自然晾干