（纺织工程专业论文）纳米TiOlt2gt改性丝素蛋白多孔膜的制备及研究[纺织工程专业优秀论文].pdf

浙江理工大学硕士论文 纳米t i 0 2 改性丝素蛋白多孔膜的制备及研究 摘要 丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白 富含1 8 种氨基酸 是 种天然高 分子材料 无毒 可生物降解 和人体具有良好的生物相容性 近年来丝素蛋白在生物医 用材料方面的研究和应用得到了广泛的关注 如用做手术缝合线 药物缓释载体 隐形眼 镜 人工血管 人工肌键和韧带 创面覆盖物 硬脑膜修补材料 细胞培养基质等 但传 统的丝素膜在醇化处理后具有较大的脆性 阻碍了丝素蛋白在生物医用材料方面的研究和 应用 本课题组曾采用溶胶一凝胶法制备纳米改性再生丝素膜 并对其结构及性能进行了 研究 结果表明纳米t i 0 2 粒子促使丝素蛋白构象发生了转变 宏观上体现为丝素膜的水溶 性 力学性能及热学性能等得到了较好的改善 在此基础上 本文采用冷冻干燥的方法 制备了纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜 并对其结构与性能及降解和生物相容性进行了研究 本课题的主要工作内容及结论如下 1 采用冷冻干燥的方法成功制备了纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜 2 采用s e m x r d f t i r 等分析手段表征了纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜的表面和内部 形貌 微细结构 研究了纳米t i 0 2 对丝素蛋白构象的影响 结果如下 1 s e m 表明冷冻干燥后的纳米t i 0 2 丝素蛋白膜呈现多孔的结构 孔为不规则多角形 形态 孔与孔内部相互贯通 孔分布均匀 经压汞仪测试 平均孔径为2 2 6 81 t m 孔隙 率为8 5 一9 2 2 由x r d f t i r 测试表明 随着纳米t i 0 2 的加入 纳米t i 0 2 能够诱导丝素膜的构 象转变 由于丝素和纳米粒子形成分子间氢键 导致丝素分子重排 从无序状态转变为有 序排列 从而丝素的构象从无规线团或s i l ki 转变为s i l ki i 构象 并且纳米t i 0 2 的量增大 丝素蛋白的结晶度变大 3 测试纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜的机械性能 热学性能 透湿性 溶失率和溶胀度等 分析结果如下 1 拉伸测试表明 纯丝素多孔膜的断裂强度和初始模量很低 加入了纳米t i 0 2 制得 的丝素多孔膜的断裂强度和初始模量明显提高 而且随着纳米t i 0 2 加入量的增加不断增 大 2 t g a 和d t g 热分析 纯丝素多孔膜和纳米t i o z 丝素蛋白多孔膜t g a 曲线上只 有有一个明显的热转变区域 在3 0 0 左右 不同纳米t i 0 2 含量的丝素蛋白多孑l 膜的起始 浙江理工大学硕士学位论文 分解温度都比纯丝素蛋白多孔膜的有所提高 并随着纳米t i 0 2 含量的加大而增加 3 纯丝素蛋白多孔膜的透湿性最低 而加入了纳米t i 0 2 后 多孔膜的透湿性都有所 增加 4 经过冷冻干燥后的纯丝素多孔膜和纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜的含水率都比较低 在1 0 左右 经过冷冻干燥后的纯丝素多孔膜的溶失率为5 7 0 1 比室温干燥下的纯丝素 膜 一般溶失率1 0 0 要低很多 而加入了纳米t i 0 2 后 丝素多孔膜溶失率明显降低 最 低仅有9 4 7 4 对纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜进行人体模拟体液 s b f 降解和体外细胞培养 从而 研究其降解性能和生物相容性 结果如下 1 s b f 降解实验表明 随着降解时间的延长 多孔膜表面出现了明显的降解腐蚀的痕 迹 表现为孔洞界限逐渐被破坏 孔壁变得粗糙模糊 纯丝素蛋白多孔膜和纳米t i 0 2 丝素 蛋白多孔膜的失重率都随着时间的增长呈现逐渐增大的趋势 降解2 0 天后 多孔膜的失重 率都达到了3 5 以上 并且降解后的多孔膜的结晶强度呈现先增大后减小的趋势 另外 在多孔膜的内壁有羟基磷灰石的生成 2 生物相容性实验表明 细胞在各种配比的纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜上表现出良好 的粘附和增殖 多孔膜内壁上细胞的贴壁情况较好 细胞通过分泌的基质相互连接在一起 显示出细胞的亲和性 同时也表明了纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜良好的生物相容性 总之 本文采用冷冻干燥的方法制备了纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜 研究表明此种多孔 膜力学性能优良 透湿性良好 溶失率较低 具有良好的降解性和生物相容性 是一种良 好的组织工程支架材料 这也为今后丝素蛋白支架材料的制备方法的选择提供了参考依 据 关键词 丝素蛋白 纳米t i 0 2 多孔膜 降解性 生物相容性 l i 浙江理工大学硕士学位论文 s t u d ya n dp r e p a r a t i o no ft h en a n o t i 0 2m o d i f i e d s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m s a b s t r a c t s i l kf i b r o i ni sn a t u r a lp r o t e i no b t a i n e df r o ms i l k w o r ms i l k c o n s i s t i n g18k i n d so f a m i n oa c i d s i l kf i b r o i ni sap o l y m e rm a t e r i a lw i t l lt h ep r o p e r t i e so fi n n o c u i t y r e s o l v a b i l i t ya n d s u p e r i o rb i o e o m p a t i b i l i t y r e c e n t l y t h er e s e a r c ho fs i l kf i b r o i ni nb i o m e d i c i n eh a sr e c e i v e dm o r e a n dm o r ea t t e n t i o n s u c ha ss u t u r e c o n t r o l l e dr e l e a s eo fm e d i c i n e c o n t a c tl e n s e s m a n u a lv e i n a r t i f i c i a ll i g a m e n ta n dm u s c l et e n d o n w o u n dd r e s s i n g c e l lc u l t u r em a t r i x b u tp u r es i l kf l b r o i n m e m b r a n ei sb r i t t l ea f t e ri n s o l u b i l i z a t i o nw i t ha l c o h o l i z a t i o nm e t h o d w h i c hr e s t r i c t st h e a p p l i c a t i o no fs i l kf i b r o i ni nb i o m a t e r i a l s i no u rg r o u p t h er e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i n n a n o t i 0 2 m e m b r a n e sh a db e e np r e p a r e db ys o l g e lm e t h o da n dt h e i rc o n f o r m a t i o na n dp e r f o r m a n c eh a d b e e ns t u d i e d t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tn a n o t i 0 2c o u l di n d u c et h ec o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o n o fs i l kf i b r o i n f o rt h er e f l e c t i o no nt h ei m p r o v e m e n to fw a t e r s o l u b i l i t y m e c h a n i c a lp r o p e r t y a n dt h e r m a lp r o p e r t y b a s e do nt h e s er e s u l t s i nt h i sp a p e r w ep r e p a r e dn a n o t i 0 2 s i l kf i b r o i n p o r o u sf i l m sb yf r e e z e d r y i n g a n di n v e s t i g a t e dt h ed e g r a d a b i l i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t y n em a i n w o r ka n dc o n c l u s i o n sa r el i s t e da sf o l l o w s 1 t h en a n o t i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m sw e r es u c c e s s f u l l yp r e p a r e db yu s i n gt h e f r e e z e d r y i n gm e t h o d 2 t h ea p p e a r a n c ea n dc o n f i g u r a t i o no ft h en a n o t i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m sw e r e c h a r a c t e r i z e db yu s i n gs e m x r d f t i r n l ee f f e c to fn a n o t i 0 2o nt h ec o n f o r m a t i o no fs i l k f i b r o i nw a ss t u d i e da n dt h e s er e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s 1 t h es e m r e s u l t si n d i c a t e dt h a tb yf r e e z e d r y i n g t h ep o r e so ft h en a n o t i 0 2 s i l l f i b r o i n p o r o u sf i l m sw e r el i n k e dt oe a c ho t h e r a n dt h es h a p eo ft h e s ep o r e sw e r ei r r e g u l a rp o l y g o n a la n d d i s t r i b u t e du n i f o r m l y t h ea v e r a g ep o r ed i a m e t e rw a sf r o m2 2 6 8l x m a n dp o r o s i t yw a sf r o m 8 5 9 2 2 t h ex r d a n df t i ra n a l y s i si m p l i e dt h a tt h ef o r m a t i o no fn a n o t i 0 2p a r t i c l e sm i g h t i n d u c et h ec o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o no fs i l kf i b r o i nf r o mt h et y p i c a ls i l kit ot h et y p i c a ls i l k1 i s t r u c t u r ep a r t l yw i t ht h ei n c r e a s i n go fc r y s t a l l i n i t yi nt h ep o r o u sf i l m s 3 t h em e c h a n i c a lp r o p e r t y t h e r m a lp r o p e r t y w a t e rp e r m e a b i l i t y w a t e r s o l u b i l i t ya n d i i i 浙江理工大学硕士学位论文 s w e l l i n gp r o p e r t yo fn a n o t i 0 2 s i 墩f i b r o i np o r o u sf l m sw e r em e a s u r e d a n dt h e s er e s u l t sh a d b e e ns t u d i e da sf o l l o w s 1 t e n s i l es t r a i nr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t r e n g t ha n dy o u n g sm o d u l u so fp u r es i l kf i b r o i n p o r o u sf i l m sw e r ev e r yl o w a n dt h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e so fn a n ot i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u s f i l m sw e r ee n h a n c e de v i d e n t l y 2 t g aa n dd t ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e r ew a so n l yo n e o b v i o u sh e a tc o n v e r s i o na r e aa t t h et e m p e r a t u r eo fa b o u t3 0 0 c i nt h ed t gc u r v e so fp u r es i l kf i b r o i np o r o u sf i l m sa n d n a n o t i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m s b yc o m p a r i s o n t h eb e g i n n i n gd e c o m p o s e dt e m p e r a t u r eo f n a n ot i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m si n c r e a s e d 埘mt h en a n ot i 0 2a d d e d 3 t h ew a t e rp e r m e a b i l i 够o fp u r es i l kf i b r o i np o r o u sf i l m sw a st h el o w e s t a n di n c r e a s e d w i t ha d d i n gt h en a n ot i 0 2i ns i l kf i b r o i n 4 t h em o i s t u r er a t eo fn a n ot i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m sw a sl o w a b o m10 b y f r e e z e d r y i n g t h ew a t e r s o l u b i l i t yo fp u r es i l kf i b r o i np o r o u sf i l m sw a s5 7 01 w h i c hl o w e r t h a np u r es i l kf i b r o i nf i l m sb yd r y i n ga tr o o mt e m p e r a t u r e w i t ht h ea d d i n go fn a n o t i 0 2 t h e w a t e r s o l u b i l i t yo fp o r o u sf i l m sd e c r e a s e dm a r k e d l y a n dt h el o w e s ti so n l y9 4 7 4 t h en a n ot i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m sw e r eu s e dt oi nv i t r od e g r a d a t i o ni ns i m u l a t e d b o d yf l u i d s b f a n dc e l lc u l t u r e a n dr e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s 1 i nv i t r od e g r a d a t i o nb e h a v i o rs h o w e dt h a t t h es u r f a c eo ff i l m sa p p e a r e dt h et r a c e so f c o r r o s i o n f o rt h et h ep e r f o r m a n c eo ft h ed e s t r o y e dp o r e sa n dt h er o u g hp o r ew a l l w i t ht h e d e g r a d a t i o n t h ew e i g h t l o s so fn a n ot i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m si n c r e a s e dg r a d u a l l y a f t e r2 0 d a y so fd e g r a d a t i o n t h ew e i g h tl o s sw a su pt o35 功ec r y s t a l l i n i t yo ff i l m sw a si n c r e a s e da n d t h e nd e c r e a s e d i na d d i t i o n t h ef o r m a t i o no fh y d r o x y a p a t i t ew a sa p p e a r e di n s i d et h ep o r o u s f i l m s 2 t h ec e l lc u l t u r ee x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tc e l lh a daw e l la t t a c h m e n ta n dp r o l i f e r a t i o n o nt h en a n ot i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m s t h ec e l ll i n k e dt oe a c ho t h e ra n dg r e ww e l li n s i d et h e p o r ew a l l w h i c hi m p l i e dt h es u p e r i o rb i o c o m p a t i b i l i t yo ft h en a n ot i 0 2 s i 墩f i b r o i np o r o u s f i l m s i naw o r d t h en a n ot i 0 2 s i l kf i b r o i np o r o u sf i l m sw e r ep r e p a r e db yf r e e z e d r y i n g t h e e x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e s e f i l m sh a v em a n ye x c e l l e n tc h a r a c t e r i c s s u c ha sg o o d m e c h a n i c a lp r o p e r t i e s f i n ew a t e rp e r m e a b i l i t y l o ww a t e r s o l u b i l i t y g o o dd e g r a d a b i l i t ya n d t v 浙江理工大学硕上学位论文 b i o c o m p a t i b i l i t y t h i sp r o v i d e dr e f e r e n c ef o rt h ep r e p a r a t i o no fs i l kf i b r o i ns c a f f o l d si nf u t u r e k e y w o r d s s i l kf i b r o i n n a n oz i 0 2 p o r o u sf i l m s d e g r a d a b i l i t y b i o c o m p a t i b i l i t y v 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明 我恪守学术道德 崇尚严谨学风所呈交的学位论文 是本人在导师的 指导下 独立进行研究工作所取得的成果除文中已明确注明和引用的内容外 本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容论文为本人亲自撰写 我对 所写的内容负责 并完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 郄匆分 r 期 沙9 年上月4 日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定 同意学校保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅或借阅本人授权浙江理工大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 学位论文作者签名 日期 少叼年土 保密口 在 不保密 年解密后使用本版权书 括导教师签名 日期 年月日 独帅 侈 谚承月 浙江理工大学硕士学位论文 1 1 丝素蛋白的组成及主要结构 第一章前言 我国早在5 0 0 0 年前就有了养蚕的历史 历来以养蚕一缫丝一织绸为传统产业 是著名 的产丝大国f i 随着科学技术的进步 蚕丝在非服饰领域的研究越来越引人注目 蚕丝的 独特物理 化学性能主要来源于其主要成分 丝素蛋白 用丝素蛋白可以制成多种形态 的材料 如 凝胶 粉末 纤维和膜等 2 近年来 由于其特殊的物理化学性质 丝素蛋 白的研究备受关注 1 1 1 丝素蛋白的组成 丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白 含量约占蚕丝的7 0 8 0 含有 1 8 种氨基酸 见表1 3 1 其中甘氨酸 g l y 丙氨酸 a l a 和丝氨酸 s e r 约占总组成的 8 0 以上 这三种氨基酸的摩尔比大约为4 3 1 其中小侧基的甘氨酸 丙氨酸和丝氨酸 等位于丝素蛋白的结晶区 约占总组成的8 5 而带有较大侧基的苯丙氨酸 酪氨酸 色 氨酸等则主要存在于非结晶区 丝素蛋白结晶区的比例结晶度为4 0 5 0 主要由6 个 a g s g a g 序列组成 纤维中存在的结晶区与非结晶区是交替分布的 每一个结晶区和非结 晶区都含有若干条肽链的链段 而每条肽链都通过若干个结晶区和非结晶区 且各条肽链 大体上是沿着纤维外形的延伸方向排列的 4 这是整个丝素中肽链排列的大致形象 浙江理工大学硕士学位论文 表1 1 丝素蛋白的氨基酸组成 k i r i m u r a l u c a s s a s a k is h i m u r a q i a n g l y 4 6 1 14 4 64 5 24 2 9 4 4 4 9 a l a2 9 4 l2 9 42 9 63 0 o2 9 1 8 v 甜2 0 92 2 02 1 02 52 2 7 l e uo 4 2 0 5 3 0 4 50 60 4 9 i i e0 5 4o 6 6o 6 2o 60 6 4 p h e0 5 6o 6 3o 6 00 7o 6 6 即 5 2 75 1 74 2 64 86 6 6 s e r1 1 3 l1 2 18 9 51 2 21 0 2 1 t h r 0 7 8o 9 1 0 5 7 0 9 0 8 8 c y s 0 0 20 2 0o 0 30 0 9 m e t0 0 50 1 0o 10 0 7 t r y 0 1 4o 1 1o 2 0 p r o o 4 4 0 3 6o 50 3 6 a s p 1 0 51 3 01 6 9 1 91 6 0 g l uo 9 61 0 21 1 91 41 1 6 a 唱 o 4 20 4 70 3 70 50 4 9 l y s o 2 5 0 3 2o 2 90 4o 3 3 h i s0 1 70 1 40 1 5 0 2o 2 2 1 1 2 丝素蛋白的构象 丝素通常有3 种二级结构 构象 即无规线团 r a n d o mc o i l a 一螺旋 a h e l i x b 一折叠 1 3 s h e e t a 一螺旋是由链内氢键引起的蛋白结构 结构中每隔3 6 个氨基酸残基螺旋 上升一圈 在螺旋体中氨基 羧酸基侧链向外伸出 相邻的螺旋圈之间形成链内氢键 氢 键的取向与中心轴平行 p 结构是由链间氢键引起的蛋白结构 是一种肽链相当伸展的结 构 其中肽链层层排列 依靠相邻肽链上的 c o 与对卜 h 形成的氢键来维持其稳定的结构 当0 角蛋白用热水和稀碱方法处理或者在外力下拉直时 0 角蛋白就会转变为p 角蛋白 当a 螺旋被拉长伸展后 氢键被破坏形成折叠链空间结构 5 有研究表明 丝素蛋白中还存在 2 浙江理工大学硕十学位论文 另一种由4 个氨基酸残基组成的发夹式结构p 一转角 b t 哪 6 1 丝素在未结晶时是无规构象丝素在此种状态下链段的排列不整齐 链段之间的结合力 较弱 在水中易溶胀而溶解 柔软度高 抵抗外力拉伸的能力弱 吸湿性强 对酸 碱 盐 酶和热的抵抗力较弱阴 丝素在结晶时主要有两种结晶构象s i l ki 和s i l ki i s i l ki 晶体模型由b l o t s 提出 8 其立体构象呈曲柄型 是介于仅 螺旋和d 折叠之间的一种中间状态 晶胞参数为 a 4 7 2 a b 1 4 4 a c 9 6 a 丝素溶液在0 5 0 干燥时得到s i l ki 无定形丝素膜在热水中处理 温 度在0 5 0 时 也可产生s i l ki s i l ki i 的晶体结构模型e hm a r s h t 9 根据x r a y 衍射结果提出 是反平行b 折叠层结构 晶胞参数为 a 9 4 0 a b 6 9 7 a c 9 2 0 a 肽链链段的排列比较整齐 相邻链段之间的 氢键和分子间引力使它们结合得相当紧密 抵抗外力拉伸的能力强 在水中难以溶解 对 酸 碱 盐 酶和热的抵抗力较强 丝素溶液在5 0 以上干燥时得到s i l ki i 将一定浓度 的丝素溶液搅拌也可以产生s i l ki i 在电场作用下发生定向排列形成s i l ki i 热水中处理 在6 0 时得到s i l ki i 丝素膜在甲醇 乙醇等水合作用较强的溶剂中处理也可得到s i u h r e g i n a v 等 l o 近年来发现了新的丝素结晶形态s i l ki i i 它存在于丝素溶液一空气界面 上 其晶体结构与聚甘氨酸i i 相似 属六方晶系 肽链的立体构象为3 一折叠螺旋 模型 如图1 1 所示 图1 1s i l k u l 构象模型 现在我们通常把丝素蛋白分子的构象分为两类 即水溶性的s i 墩i 结构和非水溶性的 s i l ki i 结构 s i l ki 结构主要包括无规线团和a 一螺旋 s i l ki i 结构主要包括p 一折叠 通 过改变温度 溶剂极性 溶液值和应力作用可使s i l ki 变为s i l ki i 丝素中的结晶区比例可 达6 0 t 1 1 1 但在由丝素蛋白制成的丝素膜中 结晶区的比例很低 只有1 左右 1 2 使得 丝素膜几乎全部溶于水 所以一般来说 丝素膜需经迸一步处理 使其结晶区比例增大 我们称这个过程为b 化 1 3 浙江理工大学硕士学位论文 1 1 3 丝素蛋白的应用 丝素蛋白质与其他天然高分子相比有明显的优越性 1 4 1 研究表明它具有良好的生物相 容性 无毒 无污染 无刺激性 可生物降解 因此 众多学者致力于研究开拓丝素蛋白 应用的新领域 比如用于临床上如用作手术缝合线 食品添加剂 化妆品辅料等 由于蚕 丝具有很好的活体亲和性 近年来 许多实验室正着眼于新型蚕丝生物材料的研制与利用 研究 如应用于生物传感 生物医学材料 软组织相容材料 组织工程等领域 l5 a l t m a n 等 16 认为丝素具有如下优点 1 与其他天然纤维和许多高性能合成纤维相比 有独特的力 学性能 2 在外科领域的应用已有很长历史 3 可以通过不同处理方法获得膜或其他 形态 而且工艺相对简单 4 可以通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰较容易地改 变表面性能在体内外 5 可以缓慢降解对生物体无危险性 丝素膜制作简单方便而研究较多 丝素膜即可从熟蚕丝腺中取出的丝素制得 也可用 溶解的丝素制作 它作为一种天然蛋白膜 已被用作人工皮肤 人工肺等医学代替材料 也被用作固定酶 抗体 抗原等生物活性物质的载体 l 刀 由丝素蛋白制备的丝素膜是一种优良的固定化酶载体 它在生物传感器应用方面的研 究报道很多 d e m u r a 和a s a k u r a 1 8 等于1 9 8 9 年首次将丝素膜固定化葡萄糖氧化酶生物传 感器应用于分析系统 现在 丝素膜作为一种优良的酶固定剂 已被广泛应用于生物传感器 和其他探测器 1 9 1 吴徵宇 2 0 等用丝素膜制成 人造皮肤 创面保护膜和新鲜猪皮在兔身上作对比试验 结果显示丝素膜的各项性能均优于猪皮 在深i i 度创面和浅i i 度创面临床试验中 具有良 好的透湿性和与创面的粘附性 促进了创面愈合 与胶原蛋白一样 蚕丝素蛋白对体外培养的动物细胞有良好的吸附作用 对维持细胞 功能也有重要作用 早在1 9 9 5 年 就有学者研究了鼠l 9 2 9 细胞在丝素蛋白膜上的生长情况 并与其在胶原蛋白上的生长情况加以对比 证明细胞在丝素蛋白膜上的生长速度与在胶原 上的生长速度相当 近年来 对丝素作为生物材料应用于细胞培养和组织工程的体内外实 验研究 首先要评价在组织培养板中二维的丝素薄膜对细胞的粘附 增殖的影响 m i n o u r a 等 2 1 发现从日本家蚕和柞蚕获得天然丝素蛋白薄膜上鼠l 9 2 9 细胞的粘附 伸展和增殖与 胶原薄膜没有显著性差异 g o t o h 等瞄 i o u y e 等 2 3 1 随后发现用9 0 9 5m o l l 溴化锂溶解得 到的蚕丝蛋白可以很好的支持人和动物细胞系的粘附和增殖 f u r u z o n o 等人1 2 4 研究了成纤 维细胞l 9 2 9 在蚕丝素蛋白膜上的附着和增殖情况 证实了蚕丝素蛋白用哺乳动物细胞培养 4 浙江理工大学硕士学位论文 基质的可行性 u n g e r 等人 2 5 1 以蚕丝素蛋白纤维为细胞培养支架 观察到人的成纤维细胞 角质细胞 神经胶质细胞 成骨细胞 上皮细胞 内皮细胞的附着和生长情况 除了内皮细胞 其余 细胞均能沿三维空间扩散 当细胞覆盖纤维表面后 其余细胞开始向纤维间隙伸展 细胞 间形成组织样结构而连接紧密 内皮细胞情况不同 可能与内皮细胞本身性质有关 i n o u y e 等人 2 6 1 利用蚕丝素蛋白作为基质 来培养人的结肠癌细胞及肺癌细胞等 均取 得了不错的效果 细胞生长情况良好 与胶原相比效果相当 丝素多孔材料的研究 纯丝素蛋白膜经不溶化处理以后表现出较强的脆性 这限制了丝素蛋白在生物医学方 面的应用 很多学者致力于丝素蛋白新材料的制备 如通过探索不溶性丝素膜的制备方法 通过物理共混 化学改性 接枝聚合等进行丝素蛋白材料的改良 2 7 4 3 1 近年来 许多学者对生物降解支架的研究越来越广泛 生物降解支架 b i o d e g r a d a b l e s t e n t s b d s 是大分子聚合物 删 它是在完成对血管的机械性支撑所用之后 根据降解度 的不同在不同的时间内分解为c 0 2 和h 2 0 同时因大分子聚合物间有一定的空隙 可用特 殊的制造工艺将特定的药物掺入到降解支架中 随着材料的降解使用将药物输送到局部 4 5 1 使局部药物浓度提高 并根据携带不同种类的药物以发挥不同的药理作用 h u t r n a c h e rd w 47 认为 符合此支架的材料应具备以下性能 1 良好的生物相容性和 生物可降解性 无明显的炎症反应 免疫性和细胞毒性 2 具有足够的力学强度 在 患者的正常活动中不变型 不塌陷 3 高孔隙率 材料的孔隙率一般不低于9 0 利 于细胞黏附 营养和氧气进入 代谢产物排出及携带药物等 4 高表面积 5 其 性质有利于细胞黏附 增殖和分化 6 易于重复制作 可以加工成各种形状和结构 可预先制成 定形状 为组织提供支撑 并维持一定时间直至组织具有自身生物力学特性 7 材料易于消毒 而人们通过对丝素蛋白进行改性制备的支架恰恰能满足这些要求 随着组织工程的兴起和对支架材料的需求 以及丝素蛋白本身良好的可讲解性和生物相容 性 丝素材料制备的焦点日益转到丝素多孔支架材料的制备上来 1 2 1 多孔材料的研究方法 已有报道凝胶 海绵体 胶原质纤维以及其它的天然聚合物材料 作为细胞的支架材 料 应用于软骨 骨头 皮肤和神经等等的再生 因此具有多孔的丝素材料对组织工程来 5 浙江理t 大学硕士学位论文 说非常重要 近来报道的制造多孔材料的方法有五种 4 s 5 6 1 冷冻干燥法 是将聚乳 物的溶液在一定的温度下冷冻 然后在真空下干燥 使溶剂直接升华出来 原来存在于聚 合物中的冰核子经升华后将形成孔洞 从而制得多孔膜 2 盐过滤法 是在丝素的六 氟异丙醇 f t i p 溶液中加入一定量的盐粒子 成膜后用水溶解掉膜中的盐 得到一定孔径 和密度的多孔膜 可以通过加入盐粒子的多小 大小来控制所成的多孔膜的孔径大小和密 度 3 气体发泡法 以碳酸盐为致孔剂 将碳酸盐颗粒均匀分散在溶液凝胶中 然后放 入热水中使碳酸盐分解生成c 0 2 即可得到连通性好的多孔支架 4 热致相分离法 是 将聚合物溶于一定比例的二氧六环 水混合物中 形成澄清的溶液后在浊点以上2 0 恒温 3 0m i n 分别经过淬火 冷冻干燥和真空干燥等步骤得到多孔支架 以纯二氧六环作溶剂时 聚合物溶液发生固一液相分离 所得多孔材料的孔径在1 0 一1 0 0l x m 范围 孔隙率最高可达 9 1 5 溶解聚合物法 是将两种聚合物的溶液以一定比例混合均匀 然后经干燥法成 膜 用溶剂溶解掉混合膜中其中一种组份 得到多孔的混合膜 这些多孔材料对组织工程 支架来说具有好的多孔性和良好的机械性能 1 2 2 冷冻干燥法制备丝素多孔膜的研究 采用冷冻干燥法制备丝素凝胶体在国内外都有广泛的研究 苏州大学孙东豪等 57 利用 双扩散原理 采用冷冻干燥法制得了多孔丝素海绵体 该纯丝素凝胶是一种具有多孔结构 的淡黄色海绵状固体 结构中包含了无规卷曲 s i l ki s i l ki i 三种不同的构象 浙江大学闵 思佳等 5 8 采用环氧化合物作为交联剂用浓度为7 的丝素溶液制得水凝胶体 其压缩强度 可达0 9 8m p a 压缩变形率可达7 9 丝素膜作为组织工程三维支架材料要求具有高度贯穿多孔的特征 充当细胞培养基质 时 孔隙率对于提供细胞迁移和平铺足够机会是很关键的 通常认为相通的孔直径大于1 0 0 岬是所需的最小值 5 9 1 实验证明孔径为1 0 0 1 5 0g r n 时 皮肤细胞增殖得很好 能快速修 复烧伤皮肤 在动物的皮肤移植实验中也表明孔径大对皮肤细胞在丝膜上的生长很有必 要 多孔结构是丝膜用于细胞培养过程所必不可少的一个特征 另外 不论是暴露于体内 还是体外环境 支架都必须具有一定程度的韧性和强度 否则在培养期间丝素膜的破裂 卷曲等情况都将影响到细胞的生长分化 但是随着孔径的增大 丝膜的强度和拉伸性必定 有所降4 氐t 6 0 l y a s u s h it 锄a d a 6 1 采用将含有少量有机物的丝素液简单的冷冻一解冻法制备多孔3 d 丝素海绵体 该法不需要冷冻干燥 化学交联 或是添加其它高分子聚合物 x r d 和f t i r 6 浙江理工大学硕士学位论文 实验表明海绵体中存在s i l ki 和s i l ki i 结构 在这个过程中部分无规构象的丝素分子向p 结 构转变 经处理后材料的拉伸性能有少量的下降 但丝素海绵体经高温灭菌后形态未发生 变化 因此丝素海绵体可以用高温灭菌 由此法制得的丝素海绵体有望用于组织工程支架 因为构成海绵体的丝素蛋白是生物相容性的 具备多孔结构且具有一定的机械性能 适合于 细胞的生长 李明忠等 蚓采用冷冻干燥法可以制得丝素多孔膜 其内部丝素的结构以无定形为主 含少量s i l ki i 平均孔径可在1 0 3 0 0 哪范围内调节 这种丝素多孔膜具有良好的生物相 容性 并可在丝素多孔膜中进行人表皮细胞的培养 毛细血管和成纤维细胞等能够长入其 内而成活 刘明 6 3 利用傅里叶变换红外光谱 f t i r 研究了丝素凝胶在冷冻干燥前后二级结构的变 化 发现在冷冻干燥过程中 丝素蛋白中分子链内p 一折叠结构含量增加 分子链间p 一折叠 结构含量减少 并有部分无规卷曲结构转变为d 一折叠结构 但冷冻干燥前后总的p 一折叠结 构含量变化不大 闵思佳等脚 以1 0 1 0 0e d l 不同浓度的丝素水溶液与二缩水甘油基乙醚反应得到平均 孔径约1 0 0 3 0 0 岬的多孔丝素凝胶i c p f g 为材料 研究其理化性质和生物相容性 结果 表明 c p f g 的最大拉伸强度达1l m m 2 伸度达7 9 压缩回复率达1 0 0 吸水率达1 5 0 0 c p f g 在中性溶液中较稳定 很少有丝素蛋白质溶出 而胰蛋白酶对c p f g 有分解性 成纤 细胞表面培养显示c p f g 有较好的生物相容性 问县判6 5 1 采用热致相分离 t i p s 结合冷冻干燥技术制备了聚醚酯多孔支架 其孔间 相互贯通 表面孔径大于底面孔径 由于分相过程中热力学推动力增大和相区融合阻力增 加的相互作用 孔径随着粗化湿度的降低呈现先升后降的趋势 并在0 c 时出现最大值 1 3 纳米t i 0 2 的性质 近年来 随着纳米技术的不断发展 纳米复合材料的制各及其性能研究已成为当今材 料研究领域的热点问题之一 有机 无机纳米复合材料近几年发展迅速 受到学者的高度关 注 以聚合物为载体的无机纳米复合材料综合了无机 有机和纳米材料的优良特性 使得 有机 无机纳米复合材料具有常规聚合物复合材料所没有的结构 形态以及比常规聚合物复 合材料更优异的物理力学性能 耐热性和气体液体阻隔性能以及良好的机械 光 电和磁 等功能特性 因而显示出非常重要的科学意义 6 6 1 纳米复合材料的制备方法很多 其中溶胶 凝胶法是最常用的方法之一 利用溶胶 凝 7 浙江理工大学硕士学位论文 胶技术 能够在较温和的条件下制备出比较理想的有机 无机纳米复合材料 因此 溶胶 凝胶技术在纳米复合材料制备中的应用 为纳米复合材料的实际应用开辟了更加广阔的前 景 纳米t i 0 2 有许多独特的性能 如比表面积大 平均粒径1 0 一1 0 0n i i l 的纳米粒子 其 比表面积大约为1 0 7 0m 2 g 表面张力大 熔点低 磁性强 光吸收性能好 且吸收紫外 线的能力强 表面活性大 热导性能好 在低温或超低温下几乎没有热阻 分散性能好 用以制成的悬浮体稳定 不沉降 可改善油漆 油墨一类的产品性能 粒径小 分散能力 强 在水和油等溶剂中得到的流体有和液体分子同样的行为 完全不必担心磨损的问题 6 7 1 单一的有机聚合物材料往往存在着一些不足之处 如热稳定性 力学强度较差等等 往往 需要通过接枝 掺杂其它物质的方法对其性能进行改善 将有机相与t i 0 2 在纳米尺寸范围 内复合生成的有机一t i 0 2 纳米复合材料 不仅具有纳米材料的表面效应 量子尺寸效应等 性质 而且还能够将纳米t i 0 2 所具有的刚性 热稳定性 紫外屏蔽 光吸收等性能与聚合 物的韧性 易加工性及介电性能揉和在一起 从而制备出了很多具有独特性能的材料1 6 引 在涂料 机械 光学 生物学等领域展现出广阔的应用前景 6 9 1 有机一t i 0 2 纳米复合材料 的制备是纳米复合材料研究领域的热点问题之一 8 浙江理工大学硕士学位论文 第二章课题的研究意义和主要工作内容 蚕丝是人类最早利用的天然蛋白质材料之一 丝素蛋i 刍 s i l kf i b r o i n 是从蚕丝中提取的 天然高分子纤维蛋白 含量约占蚕丝的7 0 8 0 由乙氨酸 丙氨酸及丝氨酸等1 8 种氨 基酸所组成 丝素蛋白具有优良的物理特性和化学特性 并具备纯度高 来源广 价格低 廉等优点 丝素蛋白所具有的特殊微细结构和多级空间结构 能很好地与生物体相容 随 着生物医药技术和其他高新技术的迅速发展 国内外对蚕丝 特别是经过脱胶后的丝素蛋 白新功能材料的开发和综合利用日趋广泛 但是 未经进一步处理的丝素蛋白膜还存在易溶解等缺点 为了改善丝素膜的溶解性 能 目前通用的方法是将再生丝素膜用乙醇或甲醇处理 而这种经醇化方法处理得到的丝 素膜易破碎 基于这一点 本课题组曾将钛酸丁酯 乙醇溶液加入到丝素蛋白溶液中 采用 溶胶凝胶法制备了纳米t i 0 2 改性丝素蛋白膜 并对其结构及性能进行了研究 实验结果表 明 纳米t i 0 2 能较好地分散在纳米改性再生丝素膜中 形成无机粒子嵌入式有机 无机网 络结构 而纳米t i 0 2 粒子的加入促使丝素蛋白构象发生了转变 表现为丝素膜的水溶性能 热学性能和机械性能得到较好的改善 本课题在此基础上 尝试采用冷冻干燥的方法制备 了纳米t i 0 2 丝素蛋白多孔膜 冷冻干燥作为一种温和