《高等微生物学》第7章 发酵工程过程控制.doc

第7章 微生物发酵工程过程控制第一节 概述1对象：生物作用剂(biological agents)微生物、动物、植物，及其相关的酶制剂或组织。生物反应器(bioreactor)满足进行生化反应要求的容器；提取与纯化设备。生化反应过程（bioprocess）在生化反应器内，在人工控制条件下，利用生物作用剂进行生化反应建立工业生产过程或社会服务的过程。下游操作（downstream process）生化分离工程（isolation and purification）：产物的提取与纯化工艺及设备；产品的成型、包装、上市。3发酵工业范围3.1微生物菌体发酵3.2酶制剂工业3.3微生物代谢产物发酵3.4微生物的生物转化和酶催化l 是指利用微生物细胞或其酶作为催化剂的生化反应，生产具有更在经济价值的化合物。生物转化的最终产物并不是微生物细胞生长代谢的产物，而是其酶系直接作用于底物的结果。l 生物转化和酶催化反应中，即可是游离的细胞或酶，也可是固定化的细胞或酶。l 催化的反应包括：脱氢、氧化、脱水、缩合、脱羧、羟化、氨化、脱氨、异构化反应等。l 生物转化最明显的特点是反应特异性（反应类型）、结构位置特异性（分子结构中的位置）和立体特异性（特殊的对映体）。如甾体转化；手性药物（化合物）拆分等。3.5微生物特殊机能的利用3.6发酵工业的未来4发酵工业生产一般过程4.1原料的选择与预处理4.2微生物菌种的选育及扩培4.3发酵设备选择及工艺条件控制4.4发酵产物的分离提取4.5发酵废物的处理、回收和再利用发酵工业生产一般过程略图：原料预处理培养基配料与灭菌发酵产物提取、成品加工菌种扩培种子第2节 菌种扩培1培养基培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需的，其组成对菌体生长繁殖、产物合成、产品的分离精制、产品质量和产量都有重要影响。1.1培养基的营养及来源主要有碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。1）对于碳源：一般多采用糖质原料A） 淀粉质原料包括精淀粉、粗淀粉（薯干、谷物）及其水解糖；B） 糖蜜；C） 其它糖质原料果汁其它碳源：CO2；石油类；纤维素、半纤维素、木质素等2）对于氮源：根据需要可采用A） 迟效性氮原黄豆饼，花生饼，玉米浆、蚕蛹水解物、麸皮等有机氮B） 速效性氮源尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等3）根据需要，决定其它特殊微量元素和生长因子的添加。1.2发酵培养基的选择基本原则1) 必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；2) 有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率；3) 有利提高培养和产物的浓度，以提高单位窖发酵罐的生产能力；4) 有处于提高产物的合成速度，缩短发酵周期；5) 尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化；6) 原料价格低廉，质量稳定，取材容易；7) 所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗；8) 有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”物质。发酵培养基的主要作用就是为了获得预期的产物，因此培养基的设计必须围绕这一中心来进行。要求营养适当丰富和完备，菌体迅速生长且健壮；糖、氮代谢符合高单位罐批的要求，能充分发挥生产菌种合成代谢产物的能力，此外还要求成本和单耗低。2菌种的扩培2.1种子扩培的目的就是为发酵提供适当数量的代谢旺盛的种子，保证顺利迅速地“起酵”。足够量的活力旺盛的种子是发酵生产成功与否的第一步。原因：工业微生物的培养方法：（1）表面培养：又分为液态表面培养、固态表面培养。氧的供给常成为发酵的限速因素。特点是发酵周期长，占地面积大；不需要搅拌和通气，节省动力。（2）固体培养：又分为浅盘固体培养、深层固体培养。我国传统制曲工艺。（3）液体深层培养：2.2菌种扩培过程根据发酵规模的不同，种子扩培可以分为二级和多级。一般为，1）液体培养：试管斜面小三角瓶大三角瓶一级种子罐（二级种子三级种子罐（根据不同情况决定级数）2）固态培养：试管斜面小三角瓶（或小茄子瓶）大三角瓶（或大茄子瓶）曲盘3）需要说明的是：液体培养扩培方式与固态培养扩培并不是对立的，而是根据实际工作要求，往往相互交叉进行的。2.3影响种子质量的因素1） 菌种本身特性菌种自身的生产特性从根本上决定了发酵生产的成败。只有优良的菌种才有直接生产的价值。因此菌种管理、保藏和复壮是生物技术产业化的核心、关键。2） 营养条件一般来说，种子罐是培养菌体的，要保证菌种活力旺盛。因此一定要求营养丰富、完全，特别是实验室中的扩培过程中；随着扩培级数的增大，可以逐步使种子罐中培养基成分逐渐与发酵培养基接近，甚至完全相同。3） 培养条件控制合适的温度、pH、通风和搅拌、泡沫。4） 染菌控制染菌是发酵生产的大敌，一旦发现染菌，应该及时进行处理，以免造成更大的损失。尤其是种子染菌，一定要及时发现、及时处理。但是不是任何时候都要求绝对纯种？在此，要请大家理解一个单字“纯”，即如何理解发酵工业上通常所说的“纯种”、“纯种发酵”。要用辨证的观点来分析。5） 种子罐的级数只有一个原则，即在能满足生产要求的前提下，尽量能少则少，能减则减。6） 种龄与接种量控制第三节 发酵工程一、发酵工程原理微生物发酵过程可分为分批、补料-分批和半连续和连续等几种方式。1.分批发酵生长关联型：根据产物的形成是否与菌体生长同步关联，一般初级代谢产物的形成与生长关联；而次级代谢产物的形成与生长非直接关联。非生长关联型：此类型的产物形成只与细胞的积累量有关。1.3分批发酵的优缺点操作生产简单，周期短，染菌机会减少、生产过程产品质量易掌握。2.补料-分批发酵（fed-batch）由于只有料液输入，没有输出，因此发酵液的体积在增加。3.半连续发酵4连续发酵二、发酵罐主要可分为两大类：即厌氧罐和好氧罐。厌氧罐主要用于厌氧发酵，如酒精、啤酒、丙酮、丁醇等；好氧罐主要用于需通风的好氧发酵中，如抗生素工业、氨基酸工业、有机酸（柠檬酸）工业、酶制剂工业等领域。1）厌氧罐A）酒精发酵罐；2）啤酒发酵设备；都比较典型。2）好氧罐A）通风机械搅拌发酵罐；B）自吸式发酵罐；C）带升式发酵罐3）气泡塔式发酵罐4）固态培养设备主要是强制通风设备。5）细胞培养罐主要用于动、植物细胞的培养。三、发酵工程基本操作1）空气除菌除菌效率与：通气量、空气流速、过滤器使用时间、过滤介质层高度、过滤介质填充系数、除菌前后单位体积空气中杂菌数有关。2）培养基及发酵设备的灭菌灭菌的方法有很多，但通常采用加热灭菌，特别是高压蒸汽进行湿热灭菌，即简便、效果又好。在灭菌操作时要考虑一个适当的温度和时间，既能达到灭菌彻底的要求，又能将营养成分的破坏减至最低限度。（1）对数残留定律：即微生物个数减少的速率与任一时刻残存的菌数成正比，n活菌数；t受热时间（min）k反应速率常数（min-1），随微生物的种类和加热温度、培养介质等变化。积分后得， 结论：A）随时间的延长，残存菌数呈对数减少，温度越高，死亡速度越快；B）理论上要达到绝对无菌，即n=0是不可行的，它要求t+ ；C)k是随微生物的种类和加热温度、培养介质等变化，因此不同种类的微生物、不同的培养基在相同温度下灭菌时所要求的时间是不同，灭菌温度和时间的确定要针对不同体系采用不同的标准；D）随着灭菌条件的强化，培养基营养的破坏速率也相应增大，因此高温短时既有利于彻底灭菌又有利于营养成分的保留。3）方法：连续灭菌和分批灭菌。四、发酵条件的影响及其控制常规发酵条件有：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体、通氨速率及补水等。表征过程状态参数有：pH、DO,pCO2,rH,尾气O2/CO2、基质或产物浓度、中间体或前体浓度、菌浓等。间接参数：发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件。（i）菌和生长生理、代谢规律和产物合成的代谢调控机制；(ii)了解生产菌种与环境条件的相互。从而使发酵的控制从感性到理性的转化，以进行有效优化控制。1. 培养基对发酵的影响每一种代谢产物有其最适的培养基配比和生产条件。C源+N源+矿物质+O2细胞量+产物+CO2+H2O+H （1）从几个方面加以考虑：每一种营养物的目的是什么。浓度种类C/N易获得、廉价、农副产品下脚料等补加的方式（2）生长能量学对产物形成的影响（i）新细胞材料的净合成；生物质（i） 维持细胞完整与存活的能量需求；产物（ii） 能量溢出反应。CO2+H2O基质用于生长CO2+H2O基质用于维持能细胞产物当产物的生成是与产能途径关联时，由于细胞生长和维持能，生成产物则是不可避免。此时，无单独基质流入细胞用于生成产物，而所生成产物所消耗的基质来自于用于细胞生长和维持能的基质，并且消耗于维持能的基质对细胞生长无作用，因此它为一单独基质流进细胞内。此时产物直接与能量产生相关联，基质消耗的速率方程不包括单独用于生成产物项，即：rs=1/Y*x/s rx + mCx或qs=1/Y*x/s + m生物质基质用于生长CO2+H2OCO2+H2O基质用于维持能细胞CO2+H2O基质用于产物产物如果产物生成不与或仅仅部分与能量代谢相联系，则用于生成产物的基质或全部或部分以单独物流进入细胞。此时产物生成与能量代谢仅间接相偶合。基质消耗速率取决于三个因素：细胞生长速率、产物生成速率和基质消耗于维持能的速率。rs=1/Y*x/s rx + mCx + 1/Yp/s rp或qs=1/Y*x/s + m + 1/Yp/s q p这些化合物的生产速率随能量消耗速率的增加而提高。但情况并不那么简单。必须设法压缩用于新细胞材料合成的能量消耗、增加基它能量的消耗。能量用于维持与能量溢出对于产物的形成起重要作用。考虑优化能量流的分配。解决策略：（1） 碳与能量限制l 能源限制生长时，菌可采用最有效的途径来产生能量；l 能源的供应大于其生长需求时，菌仍旧会产生更多能量；利用能源效率低l 在较高的生长速率下优先生产乳酸。l 在碳限制下，利用碳-能源的效率最高；在碳源过量条件下葡萄糖与氧耗比速率较高，利用能源效率低，过量生长优先代谢产物。（2） 氮或硫限制对产物合成的影响l 氮限制条件下，细胞含氮量降低，积累多糖（糖原）。由于过量碳源导致胞内NADH/NAD和ATP/ADP比例的增加，即细胞能量过剩，从而在氮限制下大量积累胞外多糖。2，4-二硝基酚，一种能量耗散化合物。l 硫元素的主要作用：供给甲硫氮酸、半胱氨酸和若干辅酶合成的需要。这些辅酶对丙酮酸脱氢酶与a-酮戊二酸脱氢酶很重要，在代谢中起核心作用。l 硫在蛋白质合成所必需的元素，不存在于糖和脂质中。l 硫限制会引进胞外多糖，特别是丙酮酸的积累，也分泌乙酸、a-酮戊二酸、琥珀酸。这也反映出细胞处于能量过剩状态。（3） 钾限制l 生长在钾限制下的菌显示出很高速率的能耗和产物的形成。l 主要用于维持渗透压。l 钾限制的培养物不产生胞外多糖。2. 温度对发酵的影响l 微生物的生长和产物合成均需在其各自适合的温度下进行。l 在过程优化中应了解温度对生长和生产的影响是不同的：l 发酵温度高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前。但酶本身易因热而失活，表现在菌体容易衰老，发酵周期短，影响最终产量。l 温度还可改变发酵液的物理性质，如溶解氧等。l 温度还影响生物合成的方向。l 温度还有对代谢的调节作用。最适温度的选择：在整个发酵周期内仅选择一个最适温度不一定好。3. pH的影响：选择最适pH的准则是获得最大比生产速率和适当的菌量，以获得最高产量。pH采用分段控制，是一种较常用的工艺。PH的监控：首先是培养基的配方，然后是加酸碱或中间体补料来控制。如：在青霉素发酵中，调节加糖速率来控制pH；采用通NH3来控制pH。要防止微生物中毒的发生。4. 氧的供应对发酵的影响（1）溶氧（DO）是需氧微生物生长所必需的，往往是最易成为控制因素。（1） 在水中溶解度只有7mg/L。（2） DO的高低不仅取决于供氧，通气搅拌等，还取决于需氧状况。（3） 3种表示DO的单位：i) 氧分压DOT，以大气压或mm汞柱表示。100%空气饱和水中DOT为159mmHg柱；ii) 绝对浓度，以mg O2/L 纯水或ppm表示。iii) 空气饱和度（%）：（4） 临界氧：是指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。对产物而言，是不影响产物合成所允许的最低浓度。生物合成临界氧浓度与呼吸临界氧值从DO值可以反映菌的生长生理状况。值得注意的是，在培养过程中并不是维持DO越高越好。（5） 溶氧作为发酵异常的指示作用i) 操作故障ii) 中间补料iii) 污染杂菌iv) 作为控制代谢方向的指标（6） 溶氧的控制：从供需两方着手。； 当DO不变时，有所以需从两方面着手：一是供氧；二是耗氧方面。（A）供氧方面增加C*的办法：通入纯氧或富氧，提高氧分压；提高罐压；改变通气速率添加氧载体等提高设备供氧能力的办法：表达5-15。搅拌器；通气量；搅拌转速黏度温度（B）耗氧方面：适当控制菌的摄氧率。如控制加糖或补料速率、改变发酵温度、液化培养基、补水、添加表面活性剂等。表5-19CO2和呼吸熵加糖、补料对发酵的影响比生长速率的作用与控制混合效果物理因素对发酵的影响二、泡沫的影响及其控制泡沫的产生及其影响（1）产生的原因：通气、搅拌、发酵液的理化性质。表面张力。发酵液的性质对泡沫的形成起决定作用。主要是蛋白质和细胞本身具有稳定泡沫的作用。除此之外，温度、pH、基质浓度以及泡沫的表面积对泡沫的稳定性也有影响。（2）带来的负作用：降低装料系数，一般为0.7。增加了菌群的非均一性；增加染菌的机会；易引起“逃液”；消泡剂的加入有时会给后提取带来麻烦。（3）发酵过程泡沫的消长规律发酵过程中泡沫的多寡与通气搅拌的剧烈程度和培养基的成分有关。培养基的灭菌方法、灭菌温度和时间也会改变培养基的性质，从而影响培养基的起泡能力。在发酵过程中发酵液的性质随菌的代谢活动不断变化，也是泡沫消长的重要因素。（4）泡沫的控制机械消沫：消泡桨、旋风分离器、喷射。l 其优点是不需引进外界物质，从而减少染菌机会，节省原料，不会增加下游工作负担；l 缺点是不能从根本上消除泡沫成因。化学消泡剂：种类与使用方法l 工业常用的分天然油脂类、聚醚类、高级醇类和硅树脂类。l 天然油脂类：玉米油、豆油、米糠油、棉籽油、鱼油和猪油等，除作为消泡剂外，还可作用碳源使用。l 聚醚类：应用较多。如泡敌，用量0.03%。消泡能力比植物油大10倍以上。溶解度大，消泡活性维持时间不长。l 聚二醇上有持久消沫的特点，尤其适用于霉菌发酵