水产品中己烷雌酚_己烯雌酚与双烯雌酚残留的毛细管电泳测定.pdf

第29卷 第1期 2010年1月 分析测试学报 FENXICESHIXUEBAO Journal of InstrumentalAnalysis Vol129 No11 55 58 收稿日期 2009 10 09 修回日期 2009 11 25 基金项目 中国博士后基金资助项目 20070420688 福州大学科研启动基金资助项目 0460022233 第一作者 林子俺 1977 男 福建福州人 讲师 博士 Tel 0591 87893175 E mail zalin fzu1edu1cn 水产品中己烷雌酚 己烯雌酚与双烯雌酚 残留的毛细管电泳测定 林子俺 庞纪磊 黄 慧 郑江南 张 兰 福州大学 化学化工学院 食品安全分析与检测教育部重点实验室 福建 福州 350002 摘 要 建立了毛细管电泳 紫外检测法测定水产品中己烷雌酚 HXS 己烯雌酚 DES 及双烯雌酚 D IES 残留的新方法 研究了缓冲体系的酸度 浓度 添加剂 分离电压 进样时间及温度等对组分分离的影响 在 检测波长为200 nm 分离电压为20 kV 运行缓冲液为50 mmol L硼砂 25 mmol L氢氧化纳 pH 1213 含 30 的N N2 二甲基甲酰胺 的条件下 3种目标组分在14 min内达到基线分离 HXS DES与D IES的质量 浓度与峰面积分别在210 120 110 100 110 100 mg L范围内呈良好线性 相关系数 r 2 分别为 01999 8 01999 2 01999 4 检出限为013 019 mg L 将该方法用于鲫鱼中3种雌酚类激素的检测 结果令人满意 关键词 毛细管电泳 水产品 己烷雌酚 己烯雌酚 双烯雌酚 中图分类号 O65718 R97711 文献标识码 A 文章编号 1004 4957 2010 01 0055 04 doi 1013969 j1issn11004 4957120101011013 Determination of Hexestrol Diethylstibestrol and Dienestrol Residues in Aquatic Product by Capillary Electrophoresis L IN Zi2an PANG Ji2lei HUANG Hui ZHENG Jiang2nan ZHANGLan KeyLaboratory ofAnalysis and Detection for Food Safety Ministry of Education Depart ment of Chemistry Fuzhou University Fuzhou 350002 China Abstract A facile method was developed for simultaneous determination of hexestrol HXS dieth2 ylstibestrol DES and dienestrol D IES residues in aquatic product based on capillary electrophore2 sis coupled with ultraviolet detection The influences of some i mportant factors such as additive acidity and concentration of running buffer separation voltage injection ti me and temperature were systemically investigated At the detection wavelength of 200 nm a good baseline separation of three analyteswas obtained within 14 min by using 50 mmol L borax 25 mmol L NaOH pH 1213 with additive of 30 by volume DMF as running buffer and 20 kV as an applied voltage The calibra2 tion curveswere linear in the range of 210 120 mg L for HXS and 110 100 mg L for DES and D IES with correlation coefficients of 01999 8 01999 2 and 01999 4 respectively The limits of detection S N 3 of HXS DES and D IES were 019 014 and 013 mg L respectively The av2 erage recoveries from samples at spiked concentration levelof 50 mg L were ranged from 92 to 98 with RSDs of 213 319 The method showed a good repeatability and high sensitivity and was applied in the determination of three analytes in real sample with satisfactory result Key wo rds capillary electrophoresis aquatic product hexestrol diethylstibestrol dienestrol 激素是一类具有调节生物机体代谢 生长 发育 生殖等作用的化学物质 己烷雌酚 HXS 己烯雌酚 DES 双烯雌酚 DIES 是常见的人工合成雌激素 分子结构式见图1 由于其结构简单 易于合成 成本 低等特点 近年来逐渐在饲料工业得到广泛应用 雌酚类激素对水生动物的正常合成代谢有刺激作用 可促 使动物体内氮停留增加 导致氨基酸合成蛋白质的速度加快而增重 1 水产品中残留的激素进入人体后 蓄积到一定程度会破坏机体的正常生理平衡 2 对于这类激素 欧盟现已禁止使用 美国和加拿大则 限量使用 我国规定动物组织中不得检出DES 但对HXS和D IES残留的测定标准尚待制定 3 分析测试学报第29卷 图1 己烷雌酚 A 己烯雌酚 B 与双烯雌酚 C 的分子结构式 Fig11 Molecular structures of hexestrol A diethylstibestrol B and dienestrol C 目前 测定雌酚类激素的方法有酶联免疫 EL ISA 法 1 比色法 4 电化学法 5 放射免疫 R I A 法 6 色谱 质谱法 7 11 高效液相色谱 HPLC 法 12 15 及毛细管电色谱法 16 等 比色法 电 化学法由于不能用于分离且干扰大等缺点 很少用于残留检测 R I A法每次只能测定1个组分 样品 需经不同前处理 耗时 同时还存在放射性物质对人体伤害和环境污染等问题 HPLC法虽是药典常 用的分析方法 但化学结构相似 荷质比相近和低浓度残留等因素为3种雌激素的色谱分离带来很大 困难 毛细管电色谱和GC MS能够成功分离和确证雌激素 但均需复杂的样品前处理 GC MS还 需衍生化 且仪器昂贵 分析条件要求高 难以推广使用 毛细管电泳 CE 作为一种新颖的分离测定方法具有分离效率高 分析速度快 操作成本低及试剂 用量少等优点 近年来 运用毛细管电泳 安培检测法测定DES残留已见报道 17 18 但尚未见用毛 细管电泳同时测定水产品中HXS DES D IES残留的报道 1 实验部分 111 仪器与试剂 LUMEX CAPEL105型毛细管电泳仪 俄罗斯LUMEX公司 连续可变波长紫外检测器 190 400 nm 配有工作站 未涂层熔融石英毛细管75 m i1d1 60 cm 有效长度52 cm 河北永年锐 沣色谱器件有限公司 电动匀浆机调速器 金坛市富华仪器有限公司 800型离心沉淀器 转速4 000 r min 上海手术器械厂 己烯雌酚对照品 中国药品生物制品鉴定所提供 双烯雌酚 己烷雌酚对照品购自Sigma St1Louis MO USA 公司 N N2 二甲基甲酰胺 中国医药 集团 上海化学试剂公司 无水乙醇 氢氧化钠 硼砂 均为分析纯 实验用水为二次蒸馏水 实验中所有溶液进毛细管前均过0145 m纤维素滤膜 112 溶液配制与样品处理 对照品溶液的配制 精确称取HXS DES D IES对照品 用无水乙醇溶解配成对照品储备液 1 10 g L 密封置于4 保存 用时稀释至所需质量浓度 实际样品处理 将新鲜鲫鱼洗净 刮去鱼鳞 除去内脏 将鱼背顶端向两边腹部的全部鱼肉及皮 刮下 剔除鱼骨 采样后用电动匀浆机调速器搅拌 剔除未绞碎的物质 准确称取10 g鱼肉 加 20 mL无水乙醇超声萃取10 min 3 000 r min离心5 min 取上清液 重复2次 合并上清液 于70 80 水浴蒸干 用无水乙醇溶解残渣并定容于5 mL容量瓶中 待测 113 实验方法 每次开机后毛细管依次用水冲洗5 min 011 mol L氢氧化钠冲洗10 min 水冲洗3 min 运行缓冲 液冲洗5 min 2次测定间用运行缓冲液冲洗毛细管1 min 检测波长 200 nm 压力进样 3 10 kPa 5 s 分离电压 20 kV 温度 25 缓冲液 pH 1213的50 mmol L硼砂 25 mmol L氢氧化钠 30 体积分数 N N2 二甲基甲酰胺 DMF 2 结果与讨论 211 电泳条件的选择 21111 检测波长的确定 根据雌酚的分子结构 经紫外检测器在190 400 nm范围内扫描 HXS DES D IES在195 205 nm间有较强的吸收 所以选定检测波长为200 nm 21112 缓冲体系的选择 分别以20 mmol L pH 710磷酸盐体系 100 mmol L pH 910硼酸盐体系 40 mmol L pH 710 B R缓冲体系 20 mmol L磷酸氢二钠 10 mmol L pH 310柠檬酸体系及 65 第1期林子俺等 水产品中己烷雌酚 己烯雌酚与双烯雌酚残留的毛细管电泳测定 50 mmol L pH 1210硼砂 氢氧化钠体系为运行缓冲液 考察了不同的缓冲体系对电渗流和分离效果的 影响 结果表明 只有在碱性缓冲体系下 如硼酸盐体系和硼砂 氢氧化钠体系 才能观察到3种雌 酚的电泳峰 且在硼砂 氢氧化钠体系下 3种雌酚的电泳峰尖锐 峰形对称 所以选择硼砂 氢氧 化钠为运行缓冲液 21113 缓冲液酸度的影响 雌酚类物质由于2个苯环上各有1个羟基 在碱性条件下极易电离形成带 负电荷的离子 有利于减缓迁移速率以达到分离 根据此原理 配制pH 913 1315的硼砂 氢氧化钠 缓冲液进行实验 结果表明 随着pH的升高 毛细管内层表面的负电荷增加 电渗流加大 迁移时 间相应缩短 但分离效果不显著 当pH大于1010时 被测组分的迁移时间逐渐增长 可能是由于此 时因被电离而带负电荷的组分对迁移速率的影响大于电渗流对迁移速率的影响 分离趋势明显 综合 考虑毛细管对酸碱的适用范围 选择pH值为1213 21114 缓冲液浓度的影响 以pH 1213的硼砂 氢氧化钠 浓度比2 1 为缓冲液 考察硼砂浓度分别为 5 10 20 25 50 75 mmol L时对迁移时间的影响 结果表明 硼砂浓度为5 50 mmol L时 HXS能与 另2种组分达到基线分离 但DES和DIES无法实现基线分离 随着浓度增大 3组分分离效果没有明显改 善 且迁移时间延长 焦耳热现象明显 所以选择50 mmol L硼砂 25 mmol L氢氧化钠为最佳浓度 21115 DMF体积分数的影响 实验发现采用区带毛细管电泳很难将DES和D IES同时分离 主要是 由于二者荷质比极为相似 因此其表观迁移速率相近 适当引入一些添加剂有利于改善分离效果 实 验对比了十二烷基硫酸钠 SDS 十六烷基三甲基溴化铵 CTAB 环糊精 吐温 280 曲拉通X2100 二甲亚砜 DMF等添加剂的效果 结果表明吐温 280和DMF对DES和D IES具有分离能力 但对于吐 温 280 随着其浓度的增大 3组分的色谱峰高降低 对方法的检出限和稳定性不利 而DMF体积分数 的变化则对3组分的峰高没有影响 实验表明 当DMF的体积分数大于30 时 3组分能够完全基线 分离 随着体积分数不断增大 迁移时间相应增长 为缩短分析时间 选定DMF体积分数为30 21116 分离电压 进样时间与温度的选择 考察了分离电压对被测物迁移时间的影响 提高分离电 压可以缩短组分的迁移时间 但由于受到仪器限制以及考虑焦耳热的影响 选择分离电压为20 kV 选择进样时间为3 5 8 10 12 15 s 考察进样时间和组分峰高间的关系 结果表明 进样 5 s后 组分峰高增加不明显 且进样时间过长会对组分的分离产生负面影响 所以实验选择进样5 s 考察了15 20 25 30 时的迁移时间和组分峰高的变化 温度过低或过高 均会发生基线漂 移 所以选择实验温度为25 图2 标准品的毛细管电泳图 Fig12 Electropherogram of standard mixture EOF electroosmotic flow 1 HXS 2 DES 3 D IES 在上述优化条件下 HXS DES D IES 质量浓度均 为5010 mg L 在14 min内得到基线分离 见图 2 212 方法的重复性 线性范围及检出限 在优化条件下 将50 mg L的HXS DES D IES标准 溶液连续进样5次 迁移时间和峰面积的相对标准偏差 RSD 分别为015 017 016 018 重复性良好 配制不同质量浓度的HXS DES D IES的混合标准 溶液 在优化条件下考察其线性范围和检出限 结果见 表1 HXS DES和D IES的电泳峰面积与质量浓度约在 2个数量级范围内呈良好的线性关系 检出限 S N 3 为013 019 mg L 相关系数r 2 为01999 2 01999 8 表1 方法的标准曲线 线性范围 检出限及加标回收率 Table 1 Calibration curve linear range detection li mit and spiked recovery of the method n 5 CompoundRegression equation3r2 Linear range mg L 1 Detection limit mg L 1 Added A mg L 1 Found F mg L 1 Recovery R RSD sr HXSY 01166 3X 01459 301999 8210 1200195010451892319 DESY 01568 3X 11394 501999 2110 1000145010481898213 DIESY 01615 6X 01439 501999 4110 1000135010481998213 3Y peak area X mass concentration 75 分析测试学报第29卷 图3 鱼肉样品提取液的电泳图 Fig13 Electropherograms of HXS DES and D IES extracted from fish sample 1 HXS 2 DES 3 D IES A blank sample B fish sample 213 回收率实验及实际样品测定 将50 mg L的3种组分混合液直接添 加到绞碎的鱼肉中 按照 112 方法进 行萃取 浓缩 在优化条件下考察HXS DES和D IES的回收率 5次平行实验测得 的回收率均大于90 见表 1 结果表明 该方法可靠 在优化条件下 准确称取10 g绞碎后 的鱼肉2份 1份为空白试样 另1份添 加各含50 g的HXS DES和D IES对照 品 超声振荡20 min 按 112 实验方法处理样品 测得的电泳图谱见图3 测定结果见表2 由图 3可知 本实验建立的萃取方法用于水产品的测定不受基体干扰的影响 表2 实际样品测定结果 Table 2 Assay results of the analytes in fish sample n 3 CompoundAdded A mg L 1 Found F mg L 1 Extraction rate RSDsr HXS1010617167418 DES1010818488414 D IES1010910290317 参考文献 1 柳爱春 刘超 徐晓丹 等 水产品中己烯雌酚快速检测方法试验分析 J 现代农业科技 2009 15 353 354 2 樊德厚 中国药物大全 西药卷 M 3版 北京 人民卫生出版社 2006 254 255 3 CHAE K L I NDZEY J MCLACHLAN J A et al Estrogen2dependent gene regulation by an oxidative metabolite of di2 ethylstilbestrol diethylstilbestrol24 4 2quinone J Steroids 1998 63 3 149 157 4 UMBERGER E J BANESD KUNZE FM Chemical deter mination of diethylstilbestrol residues in the tissue of treated chickens J J AOAC Int 1963 46 3 471 479 5 ZHANG Shenghui WU Kangbing HU Shengshui Voltammertric determination of diethylstilbestrol at carbon paste elec2 trode using cetylpyridine bromide asmedium J Talanta 2002 58 4 747 754 6 HOFFMANN B WEI LER S Radioi mmunological determination of stilbene residues in tissue samples from pigs J Ar2 chiv2Fur2Lebens m Ittelhygiene 1986 37 6 137 142 7 BUSICO F MORETTI G CARTON I G P Deter mination of estrogens in animal tissues by GC MS with negative ion chemical ionization J J High Resolut Chromatogr 1992 15 2 94 98 8 郭志峰 安秋荣 刘鹏岩 鸡蛋中己烯雌酚的GC MS分析测定 J 质谱学报 1997 18 3 36 40 9 张红英 张宏 王淑惠 等 气相色谱 质谱法测定牛奶中的8种环境雌激素和内源性雌激素 J 中国卫生检 验杂志 2009 19 8 1713 1715 10 许泓 庞国芳 林安清 等 动物组织中多种残留非类固醇同化激素的液相色谱 串联质谱法同时测定 J 分 析测试学报 2007 26 6 837 840 11 杜志峰 黄金凤 郭新东 等 动