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摘要 苹果渣是水果加工厂的下脚料,如果不能充分利用,将会危害环境。本 文主要研究了以苹果渣为原料经固态发酵生产蛋白饲料的可行性,并对发酵 过程中蛋白酶、果胶酶和纤维索酶的酶活情况进行了分析。 t 、对苹果渣的主要成分进行了分析。其中碳水化合物含量大约在4 0 ,粗蛋 白含量为4 0 一8 2 。 2 、以酵母菌、黑曲霉和绿色木霉共1 0 株菌为出发菌株,利用固体平板上的 初筛和固态发酵的复筛,比较系统地研究了单一菌种的发酵和多菌种混合发 酵,经过实验得到酵母菌2 6 3 7 ,c y 一4 和黑曲霉1 0 混合菌为发酵的最佳菌株。 并研究了黑曲霉固体曲的理化性质以及酵母菌的扩大培养。 3 、固态发酵培养基的优化。通过单因素试验和正交试验,考察了不同氮源对 苹果渣固态发酵的影响,并确定了固体发酵苹果渣生产饲料的最佳培养基配 方为:麸皮1 0 ,硝酸铵1 0 ,尿素0 5 。 4 、固态发酵培养条件的优化:研究中也考察了初始含水量、接种量、通风量 等因素对固态发酵的影响。并进一步进行了正交试验确定固体发酵苹果渣最 佳发酵工艺为初始含水量为6 0 ,接种量为t 0 ,温度为3 5 。c ,接种间隔为接 霉菌2 4 小时后接酵母菌,按种比例为l :3 ,整个发酵需要8 4 小时。 5 、发酵后真蛋白含量为1 3 o ,比发酵前提高了4 0 ,比原始果渣提高了5 0 0 。 果胶酶、蛋白酶和纤维素酶活力分别为1 2 6 2 u ,2 9 u ,5 5 2 u ,并对果胶酶的酶 学性质进行了初步的研究。 关键词:苹果渣蛋白饲料固态发酵 a b s t r a c t a p p l ep o m a c ew a sb y p r o d u c t o f f r u i t p r o c e s s i n g f f i tw a sn o t f u l l y u s e d ,i tw o u l dc o n t a m i n a t ee n v i r o m e n t i nt h i sp a p e r ,f e e d - p r o t e i np r o d u c t i o n w a ss t u d i e dw i t ha p p l ep o m a c eb yt h es o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ( s s f ) a n d a c t i v i t i e so fp r o t e a s e ,p e c t i n a s ea n dc e l l u l a s ew e r ed e t e r m i n e di nt h es o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n 1 t h em a i n c o m p o s i t i o n o f p o m a c ew a s d e t e r m i n e d i t s c a r b o h y d r a t e a n d c r u d ep r o t e i nc o n t e n tw e r e4 0 a n d 4 0 - 8 2 r e s p e c t i v i l y 2 t h ef e r m e n t a t i o no f s i n g l es t r a i na n dm i x e df u n g iw e r es t u d i e d t e ns t r a i n s f r o m y e a s t ,a s p e r g i l l u s a n dt r i c h o d e m aw e r e p r e l i m i n a r i l y s c r e e n e d t h e e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a ty e a s tc y - 4 ,2 6 3 7a n da s p e r g i l l u s l 0w e r es u i t a b l e s t r a i n s t h ey e a s ts c a l e u pc u l t u r ea n dc h a r a c t e ro fa s p e r g i l l u ss o l i dq uw e r e s t u d i e d 3 o p t i m i z i n gm e d i u m :t h ee f f e c t so fa d d i t i o no fd i v e r s en i t r o g e ns o u r c e so n s s fw e r er e v i e w e d b ys i n g l e f a c t o rt e s t sa n d o r t h o g o n a l t e s t s a n d o p t i m i z i t i o n m e d i u md e t e r m i n e d ,w h i c hw e r eb r a n1 0 ,n h 4 n 0 31 0 ,u r e a o 5 4 o p t i m i z i n g c u l t u r ec o n d i t i o n :t h ee f f e c t so fw a t e rc o n t e n t ,i n o c u l a t i o n s i z e ,c h a r g ea n dt e m p e r a t u r eo ns s f w e r es t u d i e db ys i n g l ef a c t o rt e s t sa n d o r t h o g o n a lt e s t s o p t i m i z i n g f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw e r ew a t e rc o n t e n t 6 0 ,i n o c u l a t i o n s i z e 1 0 ,c h a r g e3 0 9 a n d t e m p e r a t u r e3 5 ,i n o c u l a t i n g i n t e r v a l2 4h o u r sb yo r t h o g o n a lt e s t s i n o c u l a t i o np r o p o r t i o nw a s1 :3a n d f e r m e n t a t i o nt i m ew a s8 4 h 5 a f t e r f e r m e n t e d ,p r o t e i n c o n t e n tw a s 1 3 o ,i m p r o v e d4 0 h i g h e r t h a n u n f e r m e n t e dp o m a c ea n d5 0 0 h i g h e rt h a nr a wp o m a c e p r o t e a s e ,p e c f i n a s e a n dc e l l u l a s ea c t i v i t yw e r e1 2 6 2 u ,5 5 2u ,2 9u ,r e s p e c t i v e l y a n dw es t u d i e d p e c t i n a s ep r o p e r t y k e yw o r d s :a p p l ep o m a c ep r o t e i n - f e e d s s f 天津科技大学硕士学位论文 1 、前言 1 1 固态发酵的概述 固态发酵( s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ,s s f ) 是指培养基呈固态,其含水丰 富,但几乎是在没有自由流动水的状态下进行的一种或多种微生物发酵过程, 基质是不溶于水的聚合物,它既可以提供微生物生长所需碳源、氮源、无机 盐、水及其他营养物,还是微生物生长的场所1 1j 。固态发酵是人类利用微生 物生产产品历史最悠久的技术之一。公元前3 0 0 0 年我国发明了酱油曲,公元 前1 0 0 0 年中国酱油曲生产技术传到日本及东南亚等地。表1 为固态发酵的简 史。 表1 固态发酵的历史和发展 公元前3 0 0 0 年 公元前2 6 0 0 年 公元前2 5 0 0 年 公元前2 5 0 0 年 7 世纪 1 8 世纪 1 8 世纪 1 8 6 0 一1 9 0 0 1 9 0 0 1 9 2 0 1 9 2 0 1 9 4 0 1 9 4 0 1 9 5 0 1 9 5 0 1 9 6 0 1 9 6 0 1 9 8 0 1 9 8 0 一现在 中国人发明酱油 埃及人制造面包 用糖、淀粉、盐等发酵贮藏鱼 麸曲发酵过程产生 麸嗨发酵被佛教传到日本 用果渣制醋 鞣酸用于鞣革、印染等 污水的处理 真菌酶、曲酸发酵提取 真菌酶、葡萄糖酸、柠檬酸发酵提取,转鼓式 反应器 大规模工业发酵出现,用s s f 和s m f 生产虾青素 用真菌转化生产甾族化合物、类固醇 生产真菌酶素、蛋白饲料 生产其他产品如乙醇,赤霉素 但现代发酵技术的首要条件是纯种培养,不允许自然界的其他微生物进 入,造成杂菌污染,加上现代工业对大规模集约化生产的要求,使固态发酵 的生产应用处于停滞状态,几乎被排斥到现代工业之外。当液态发酵与固态 发酵有相同经济性能时,液态发酵的许多特征使其成为较优选的方法。更重 要的是,液态发酵的传质、传热均匀有较大程度的可行性。固态发酵含有不 溶于水的固体、少量的水分及空气,微生物生成的热导致水分蒸发,使发酵 体系具有气液固不均匀的三相,存在严重的浓度梯度及传质、传热困难,这 样很难控制p h 、水活度、最佳温度等,使产量大大下降。然而近几年,由于 能源危机与环境问题的日益严重,固态发酵技术再次引起人们的兴趣,固态 前言 1 培养基组成简单,多为便宜的天然物质1 工艺主要限于耐低a 。的微生物 2 几乎无废水排放2 大规模操作时,产生的代谢热可能造成问题 3 对氧的需求可有气体扩散或间歇通风完成。3 难于准确的测定含水量、菌 体量和c 0 2 的量等工艺参数,在线监测难。 4 产物的产率较高4 生物反应器设计不完善 5 能源消耗低5 产品少,工艺操作强度大 6 能够在一定程度上解除产物的抑制,6 微生物生长速度缓慢,发 酵最终获得较高产量的次级产物 1 2 固态发酵生产菌体蛋白饲料( m i c r o b i o l o g yp r o t e i nf e e d s ) 的研究进展 菌体蛋白饲料是指在适宣条件下,微生物大量生长,由其菌体提供的蛋白质 饲料,也称之为单细胞蛋白饲料。这类饲料中不仅含有丰富的蛋白质,还含 有脂肪、核酸、碳水化合物、维生素和无机盐,有较好的香味和性能,是一 种具有较高营养价值的饲料【1 】d 其优越性主要表现在以下几个方面 ( 1 ) 繁殖速度快,菌丝体中蛋白质含量高。 ( 2 ) 生产原料来源丰富,除石油、天然气外,目前更具有潜力的是一大类农 产品j 2 n * 的下脚料及些残次品,如各种农作物秸秆、废糟、废渣、玉米芯、 棉籽壳及酿造、味精、淀粉等工业排出的大量废水都可用作生产菌体饲料的 原料: ( 3 ) 生产过程易控制。生产菌体饲料不需要大面积生产场地,只要在有利条 件下,微生物可在各种营养体上生长繁殖,而且可进行连续的工业化生产, 成功率较高; ( 4 ) 有较高的营养价值。菌体蛋白饲料不仅含有较高的蛋白质,且含有牲畜 生长所需要的其它营养物质,如维生素、矿物质、核酸等【2 1 。蛋白质的含量 与其生长环境有着极其密切的关系,如培养基的类型、菌种、生产工艺等因 素。 1 2 1 生产饲料蛋白的原料 当前,世界各国都非常重视蛋白饲料的开发研究,对于通过微生物生产 菡体蛋白饲料给予了极大的关注。虽然世界饲料蛋白总量超过2 5 0 万吨,但 远远不能满足畜牧业发展的需求,因此,开发新型菌体饲料有广阔的发展前 景。用于生产菌体蛋白饲料的原料十分广泛,由早期的石油、甲醇、乙醇等 碳氢化合物到目前的农产品加工废弃料,种类多种多样。在这些原料中添加 2 天津科技大学硕士学位论文 合适的氮源和其他生长因子,可使微生物大量繁殖。总的来说,生产菌体饲 料的原料需安全廉价且易于获得。从目前的研究进展来看,主要有以下几种: 1 2 1 1 农作物秸秆 农作物秸杆在全世界分布非常广泛,产量超过2 0 亿吨。我国的秸秆资源 也十分丰富,每至收获季节,堆积如山,每年达5 7 亿吨以上。在农村,大量 的秸杆被就地焚烧或作燃料,用于饲料的部分不足1 0 ,这不仅污染环境且 浪费了资源。秸秆属纤维素材料,主要由纤维素( 3 0 - - 5 0 ) 、半纤维素( 1 5 3 0 ) 和木质素( 1 0 一2 0 ) 构成,其粗纤维、粗灰分高,粗蛋白含量低, 加之容积大,适口性差,因此提高秸杆的营养价值成了摆在人们面前的一个 重要课题。半个多世纪以来,各国的科学家对此问题作了艰苦的探索,核心 问题还是在于生物技术的应用。国外十分重视利用秸秆制作蛋白饲料,而国 内在9 0 年代才得以重视,1 9 9 6 年国务院办公厅转化了农业部关于1 9 9 6 2 0 0 0 年全国秸秆养畜过腹还田项目发展纲要中指出,到2 0 0 0 年,我国饲料秸杆 将占秸杆总量的4 0 1 1 4 j 。 由于秸秆中粗纤维含量高,在发酵前,有必要进行预处理,如碱液处理、 蒸汽瀑炸处理、氨水处理等方式,其中蒸气爆炸处理的效果较为理想。蒸汽 瀑炸是将纤维性材料用蒸汽加热至2 0 0 。c 左右,维持一定时问,突然减压喷放。 在高温条件下,纤维性物质中的半纤维素水解成可溶性寡糖而溶解出来,大 大提高了微生物利用的效率。经过处理的秸杆,能有效地破坏木质素和腊质 对纤维素的包裹,消除木质素、蜡质等对微生物发酵的负效应b 。 目前,我国各高校和科研单位都努力尝试以秸杆为原料来生产菌体蛋白 饲料。王成华等人( 2 0 0 i 年) 报道用汽爆秸杆( 7 0 ) ,配以豆糟( 1 0 ) 、 酒糟( 1 0 ) 、麸皮( 1 5 ) ,加4 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ,0 2 k h 2 p 0 4 为固态发酵培养 基,接种里氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 和热带假丝酵母( c a n d i d at r o p i c a l i s ) , 经逐步扩大培养,正交试验,得出最佳发酵条件为:加水量为干基的2 5 倍, 最佳初始p h 为6 7 ,培养时间9 6 h ,温度3 0 ,接种量1 5 ,接种比例4 :6 , 可得到蛋白质含量较高的发酵产物【5 1 a 陈洪章( 1 9 9 3 年) 报道了采用直接法 利用秸秆中纤维素和半纤维素发酵生产单细胞蛋白饲料的生产工艺:即秸杆 经汽爆处理后,加水浸泡、过滤,可用其滤液( 主要是可溶性半纤维素成分) 经深层发酵为饲料酵母,残渣可通过固态发酵生产菌体蛋白,产品均达到了 一定标准1 3 l 。2 0 0 0 年,张伟心等人进行了混合菌发酵玉米秸秆生产菌体蛋白 饲料的研究,其原理在于采用产生纤维素分解酶的菌体与酵母菌共同发酵, 可降低原料中粗纤维含量,提高蛋白质含量。研究过程中筛选出了酶活性较 高的a s 3 3 0 3 0 ,用作混合菌菌株,分别同白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d i u m j 、 产朊假丝酵母( c a n d i d au t i l i s ) 、酿酒酵母( s c e r e v i s i a e ) 和热带假丝酵母 ( c a n d i d at r o p i c a l & ) ,以不同组合进行混菌发酵,得出舢3 3 0 3 0 与白地霉、 3 前言 酿酒酵母三株菌共发酵,产物中粗蛋白的含量达到最高,又在正交试验的基 础上优化出发酵的最佳条件为:料水比1 :1 2 ,接种量为1 0 ,起始p h 值为 5 5 ,发酵时间5 天,经分析发酵产物表明:粗纤维比发酵前降低了5 7 6 0 , 粗蛋白增加3 6 1 9 吼南京理工大学生物工程研究所的史小丽等人( 2 0 0 0 年) 对秸杆经过球磨、酸处理,5 氨水多种不同的预处理方法,接种黑盐霉和产朊 假丝酵母,共同发酵后分析得出,经过球磨处理的秸秆,发酵产物的蛋白质 含量最高,且产朊假丝酵母在黑曲霉己生长2 0 h 后再接入效果更佳f j 。 目前,微生物发酵秸秆生产菌体蛋白饲料较难进入工业化阶段,主要是 因为难以选育出纤维素酶产量高的菌种,据报道,白腐真菌能产生分解木质 素的过氧化酶;再就是发酵过程中降解终产物对酶的合成及其活性产生反馈 抑制;另外,木质素和纤维素形成的酯键非常牢固,阻碍了微生物对纤维素 的降解,导致秸杆的消化率低【4 1 。 1 2 1 2 淀粉及淀粉附产品 早在1 9 8 1 年,在巴黎召开的第三次国际单细胞蛋白会议上就提出用淀粉 原料生产单细胞蛋白是一个值得重视的方向。有人计算,1 公顷马铃薯所产的 饲料蛋白约等于3 公顷土地所产的大豆,可以看出,用淀粉作原料生产蛋白 饲料是经济可行的。赵萍等人( 2 0 0 1 年) 用马铃薯渣生料发酵生产蛋白饲料, 采用二次发酵工艺,以酵母菌和霉菌为发酵剂,确定出提高蛋白质的最佳工 艺和条件【8 】。广西的陈桂光等人( 1 9 9 7 年) 在木薯渣生料中接入根霉和酵母 菌发酵后生产单细胞蛋白( s c p ) ,发酵温度在2 8 3 2 之间,添加0 5 尿素, 0 0 5 k h 2 p 0 4 ,p h 自然,m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 ,使产物中的粗蛋白含量从 3 9 提高至2 2 4 3 _ j 。 1 2 1 _ 3 各类农产品废渣废水 随着产业结构调整,农产品及其加工产品的种类丰富多彩,同时产出的 下脚料也越来越多,如酿造、制药、水果罐头、果汁等产业,出现的废渣、 废水在国内大多不加处理就废弃,既污染环境又浪费资源。这些废渣、废水 中含有较丰富的碳源和其它营养元素,只要补充氮源和生长因子,通过固态 发酵或深层液体发酵均可生产菌体蛋白饲料。泸州老窖酒厂的陈学林等人 ( 1 9 9 4 年) 将先进的生物技术应用于浓香型白酒废糟中,开发出新型菌体蛋 白饲料,经过不断努力,进行小批量试制后,取得了关键性突破,使废糟的 粗蛋白从1 4 一1 5 提高至2 8 左右,粗纤维降低约2 ;氨基酸含量得到 明显提高【l0 1 。张西宁( 1 9 9 6 年) 通过黑曲霉、热带假丝酵母和产朊假丝酵母进 行混合协同固态发酵酱渣,并较为系统地研究了发酵所需要的适宣条件:温 度为2 8 、培养基初始水分达6 5 左右,采用通风发酵的发酵,培养基配方 为:酱渣9 0 、麸皮1 0 、尿素0 8 、k h 2 p 0 4 0 6 】。殷月兰( 2 0 0 0 年) 等人用绿色木霉( t r i c h o d e m a k o n i n g h ) 、白地霉、产朊假丝酵母、米曲霉进 4 天律科技大学硕士学位论文 行混菌发酵三七糠,纤维素明显降低,蛋白质含量得以提高,并平衡了氨基 酸的组成,显著提高了三七糠的饲用价值1 1 。刘军( 2 0 0 0 年) 以醋渣为原料, 按种酵母菌,经过初步研究,得到其适宜的发酵工艺条件,使醋渣的粗蛋白 从7 9 提高至2 2 6 6 ,粗纤维含量下降1 0 左右,改变了醋渣的适口性【1 3 】。 赵启美等人( 2 0 0 1 年) 筛选出产酶丰富的黑曲霉、产朊假丝酵母、扣囊拟内 孢霉为发酵菌种,以麦芽根为基质在3 0o c ,p h 值为5 5 ,经7 4 h ,1 0 接种 量发酵可得到蛋白质含量高的饲料产品【1 4 】。而蔡俊等人( 2 0 0 0 年) 以啤酒糟 作主要原料,黑曲霉、米曲霉、异汉逊氏酵母、产朊假丝酵母共同发酵,研 究了生产蛋白饲料的各种影响因子,认为最佳影响因子的组合为( n h 4 ) 2 s 0 4 为4 ,尿素1 5 、k h 2 p 0 4 1 2 ,硫酸镁0 3 ,氯化钙0 2 ,因子的影响顺 序依次为:( n i - l 2 s 0 4 尿素 m g s 0 4 c a ( o h ) 2 k h 2 p 0 4 1 1 5 】。钟世博等 人( 2 0 0 0 年) 以热带假丝酵母和绿色木霉为菌种固态发酵酒糟,并在酒糟中 添加谷壳作疏松剂,在3 0 培养4 8 h ,使发酵产物的粗蛋白从2 7 5 0 增加到 4 1 4 8 b 6 。1 9 9 9 年,赵建国等人报道为井冈霉素废渣资源的可持续利用提供 了理论依据1 1 ”。周仁岗等人( 1 9 9 1 ) 将甜菜渣晒干粉碎后,接入黑曲霉固态 发酵3 天,蛋白质含量由原来的9 ,8 提商至2 5 4 3 ,氨基酸含量普遍上升, 尤其是赖氨酸含量是玉米的近2 倍【1 8 】。林晓艳等人( 1 9 9 1 年) 初步探讨了玉 米芯粉及其水解渣混菌发酵的最佳工艺和条件,经正交试验得出:不灭菌混 菌发酵工艺具有简单易行,无二次污染等优点,且产品中蛋白质含量可显著 提高 1 9 1 。曹毅用生物技术处理玉米皮渣( 玉米淀粉加工的副产品) ,分析中发 现,处理后的玉米皮渣蛋白质含量有所提高,并改善了氨基酸组成,动物必 需的氨基酸含量丰富,尤其是蛋氨酸、色氨酸含量有较大幅度提高,超出了 f a o 规定的标准睇。 除以上所述,动物的毛皮、血水及皮革粉等也可作为菌体蛋白饲料的生 产原料。蔡皓等人( 2 0 0 0 年) 就以这些原料制作生物活性蛋白饲料,发酵菌 种为乳酸菌、芽孢菌、酵母菌、自链菌和光合细菌,接种量4 ( 每种菌株各 占2 0 ) ,发酵温度为3 0 ,经4 d 发酵后,饲料呈黑褐色,带酒香酸味,乳 酸菌含量达到最高( 1 0 9 个) ,酵母菌1 0 7 个。 1 2 2 生产菌体蛋白饲料的菌种 菌种是发酵必不可少的物质。菌种的优良是成功生产菌体蛋白饲料的关 键和保证。大量事实表明,微生物发酵法是各种原料加工最为经济的方法。 1 9 8 9 年,美国f d a 批准了4 1 种认为是安全、有效的微生物,我国农业部于 1 9 9 9 年6 月公布了嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌、啤酒酵母等1 2 种可作为饲用 微生物。郭维烈在其著作中谈到用于生产蛋白饲料的微生物须符合以下条件 2 2 】。 ( 1 ) 能较好地同化基质碳源及无机氮源: 5 前言 ( 2 ) 繁殖速度快,菌体蛋白含量高; ( 3 ) 无毒性和致病性; ( 4 ) 菌种性能稳定。 一般采用混菌种发酵较单菌种发酵效果要好,其优势在于多个菌种之间 可互相补偿其缺陷,进彳亍协同互生发酵。国内外都从这方面做了大量的尝试 和研究,取得了一定的成果。在生产中根据原料和生产条件选择适合的菌种。 根据各种相关的资料报道,主要选用以下几种菌种作为发酵剂。 1 2 2 1 酵母菌( y e a s t ) 酵母菌是一种单细胞的真核微生物的通俗名称,其繁殖方式包括无性繁 殖和有性繁殖。无性繁殖方式有芽殖和裂殖,而芽殖是酵母菌最普遍的繁殖 方式。酵母具特有的色、香、味,适口性好,而且发酵过程中酵母菌耐酸能 力强,适宜于低p h 培养,不易污染,回收率高。适于生产蛋白饲料的酵母菌 主要有啤酒酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、皮状皮孢酵母、白地霉, 这些菌株可分泌多种水解酶活性含量高达5 0 一6 0 ,富含b 族维生素,并能 产生促进细胞分裂的生物活性物质有强化营养和抗病促长的效果【2 3 2 4 1 。 1 2 2 2 霉菌( m o l d ) 霉菌是丝状真菌的统称。黑曲霉、米曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、木霉、 烟曲霉等真菌可以分泌丰富的酶类,如淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、 植酸酶等,这些酶能够促使原料中淀粉、纤维素等高分子化合物分解为单糖, 供微生物生长需要,且霉菌中菌体蛋白质含量也较高,达到2 0 一3 0 ,因 此在蛋白饲料的生产中这些种类的霉菌广泛使用阻2 4 1 。 1 2 2 3 芽孢杆菌 芽孢杆菌包括巨大芽孢杆菌( b m u c i l a g i n o s u s ) 、胶质芽孢杆菌 ( t h i o b a l i l l u s ) 、固氮芽孢杆菌( a z o t o f i x a n s ) 、地衣芽孢杆菌( b 1 i c h e n i f o r m i s ) 、 蜡状芽孢杆菌( c e r e u s ) 、枯草芽孢杆菌( b s u b k l 括) 、短小芽孢杆菌( b b r e v i s ) 等菌株,这类菌可产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等活性较高的酶。 此外,由于芽孢杆菌中具有不易致死的芽孢,故饲喂时以活菌状态进入动物 的消化系统,可抑制肠道中有害菌的生长繁殖。芽孢杆菌还可减少粪便、消 化道中的大肠杆菌数【“。 1 2 2 4 放线菌( a c t i n o m y c e t e s ) 放线菌是一类呈菌丝状生长,经常用于蛋白饲料的生产,尤其是高温放 线菌具有很高的分解纤维素和木质素的能力。此外,放线菌在生长过程中可 分泌抗生素类物质,抑制肠道中的病原菌,对促进机体免疫有较好的作用。 放线菌的菌体蛋白中含有较高浓度的赖氨酸、色氨酸和含硫氨基酸,营养价 值相对较高。 天津科技大学硕士学位论文 表3 各类微生物的营养成分分析( ) 1 2 3 菌体蛋白饲料的生产工艺 生产菌体蛋白饲料的工艺可分为固态发酵和深层液体发酵,两种发酵工艺 均有利有弊,视生产条件、原料实际情况而定。据曹毅报道,固态发酵所得 产物的产量要高于液态发酵,但液态发酵每克含碳底物的转化率较高。此外, 从环保角度讲,固态发酵是值得提倡的。 1 2 4 菌体蛋白饲料的作用机理和功能 由于菌体蛋白饲料中除富有多种活性物质外,还有各种益生菌,如酵母。 无论是活菌状态还是失活状态的益生菌,都在动物体内发挥了一定作用,主 要促进了瘤胃微生物的生长。虽然,菌体蛋白饲料的作用机制尚不是十分清 楚,但大多数学者认同以下的观点: ( 1 ) 改善瘤胃环境,促进体内微生态平衡 牲畜摄入菌体蛋白饲料后,有益菌就会占有绝对优势,调节了肠道微生 态环境与病原菌竞争的定植位点,抑制其它有害菌和致病菌的生长,增强了 机体对疾病的抵抗力。同时,还改善了肠胃内微生物的发酵,尤其是反刍动 物,可以减少乳酸盐的产生,保持了瘤胃内p h 值的相对稳定性,促进了乳酸 菌、纤维分解菌的繁殖,这样,提高了有益菌浓度和活力。也有研究表明, 酵母能够解除粘附在肠粘膜上的有毒物质,可能与酵母细胞壁中多糖有一定 关系f 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 一3 ”。 ( 2 ) 提高饲料的利用转化率 由于有益菌群能够增强消化道微生物的消化能力,促进动物对营养物质 的吸收、消化和利用,加之一般发酵后的饲料有酒香味,适口性好,增加了 牲畜的采食量,提高了饲料乖j 用率。此外,微生物产生多种酶的作用,提高 了一些高分子化合物( 如纤维素、果胶等) 的分解转化,同时合成新的物质, 在较短时间内,牲畜的泌乳和体重均有所增加。有报道说,可使得饲料的利 用价值提高1 5 一2 0 l “i 。 ( 3 ) 产生有机酸 在发酵过程中,培养基内产生乳酸、乙酸、丙酸等有机酸,这些酸无论 是在体内还是在体外都可抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌的生长,增强动物体 的抗病性【2 63 ”。 菌体蛋白饲料对单胃动物和反刍动物的作用机制有所不同。对单胃动物 前言 来说,饲料中的活的有益菌沿其消化道运行,同时释放部分消化酶促进营养 物质的消化、分解。而对反刍动物来说,摄入含有醉母等有益菌的饲料后, 瘤胃中挥发性脂肪酸含量增加,且发酵效果得以提高,降低了瘤胃的乳酸含 量,从而缓冲瘤胃的p h 值刚。 1 2 5 微生物发酵生产菌体蛋白饲料的影响因素 在发酵过程中,微生物和发酵基质内发生着复杂的物理、化学和生物变 化以及物质和能量的传递。微生物处于周围复杂的外界环境中,可能受到种 种因素的影响。大量研究表明,其影响因素主要体现在以下几个方面: 1 2 5 1 温度 温度是影响微生物有机体存活和生长的重要因素之一。温度的改变常常 影响微生物体内生化反应的速度,以及影响微生物的繁殖速度。对于某一特 定的微生物菌株来说,只有在定的温度范围内,微生物的生长速率最快, 过高或过低的温度都会抑制微生物的生长。一般情况下,在适宜的温度范围 内,微生物机体的生长代谢活动和繁殖随着温度的升高而增加。 1 2 ,5 2 水分 一 水分是微生物生命活动中的基本物质之一,它不仅是细胞外的营养物质 输送到细胞内以及细胞内的代谢产物运送到细胞外的介质,而且是生物体内 发生几乎所有生化反应的优良溶剂。游离态的水由于其特殊的物理化学性质 在生物体内发挥着极其重要的作用。大多数情况下,微生物的生长需要充足 的水分。微生物的种类不一,它们需要的水分的量有所不同。细菌的生长所 需要的水分往往比酵母菌高,霉菌一般较少。 1 2 5 3 p h 值 微生物必须在一定的酸碱度环境中才能正常地进行生长繁殖。通常用p h 值来表示酸碱度。p h 值对微生物繁殖的影响主要体现在引起细胞膜上的电荷 性质的变化,从而影响微生物对营养物质的吸收,进一步影响了细胞组织正 常物质代谢的进行。每一种微生物都有其生长的最适宜p h 值和一定的p h 值 适宜范围。很多微生物在p h 4 0 1 0 0 之间可以生长。放线菌一般在微碱性 环境下能够较快生长,如p h 7 5 8 0 ;酵母菌和霉菌在适宜在偏酸性环境 ( p h 4 o 一6 0 ) 下生长。微生物和环境的p h 值往往处于互动的影响过程中。 一方面发酵基质中的p h 值影响细胞膜上电荷的分布状况,另一方面微生物在 发酵基质中繁殖生长时,由于其代谢作用改变环境中的p h 值。 1 2 ,5 4 无机盐 无机盐对微生物生长具有非常重要的生理功能,根据微生物需要浓度的 大小分为大量元素( 1 0 一1 0 4 ) 和微量无素( 1 0 一一1 0 。8 ) 。大量元素不仅是细 胞的组成成分、维持细胞渗透压、维持酸碱度的稳定以及激活酶不可缺少的 物质,而且也是某些微生物的能源。微量元素中有的是发生生化反应所需要 天津科技大学硕十学位论文 酶的激活剂,如铜、锰、锌等金属离子;有的是特殊分子的结构成分,c o 是 维生素b ,2 的中一t l , 原子。在发酵中,一般需要添加化学试剂来满足微生物的 需要。添加时,首选的是磷酸氢二钾和硫酸镁。 1 2 5 5 氧气 微生物在发酵过程中,氧气对发酵是否成功有直接的影响。在菌体蛋白 饲料的生产中,采用的菌株大多是好氧的,提供充足的氧气作为微生物呼吸 过程中的最终受氢体。在生产中,要根据条件控制发酵料的厚度或鼓风,来 提供足够的空气,保证发酵的顺利进行。 1 2 5 6 发酵基质的颗粒度 底物颗粒的大小直接影响到单位体积反应表面积,也会影响颗粒间菌体 的生长、氧的供给率及二氧化碳的移出率。g a m i la 利用甜菜为底物,进行单 胞菌固态发酵生产乙醇,其他条件不变的情况下,研究甜菜颗粒大小对产物 乙醇的影响,结果发现小颗粒明显有利于乙醇产量的提高。r a op v e ta l 利用 米糠进行固态发酵生产脂肪酶,发现颗粒由5 0 0 u m 减少到1 7 7 u m ,脂肪酶活 性由8 6 提高到1 8 u 9 1 1 1 。 总之,菌体蛋白饲料傲为新型饲料,在畜牧业发展中有着极其重要的地 位,它的开发和研究具有广阔的发展前景。 1 3 果渣的开发利用现状: 我国是世界上水果的生产大国,总产量位居世界首位。1 9 9 8 年生产量达 到5 4 5 2 9 万吨,其中苹果1 9 4 8 i 万吨,位居世界第一位,加工能力只有5 左右“。水果产业的迅速发展,加工产品种类繁多,加工能力不断提高,与 此同时,随着果渣的排出量也日趋增加。果渣是鲜水果加工后的下脚料,主 要是果皮、果核和果肉。每加工1 0 0 0 k g 苹果,可产4 0 0 5 0 0 k g 鲜果渣,烘干 后可得到1 2 0 1 6 5 k g 干果渣,全国每年产生果渣几百万吨。果渣是高含水量 物质,含有部分可溶性糖、维生素、矿物质及纤维素,具有丰富的营养物质, 而大部分果品加工厂将果渣都作废弃物处理。几天内,果渣很快变酸变臭, 给周边环境造成了极大污染,严重影响了群众的生活,同时造成资源的巨大 浪费。“3 。发达国家十分重视对果渣的资源利用,不仅提高了果品的附加值, 也减少了对环境的污染。近几年内,我国也逐渐重视果渣的综合利用,促使 果品加工处于良性循环之中。 苹果渣营养成分丰富,目前在多方面得到应用。鲜渣中主要含有的成份是: 水分( 7 5 n 右) 、粗纤维、果胶物质、蛋白质和少量脂肪,其中蛋白质含量较 低,果胶含量较高,黏度较大,不适宜于牲畜大量饲喂。新鲜的果渣具有苹 果特有的香气,p h 值约4 6 ,酸甜适口。很多发达国家已将鲜果渣列入饲料 营养成分表中。 随着人类环保意识的增强,许多国家的研究人员对苹果渣进行了再利用主要 9 前言 为以下几方面: 1 3 1 生产酒精及酒精饮料 酒精在化工、农业、工业等领域有广泛的用途,目前,大多采用谷物,如 玉米进行发酵生产,粮食消耗量很大。倘若能够以果渣等废弃物生产酒精, 在节约粮食、资源丌发和环境保护方面都具有深远意义。c o r n e l l 大学的食品 科学专家y d ,h a n g 教授领导的课题组,在美国农业部和纽约苹果加工研究基 金的资助下,经过多年潜心研究,获得了一个简易的方法使果渣转化为酒精。 他们发现臭曲霉s p e r g i l l u s f o e t i d u s ) 可以分泌出高活性的a 一葡萄糖苷酶,对果 渣中的纤维素有很强的破坏力,使其转化为葡萄糖,再经酵母固体发酵为酒 精【3 6 i 。这同玉米发酵生产酒精的原理是一样的。n a g d i m o ( 1 9 9 2 年) 等人在 酵母茵固体发酵苹果渣生产酒精的发酵动力学的研究中,他们通过考察生物 量和酒精得率及葡萄糖利用率关系,得出了其中内在的联系,同时,他们还 研究了水分和物料混合速度对果渣发酵生产酒精的影响,认为水分含量为 7 7 的果渣,物料混合速度为2 2 0 转m i 和2 4 0 转m i n ,在3 0 下、4 0 l 的 问歇式反应器中发酵,酒精得率分别为1 8 1 和1 9 2 6 ( 干基) ,达到了最高 值f 3 ”。1 9 9 0 年,g u p t a l k 等人进行营养成份变化对固体发酵苹果渣生产 酒精的影响的研究时,他们分别运用啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ,糖 化酵母限d i a s t a t i c u s ) ,毕氏酵母( s p i c h i a ) ,产朊假丝酵f f - ( c a n d i d au t i l i s ) 、热 带假丝酵母( c a n d i d at r o p i c a l 妇) 发酵苹果渣,生产酒精,同时比较了在啤酒酵 母和糖化酵母发酵中添加氮源、磷酸盐及微量元素,发现添加磷酸盐、氮源、 微量元素可以提高发酵效率和酒精得率。他们又研究了添加o 5 、1 o 的酵 母( 按果渣干基计1 或不加酵母在常温下发酵7 2 h ,经分析得出不如酵母发酵得 到的酒精含有较高的醛类和酯类,而添加酵母菌或不加酵母菌酒精得率相差 不多,均可达到理论值的7 8 - - 9 0 “j 。 1 3 2 提取果胶物质 苹果渣中含有较丰富的果胶物质,果胶是一种以半乳糖醛酸为主的复合 多糖物质,由于其良好的凝胶特性在食品、制药、纺织等行业内广泛应用, 是国际市场上非常紧俏的物质。 果胶的提取工艺一般是热酸处理,将不可溶性果胶转化为可溶性果胶,再 经酒精沉淀、干燥即可,但这种提取方法有无机酸残留多,酒精用量大,产 品色泽深等缺点。h w a n g ( 1 9 9 6 年) 等人采用双螺旋挤压法提取果胶,采用 不同螺旋速度、喂料比例、水分,以水溶性多糖( w s p ) 为指标来优化挤压 条件。其w s p 产率可达1 1 9 4 - - 1 9 7 5 ,粘度为1 1 0 3 8 6 m v g 。当螺旋速度 为2 5 0 3 5 0 转m i n ,喂料速率为3 0 - - 4 0 k g h ,水分为2 0 3 0 可得到较高产 率的果胶,并且w s p 产率随着机械能( s m e ) 的增加而增加,但粘度随着 s m e 的增加而降低【3 9 4 0 。 天津科技大学硕士学位论文 k u n z e k - - h ,k r u s e - - r ,n e u m a n n - - a 等人( 1 9 9 6 年) 将湿苹果渣浸泡在4 0 乙醇溶液,添加0 5 柠檬酸,贮藏3 2 6 4 天,在9 5 。c 的水中提取可得到具有 高分子量,高甲氧基含量的果胶,并具有良好的胶凝性质,可作为食品的增 稠剂和稳定剂【4 1 1 。d e n g l e r - - k 将从苹果渣中提取的果胶添加在果冻和胶质软 糖中( 1 9 9 3 年) ,系统研究了该果胶的化学成分和胶凝性质、感官品质和流变 学特性,并同明胶和淀粉作比较后,认为从苹果渣中提取的果胶有较好的胶 凝特性。智利的i h t m 等人( 1 9 9 2 年) 采用酒精沉淀法和a 1 c 1 3 溶液沉淀法 两种工艺从苹果渣中提取果胶,果胶产率( g 1 0 0 9 果渣) 分别为7 2 0 ( 乙醇) 、 1 1 1 ( 2 a 1 c 1 3 溶液) 、2 3 8 ( 3 a 1 c 1 3 溶液) 和2 8 0 ( 4 a 1 c 1 3 溶液) ,其 中酯化度最高的为4 a 1 c 1 3 溶液提取的果胶,而3 a 1 c 1 ,溶液提取的果胶, 具有最好的胶凝强度,但a 1 的残留较高。i h l m 认为采用酒精沉淀法提取 的果胶产率高同时果胶的品质也较好,故在生产中建议采用酒精沉淀法f 4 ”。 采用硝酸为酸解介质,在间歇式反应器中,从苹果渣中提取果胶,其优化参 数为:搅拌速度4 5 0 转m i n ,p h 为1 5 ,温度8 5 ,果渣与硝酸栽比例为 1 :2 0 ,物料颗粒大小为2 - 3 m m ( c o n t r e a s i j 0 p e r a ,1 9 9 0 年) 4 3 】。1 9 8 8 年,g e n c h e v l 报道从于苹果渣中分浸提和承解两个阶段提取果胶,并得出 适宜的提取温度、酸度和时间1 4 4 j 。国内,邓红采用酸水解和a 1 2 ( s 0 4 ) 3 沉淀的 方法从苹果渣中提取果胶1 4 5 j 。孔臻利用微波法,p h l 8 ,辐射温度9 0 ,微 波5 5 m i n ,料液比2 5 :1 ,饱和硫酸铝7 m l 室温下沉淀,经色谱分析其酯化 度大于7 0 。州 1 3 3 生产柠檬酸 柠檬酸在食品、农业、医药等行业广泛应用,工业上通常用发酵法生产 柠檬酸。其生产原料常用淀粉类、糖液。大连轻院的吴怡莹利用节果渣固态 发酵生产柠檬酸,以黑曲霉a s 3 3 1 5 和a s 3 1 8 6 0 以1 :2 的比例,混菌发酵5 天,产量为7 8 9 k g t 4 ”。 1 3 4 培养食用菌 平菇、金针菇、灵芝等食用菌是一类高蛋白、低脂肪、低热量、营养成 份齐全、风味独特的保健食品,目前主要以棉籽壳、木屑为原料,利用自然 条件进行人工栽培。经分析,果渣中的碳氮比、氨基酸及维生素适宜于栽培 平菇等,陈合等人利用苹果渣栽培金针菇,b 庆梅利用果渣栽培鸡腿菇,获 得高产1 4 7 4 8 i 。 1 3 5 提取低聚糖 低聚糖是一类分子中含有单糖数为2 1 0 个的寡糖,因其热值低, 甜味纯f 、爽口,代谢不会影响胰岛素水平,可促进双歧杆菌在肠道增殖, 保护牙齿等独特的保健功能,在食品中的应用范围非常广泛,己引起l | = 界各 个国家的关注。1 9 9 5 年,r e n a r d c m g c 等人研究用碱液处理脱除果胶的节果 前言 渣,从中提取出了低聚木糖。所用的碱液为1 - - 4 n 的k o h 或n a o h 溶液, 提取时间为2 - - 1 6 h ,温度为o 一4 0 。c ,并且碱液浓度和提取时间对产品得率 的影响最为重要,随着提取时间和碱液浓度的增加,提取率随之增加p 。 1 3 6 提取膳食纤维( d f ) 膳食纤维( d i e t r y f i b r e ,d f ) 是指不被人体消化吸收的以多糖类为主体 的高分子物质的总称,按其溶解性分为水溶性膳食纤维和水不溶性膳食纤维, 由于其一系列的保健功能特性( 预防和治疗高血压、高血脂、肥胖病、糖尿 病、癌症等疾病) 被现代营养学家列为“第七营养素”。w h o 规定人体摄入 d f 的量为1 6 2 4 9 人,d ,而大多数人都远远达不到这个标准,因此开发富含 膳食纤维的原料势在必行。由于从苹果渣中得到膳食纤维色泽较深,限制了 在食品中的应用。1 9 9 7 年r e n a r d c m g c 等人研究了果渣膳食纤维的漂白技 术,结果发现过氧化氢溶液处理的效果最好,并在较高的p h 值下,通过此技 术可得到松软且含较高持水能力的膳食纤维1 5 “”j 。 将苹果渣膳食纤维添加到各类食品中,制成富含膳食纤维的食品来满足 人类f 常的摄入量,是一个行之有效的办法。c a r s o n - - k j 等人( 1 9 9 4 年) 将 苹果渣粉添加到燕麦酥饼中,而h e i n r i c h g 将其添加到黑麦面包中,都取得 了较为理想的效果【5 0 5 ”。韩国的j a i s i k - - h a n g ( 1 9 9 3 年) 把从苹果渣中提取 郅的膳食纤维添加到面条中,添加量为小麦粉的5 - 2 0 ,

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