人工听骨链重建材料生物相容、特及修复喉软骨缺损的效果.doc

www.CRTER.org郭蓓，等. 人工听骨链重建材料生物相容性、特性及修复喉软骨缺损的效果人工听骨链重建材料生物相容性、特性及修复喉软骨缺损的效果郭 蓓，袁 琨，陈 伟(华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院，湖北省武汉市 430014)引用本文：郭蓓，袁琨，陈伟. 人工听骨链重建材料生物相容性、特性及修复喉软骨缺损的效果J.中国组织工程研究，2016，20(25):3713-3719.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.010 ORCID: 0000-0003-3339-7895(郭蓓)文章快速阅读：骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料可有效修复喉软骨缺损郭蓓，女 ，1978年生，湖北省武汉市人，汉族， 2010年武汉大学毕业，硕士，主治医师，主要从事耳鼻咽喉、头颈外科方面的研究。通讯作者：袁琨，主任医师，华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院，湖北省武汉市430014中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)25-03713-07稿件接受：2016-05-07骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料骨形态发生蛋白多孔听骨羟基磷灰石骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料修复喉软骨缺损部位出现较多的结缔组织及明显骨性结节，且材料降解速度较快观察大体情况及病理形态学变化修复喉软骨缺损文题释义：软骨不易修复的原因：由于软骨的代谢活跃而修复能力有限，没有血管的供应，在损伤之后不能形成纤维凝块，没有炎性细胞迁移进入，也没有血管未分化细胞进入损伤的部位，所以不易进行修复。另外，软骨本身在损伤部位缺乏未分化的细胞，软骨细胞是一种高分化的细胞，损伤之后不能够迁移生长到损伤的软骨之中，而随着年龄的增长，软骨细胞的分裂能力是降低的，同时产生细胞基质的能力也是降低的。多孔羟基磷灰石的特点：能为纤维细胞和骨组织向其中生长提供通道和生长空间，增大组织液与羟基磷灰石接触表面积，加快反应过程。相互连通的孔隙有利于组织液的微循环并为羟基磷灰石深部的新生骨组织提供营养，使界面的软硬组织都长入孔隙内，形成纤维组织和新生成的骨组织交叉结合状态。这种界面能保持人体正常的代谢关系，使骨-材料界面结构具有生理结合。多孔羟基磷灰石具有独特的骨架结构，植入肌肉或韧带等软组织后，容易被一薄层结缔组织紧密包裹，作穿皮种植时能与颈部和上皮组织密合，无炎症或感染发生，也可用于人工血管、气管等软组织的修复。摘要背景：喉软骨缺损替代品较多，包括自体软骨、同种异体软骨以及金属支架等，这些材料在喉软骨缺损中均能取得理想效果，但是也存在许多不足。目的：研究人工听骨链重建材料生物相容性及其特性，探讨人工听骨链重建材料在喉软骨缺损中的修复效果。方法：从新鲜人骨中提取骨形态发生蛋白，将羟基磷灰石高温煅烧后制备多孔羟基磷灰石，将获得的多孔羟基磷灰石听骨放入骨形态发生蛋白溶液中，制备骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料，分析材料的生物相容性及特性。将40只新西兰雄性成年白兔随机分为多孔羟基磷灰石组和人工听骨链重建材料组，每组20只。制备新西兰雄性成年白兔喉软骨缺损模型，多孔羟基磷灰石组采用多孔羟基磷灰石材料进行修复，人工听骨链重建材料组采用骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料修复。结果和结论：不同孔隙率人工听骨重建材料抗压强度和抗压强度差异有显著性意义；骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料外表面空洞未形成对称性球状，外观表现为多边形，空隙尺寸为100-200 m；2组大鼠分别植入骨形态发生蛋白-多孔羟基磷灰石和骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料后未见明显的不良反应。但人工听骨链重建材料组出现较多的结缔组织及明显骨性结节，且材料降解速度较快。提示骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料具有良好的生物相容性和特性，利用其修复喉软骨缺损效果理想，具有较高的临床应用价值。3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Guo Bei, Master, Attending physician, Affiliated Wuhan Central Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430014, Hubei Province, ChinaCorresponding author: Yuan Kun, Chief physician, Affiliated Wuhan Central Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430014, Hubei Province, China关键词：生物材料；软骨生物材料；人工听骨链重建材料；生物相容性；喉软骨缺损；修复；多孔羟基磷灰石；骨形态发生蛋白；修复效果；抗压强度；河北省自然科学基金主题词：软骨；组织相容性；组织工程基金资助：2013年河北省自然科学基金项目(2013CFC082)Artificial ossicular chain reconstruction: biocompatibility, properties and laryngecartilage defect repair Guo Bei, Yuan Kun, Chen Wei (Affiliated Wuhan Central Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430014, Hubei Province, China)AbstractBACKGROUND: Defected Laryngeal cartilage has many alternatives, including autologous cartilage, allograft cartilage and metal stents. Although these materials can achieve desired outcomes in laryngeal cartilage defect repair, certain limitations exist.OBJECTIVE: To investigate the biocompatibility and properties of artificial ossicular chain reconstruction materials, and to explore the effect of artificial ossicular chain reconstruction materials on laryngeal cartilage defect repair.METHODS: Porous hydroxyapatite otosteon was prepared by high-temperature calcination of hydroxyapatite, followed by cultured in bone morphogenetic protein solution extracted from fresh human bone to construct bone morphogenetic protein-hydroxyapatite artificial ossicular chain reconstruction material. And then, the biocompatibility and characteristics of the material were analyzed. Forty adult male New Zealand white rabbits were randomly divided into porous hydroxyapatite group and artificial ossicular chain reconstruction material group (n=20 per group), and underwent repair with porous hydroxyapatite material and bone morphogenetic protein-hydroxyapatite artificial ossicular chain reconstruction material respectively after modeling of laryngeal cartilage defect. RESULTS AND CONCLUSION: There was a significant difference in compressive strength of artificial ossicular chain reconstruction materials with different porosities. No symmetry sphere formed in hollows of the outer surface of the material, with polygonal appearance and with a pore size of 100-200 m. There were no obvious adverse reactions in both two groups after implantation, but in the artificial ossicular chain reconstruction material group, numerous fibrous connective tissues and obvious bone nodules appeared, and the degradation rate of the material was faster. These results suggest that the bone morphogenetic protein-hydroxyapatite artificial ossicular chain reconstruction material exhibits good biocompatibility and properties, which will obtain satisfactory outcomes for laryngeal cartilage defect repair. So, the material holds a great value of clinical application.Subject headings: Cartilage; Histocompatibility; Tissue EngineeringFunding: the Natural Science Foundation of Hebei Province in 2013, No. 2013CFC082Cite this article: Guo B, Yuan K, Chen W. Artificial ossicular chain reconstruction: biocompatibility, properties and laryngecartilage defect repair. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(25): 3713-3719.3717ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction喉软骨从大的角度来说属于结缔组织范畴，外观透明，主要是由软骨组织以及周围的软骨膜构成，而软骨组织则主要是由软骨细胞、基质、胶原纤维等构成。喉软骨主要位于软骨基质内的软骨陷窝中，且存在一层软骨囊1。软骨组织相对特殊，该组织没有血管，由于基质富含水分，更加容易渗透，导致深层的软骨细胞能够获得营养物质。同时，喉软骨具有撑起气道作用2。当机体喉部发生创伤后，如肿瘤、先天性畸形等，容易造成喉腔发生缺损。因此，如何采取积极有效的措施对喉软骨进行修复和重建或者寻找适宜的替代品保持机体其生理和解剖功能成为当前面临的主要问题3-4。生物相容性是评价生物材料的一个重要标准5-6。研究显示，多孔羟基磷灰石是一种生物相容性较好的陶瓷材料，其结构类似于人体骨组织网状多孔结构；当羟基磷灰石植入机体后，能够在动态、复杂的生理环境下完成降解。多孔羟基磷灰石与骨组织结合时能产生一种动态平衡状态，使机体内钙磷比例相对平衡7。骨形态发生蛋白是公认的诱导骨作用的生长因子，具有较强的促成骨活性作用，能够在一定的条件下诱导间充质细胞不可逆的分化为骨、软骨组织8-9。但单纯骨形态发生蛋白在机体能保留的浓度相对较低，难以发挥其骨诱导作用，且单纯的骨形态发生蛋白也必须依赖于载体材料10。但是，单纯的骨形态发生蛋白在体内扩散相对较快，容易被分解、无支架和填充作用，使骨形态发生蛋白不能充分发挥其诱骨生成的作用。将生物相容性好、有骨传导能力、易于塑形的羟基磷灰石与具有强大诱骨活性的骨形态发生蛋白结合，能有效克服自己的缺点，使得复合材料具备骨传导和诱导的双重特性。骨形态发生蛋白-羟基磷灰石复合材料人工听骨能在人工听小骨与骨膜内侧面之间及羟基磷灰石材料微孔内生成自体骨组织，但是该结论尚未得到进一步研究。作者拟分析人工听骨链重建材料生物相容性及其特性，探索其在喉软骨缺损中的修复效果。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 实验于2014年12月至2015年12月华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院完成。1.3 材料 雄性新西兰雄性成年白兔40只，兔龄6-8周，体质量2.1-2.8kg，平均(2.30.5) kg，由武汉市中心医院动物实验中心提供，合格证号为SYXK(鄂)2001- 0004，饲养严格遵守相关标准。新鲜人骨由华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院提供，且实验均获得患者及家属知情同意。人工听骨链重建材料特性研究使用的主要试剂和仪器：试剂和仪器来源羟基磷灰石武汉市合中生化制造有限公司碱性磷酸酶染色试剂盒，DMEM 培养基美国Gibco公司倒置显微镜日本OLYMPAS公司光学显微照相系统日本Nikon公司CO2细胞培养箱美国GIBCO公司电子扫描显微镜日本OLYMPUS公司常规手术器械上海医疗器械厂专业动物实验台中科院上海细胞所ElectroForce3510材料试验机上海武昊生物有限公司新鲜人骨细胞由华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院提供。1.4 方法1.4.1 骨形态发生蛋白和多孔羟基磷灰石复合物的制备 从新鲜人骨中提取骨形态发生蛋白。羟基磷灰石经过高温煅烧后预制成多孔听骨，采用扫描电镜观察材料孔径为100-250 m，平均气孔率为50%。制备的听骨含有圆盘和柄2部分。柄直径为2 mm，长度为5 mm。将4 mol/L的骨形态发生蛋白溶于1 g/L的HCl以及浓度为0.05 mol/L的CaCl2复合液中，放置在温度为4 下过夜。将获得的多孔羟基磷灰石听骨放入骨形态发生蛋白溶液中，在负压为0.09 mPa下将多孔羟基磷灰石孔内空气除去，并采用蒸馏水进行48 h透析，放入冷干机中烘干，消毒后备用11。1.4.2 生物力学检测 将制备的骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料放置在ElectroForce3510材料试验机上对材料的生物力学进行测定。1.4.3 孔隙率 观察骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料60%、50%以及40%的孔隙率结果。根据公式 进行计算。为所测材料的孔隙率；0为所测孔隙率材料的表观密度；为所测孔隙率材料的密度。1.4.4 电镜观察 制备骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料切片，利用扫描电镜对材料进行观察。1.4.5 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料生物相容性(体外培养实验)6，12 将骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料制备成1 cm1 cm 0.5 mm的板，加入DMEM培养液，配成浸提液，并在37 孵育箱中进行72 h孵育，对细胞分泌钙基质功能进行测定。将重建材料放入24孔培养板中。将传到第3代的骨细胞采用浓度为0.02%EDTA消化制作成悬液到材料上，加入1 mL培养基，使得细胞浓度为1106 L-1，放入孵育箱中进行孵育，观察成骨细胞在重建材料中的增殖情况13。1.4.6 动物分组 将新西兰雄性成年白兔随机分为多孔羟基磷灰石组和人工听骨链重建材料组，每组20只。1.4.7 家兔喉软骨缺损动物模型建立及干预方法 2组家兔禁食12 h后，肌肉注射0.5 g阿托品，体积分数3.6%水合氯醛全身麻醉，将家兔左侧卧位固定在兔架台，常规消毒、铺巾。颈前正中纵形切口，分离皮下及肌层，充分暴露甲状软骨，在左侧做一个0.5 cm0.5 cm的全层软骨缺损，不能穿透喉黏膜，建立喉软骨缺损模型。家兔缺损部位建立后立即采用不同的材料进行修复，修复前对缺损部位进行常规消毒，确定缺损部位和大小，制备相应大小的材料。多孔羟基磷灰石组采用多孔羟基磷灰石材料进行修复，人工听骨链重建材料组采用骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料修复。2组家兔创面缝合后采用油纱、无菌纱布双层敷料覆盖创面、包扎，根据家兔情况给予抗生素预防感染，待家兔清醒后，送回笼中饲养14-15。观察2组动物大体变化。1.4.8 病理形态变化 2组家兔修复后3个月处死，取缺损部位组织，石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色，在倒置显微镜下观察病理形态变化。1.5 主要观察指标 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料的生物力学性能、孔隙率、超微结构、生物相容性。动物大体情况及病理形态学变化。1.6 统计学分析 采集数据采用SPSS18.0进行统计学处理，计量资料行t 检验，采用s表示，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料的生物力学性能 孔隙率为60%、50%以及40%的骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料的抗压强度差异有显著性意义(P 0.05；图1)。2.2 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料不同体积分数孔隙率 孔隙率为60%、50%以及40%的骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料的支架孔隙率差异有显著性意义(P 0.05；图2)。后续实验选择体积分数为50%的骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料。2.3 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料的超微形态 扫描电镜下，骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料外表面空洞未形成对称性球状，外观表现为多边形，空隙尺寸为100-200 m(图3)。2.4 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料生物相容性 随着培养时间的延长，骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料细胞数量增加，植入细胞与材料相互融合(图4)。2.5 实验动物数量分析 40只新西兰白兔全部进行结果分析数量，中途无脱落。2.6 大体观察 2组兔植入后3 d正常饮食，活动正常，均未见伤口破溃、红肿等不良反应。植入后1周，2组植入材料均被纤维结缔组织包裹，材料部分降解。人工听骨链重建材料组出现较多的结缔组织，可见明显的骨性结节，多孔羟基磷灰石组未见骨样组织形成(图5)。说明骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料对于喉软骨缺损修复效果更佳，能促进缺损部位组织增增长。2.7 病理变化 苏木精-伊红染色结果显示，人工听骨链重建材料组术后3周炎症反应完全消失，伴有大量多核样组织细胞增生以及吞噬，局部可见单核样细胞增生以及软骨细胞增生和软骨骨质；多孔羟基磷灰石组材料炎症反应明显，材料完全降解，未见软骨细胞以及成骨细胞生成(图6)。3 讨论 Discussion多孔羟基磷灰石及其衍生物由于该材料无机成分与天然骨十分类似，而成为陶瓷材料中人工骨支架首选的材料。多孔羟基磷灰石能与骨组织界面能形成一种钙、磷固体-液体平衡，从而能维持平衡中所需要的Ca2+和P5+来自周围骨组织和植入的材料16-17。该类型钙、磷媒介最终以生物性磷灰石形成的钙、磷体沉积在植入材料与骨交界面之间，这是种植成功后的先决条件18。骨形态发生蛋白是目前比较肯定的具有诱导成骨作用的生长因子，该材料具有较强的骨活性，能正确的诱导间充质细胞不可逆的分化为骨、软骨组织19-20。随着培养时间的延长，骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料细胞数量增加，植入细胞与材料相互融合理想的载体应该具备以下特性：材料生物相容性较好。选择的材料具有生物可降解性，能随着骨的形成降低了减少应力遮挡21-28。选择的载体能够与骨形态发生蛋白结合能减缓后者的释放和吸收，并且不会影响骨形态发生蛋白的活性。实验中，2组家兔植入后3 d正常饮食，活动正常，均未见伤口破溃、红肿等不良反应。植入后1周，2组植入材料均被纤维结缔组织包裹，材料部分降解。人工听骨链重建材料组出现较多的结缔组织，可见明显的骨性结节，多孔羟基磷灰石组未见骨样组织形成。正常骨形成与修复过程应该具备3个条件，即：诱导因子、靶细胞、适宜环境。骨形态发生蛋白生物活性在诱导成骨时可以分为3个时期：趋化期、有丝分裂期、分化期29。骨形态发生蛋白在诱导时能够诱导相应的细胞进一步增殖、分化，使得机体细胞与支架相互融合，并通过软骨内固化而形成新骨30-38。人工听骨链重建材料组植入后3周沿着反应完全消失，伴有大量多核654321080706050403020100ab抗压强度(MPa)a支架孔隙率(%)aba40 50 60 40 50 60 孔隙率(%)孔隙率(%)图2 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料不同体积分数孔隙率Figure 2 The porosity of bone morphogenetic protein- hydroxyapatite artificial ossicular chain reconstruction materials with different volume fractions图注：与孔隙率40%相比，aP 0.05；与孔隙率50%相比，bP 0.05。图1 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料生物力学Figure 1 Biomechanics of the bone morphogenetic protein-hydroxyapatite artificial ossicular chain reconstruction material图注：与孔隙率40%相比，aP 0.05；与孔隙率50%相比，bP 0.05。302520151050B A细胞增殖率(%)图3 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料的超微结构(1 500)Figure 3 Ultrastructure of the bone morphogenetic protein-hydroxyapatite artificial ossicular chain reconstruction material (1 500)图注：图中A为侧切位骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料；B为横切骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料。24 48 72 96培养时间(h)图4 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料生物相容性Figure 4 Biocompatibility of the bone morphogenetic protein- hydroxyapatite artificial ossicular chain reconstruction material ABB A图6 喉软骨缺损家兔植入不同生物材料后损伤部位的组织学变化(苏木精-伊红染色，40)Figure 6 The histological changes of the lesion in rabbit models of laryngeal cartilage defect after implantation of the bone morphogenetic protein-hydroxyapatite artificial ossicular chain reconstruction material and porous hydroxyapatite material (hematoxylin-eosin staining, 40)图注：图中A为人工听骨链重建材料组；B为多孔羟基磷灰石组。人工听骨链重建材料组能促进缺损部位细胞增殖，而多孔羟基磷灰石组细胞增殖较少。箭头指示增殖细胞。图5 骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料和多孔羟基磷灰石材料修复的喉软骨缺损模型新西兰白兔的大体观察(200)Figure 5 Gross observations of New Zealand white rabbit models of laryngeal cartilage defect after implantation of the bone morphogenetic protein-hydroxyapatite artificial ossicular chain reconstruction material and porous hydroxyapatite material (200)图注：图中A为骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料植入1周大体形态；B图为多孔羟基磷灰石组植入1周大体形态。箭头表示植入材料的位置。样组织细胞增生以及吞噬，局部可见单核样细胞增生以及软骨细胞增生和软骨骨质；多孔羟基磷灰石组材料炎症反应明显，材料完全降解，未见软骨细胞以及成骨细胞生成。通过该实验能巧妙的避免自体骨移植由于数量不足等受到的限制，降低了异体骨使用产生的免疫排斥反应，能为临床喉软骨缺损修复提供良好的方法和材料。综上所述，骨形态发生蛋白-羟基磷灰石人工听骨链重建材料制备方法相对简单，具有良好的生物相容性和特性，将其运用与喉软骨缺损中效果理想，能促进喉软骨缺损修复，具有较强的骨诱导能力，具有较高的临床应用价值。作者贡献：郭蓓进行实验设计，实验实施为袁琨，实验评估为郭蓓，资料收集为袁琨，袁琨成文，郭蓓审校。利益冲突：文章所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验方案经华中科技大学同济医学院武汉市中心医院伦理委员会批准，实验方案已经患者/家属知情同意。实验方案经华中科技大学同济医学动物实验伦理委员会批准，实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 马林祥,崔颖,朱丽明,等.BMSCs与PLGA三维生物支架复合修复喉软骨缺损的研究J.中国生物工程杂志, 2009,29(12):7-12. 2 Gilpin DA, Weidenbecher MS, Dennis JE. 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