（生物医学工程专业论文）乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析.pdf

英文摘要 t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f a c e t i ca c i d - w a t e rs o l u t i o ne x c i t e db yu v - l i g h ta 北s t u d i e d e x p e r i m e n t a l l ya n dt h e o r e t i c a l l y , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r aa n dt h e m o l e c u l a ra s s o c i a t i o no f a c e t i ca c i di sd i s c u s s e da sw e l l t h ef l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e so fa c e t i ca c i d - w a t e rs o l u t i o n se x c i t e db yv a r i o u s u v - l i g h t w i t ht h ew a v e l e n g t hf r o m2 4 0n l nt o3 0 0n ma r es t u d i e d i ts h o w st h a tt h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r ao fa c e t i ca c i d - w a t e rs o l u t i o n sa r co b s e r v e di nc a s et h ew a v e l e n g t ho fe x c i t i n gl i g h t i sl o n g e rt h a n2 4 6n l l lt h e r ea r et h r e ec h a r a c t e r i s t i cf l u o r e s c e n c ep e a k si nt h e s es p e c t r a t w oo f t h e ma r ea t3 0 5n l na n d3 3 4n l nr e s p e c t i v e l y , a n dt h et h i r do n eh a sas l i g h ts h i f tt o l o n g e rw a v e l e n g t hi n t h er a n g eo f 3 1 5 - 3 2 71 1 1 1 1a st h ew a v e l e n g t ho f e x c i t i n gl i g h ti n c r e a s e s t h eo p t i m a lw a v e l e n g t h sf o rt h e s et h r e ef l u o r e s c e n c ep e a k sa r eo b t a i n e dt h r o u g ht h e m e a s u r e m e n t so f t h e i re x c i t a t i o ns p e c t r ar e s p e c t i v e l y t h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r ao fa c e t i ca c i d - w a t e rs o l u t i o n sw i t hv a r i o u ss o l u t i o n c o n c e n t r a t i o n sa r eo b t a i n e d , a n dt h er e l a t i o n s h i pb c 懈 e c nf l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e sa n d c o n c e n t r a t i o u so fa c e t i ca c i d - w a t e rs o l u t i o n sa g es t u d i e d i ti ss u g g e s t e dt h a tt h ev a r i a t i o n i nf l u o r e s c e n c es p e c t r aw i t ht h ea l t e r a t i o no f s o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n si sp r i m a r i l ya t t r i b u t e d t oc h a n g e so fm o l e c u l a ra s s o c i a t i o n so fa c e t i ca c i di na q u e o n ss o l u t i o n s i nt h ec 撇o f d i f f e r e n ts o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n s v a r i o u sm o l e c u l a ra s s o e i a t i o i l so fa c e t i ca c i da r cf o r m e d b yh y d r o g e n - b o n dr e a c t i o n sb e t w e e na c e t i ca c i da n dw a l x ! rm o l e c u l e s ，w h i c hc o r r e s p o n dt o d i f f e r e n tm o l a ra b s o r p t i o nc o e f f i c i e n t sa n df l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d s t h e r e f o r e ， f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yc h a n g e sw i t ht h ea l t e r a t i o no fs o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n t h e e x p e r i m e n t a ld a t aa l s os h o w st h a tt h e 豇i 嘲g a pf o re l e c t r o n 仃a n s i t i o no fa c e t i ca c i d m o l e c u l e sd o e sn o tc h a n g ei nv a r i o n sm o l e c u l a ra s s o c i a t i o n s i nt h i sp a p e r ，t h em o l e c u l a ra s s o c i a t i o no f a c e t i ca c i di si n v e s t i g a t e du s i n gt h em e t h o d o f f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s t h er e s u l t so f f e re x p e r i m e n t a lf o u n d a t i o na n dr e f e r e n c et os t u d i e s o f m o l e c u l a ra s s o c i a t i o no f a c e t i ca c i da n dr e l a t e da r e , a k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n c es p e c t r u m , a c e t i ca c i d - w a t e rs o l u t i o n , m o l e c u l a ra s s o c i a t i o n , h y d r o g e nb o n d , m o l a ra b s o r p t i o nc o e f f i c i e n t 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：埘抄莎年钥妇 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：基堑i 鹭j z 年6 月旃 硕士论文 乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 1 分子光谱学在分子结构研究中的应用 利用分子光谱对物质进行定性和定量分析的方法称分子光谱分析，它又可分为吸 收光谱( 如红外、紫外一可见吸收光谱) ，发射光谱( 如荧光光谱) 和散射光谱( 如 拉曼光谱) 三种基本类型。一般情况下分子处于基态，当光与物质发生相互作用时分 子吸收光能，从低能级跃迁到高能级产生吸收光谱；反之，若分子从高能级回到低能 级则释放出光能，形成发射光谱；散射光谱是光被物质散射时，分子内能级的跃迁改 变散射光频率而产生的。物质对辐射能的吸收或发射是由物质本性所提供的最重要的 指纹图谱之一，所以可以获得物质的定性与定量数据【l 】 1 1 拉曼光谱分析法 上世纪6 0 年代年激光的问世并被引入到拉曼光谱领域，使得拉曼光谱效应太弱 的缺陷被攻克，从而打开了拉曼光谱应用研究的新局面。至目前，拉曼光谱已广泛应 用于有机、无机、高分子、生物、环保等各个领域，成为重要的分析方法和手段团。 随着科技的进步，近几年来又相继发展了表面增强拉曼【3 羽、傅里叶变换拉曼u - g l 、共 聚焦显微拉曼【n 瑚、共振拉曼 1 4 - 1 8 、时间分辨拉到1 9 2 0 l 等新技术，拉曼光谱在分子结 构( 尤其是高分子结构) 研究中的作用日趋重要。特别是，由于水的散射光谱极弱， 对其它物质的拉曼散射影响甚微，使得拉曼光谱在水溶液方面的应用更是具有得天独 厚的优势。由于生物大分子多是处在水溶液环境中，因此研究它们在水溶液中的结构 对于了解生物大分子的结构与性能的关系非常重要。由于拉曼效应对于分子构象的变 化敏感，且测量时样品用量很少，可低至数微克，加之拉曼光谱仪本身的不断改进， 使拉曼光谱已成为一种能够快速、详尽提供有关水溶液中生物大分子结构信息的新技 术。 1 2 红外光谱分析法 红外光谱与分子的结构密切相关，是研究表征分子结构的一种有效手段。红外光 谱可以研究分子的结构和化学键，如力常数的测定和分子对称性等，利用红外光谱方 法可测定分子的键长和键角，并由此推测分子的立体构型。根据所得的力常数可推知 化学键的强弱，由简正频率计算热力学函数等。分子中的某些基团或化学键在不同化 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 合物中所对应的谱带波数基本上是固定的或只在小波段范围内变化，因此许多有机官 能团例如甲基、亚甲基、羰基，氰基，羟基，胺基等等在红外光谱中都有特征吸收， 通过红外光谱测定，人们就可以判定未知样品中存在哪些有机官能团，这为最终确定 未知物的化学结构奠定了基础。由于分子内和分子间相互作用，有机官能团的特征频 率会由于官能团所处的化学环境不同而发生微细变化，这为研究表征分子内、分子间 相互作用创造了条件。分子在低波数区的许多简正振动往往涉及分子中全部原子，不 同分子的振动方式彼此不同，因而使得红外光谱具有像指纹一样高度的特征性。由于 上述特点，红外光谱在分子研究领域得到了广泛应用【2 l - 2 4 1 。 1 3 紫外一可见吸收光谱分析法 紫外一可见吸收光谱是指物质在紫外或可见光区吸收一定波长的光，所获得的吸 收光谱。它属于电子光谱，是指分子的外层电子或价电子( 成键电子、非键电子和反 键电子) 的跃迁得到的光谱。紫外光区是波长约在1 0 4 0 01 1 1 1 1 的光波区，它分为近 紫外区( 2 0 0 4 0 0r i m ) 及远紫外区( 又称真空紫外区1 0 2 0 0r i m ) 两个区段，可见 光区是波长4 0 0 8 0 0n m 的光波区。 紫外一可见吸收光谱主要用于鉴定共轭生色团并配合其它手段来推知未知物的 结构。根据一个未知物的极限吸收波长和吸收峰数值可以推算它可能的结构类型，一 般可以利用伍德瓦尔德一费塞尔经验规则计算吸收峰峰位五。的值。对于芳香族化合 物、多环芳径化合物、杂环化合物等的紫外光谱分析比较可靠。利用紫外光谱法可以 检查和控制药物中的杂质，也可以用于高纯度化学试剂中杂质含量的监控。另外，紫 外一可见吸收光谱法在生物大分子测序研究、生物活性小分子分析、生物药物分析等 方面都发挥了突出的作用瞄硐。 1 3 1 紫外一可见吸收光谱的特点 紫外一可见吸收光谱具有以下的特点： ( 1 ) 灵敏度较高。一般可以测定的浓度下限约为1 0 t o o l l 1 ，适用于微、痕量 分析 ( 2 ) 精密度和准确度高。与其它仪器分析法相比，紫外一可见光谱法的相对误差 较小，一般为2 一5 ，因而能满足微量分析对准确度的要求。 ( 3 ) 应用范围广不但能直接或间接定量测定几乎所有的无机物质和许多有机物 质，还可作官能团鉴定、结构分析、相对分子质量测定、配合物组成及稳定常数、酸 碱离解常数的测定等。 ( 4 ) 仪器操作简单、快速、价格较低，测定方法易于推广。 2 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 目前，在经典的检测方法基础上，不断派生和出现了许多新的方法与技术，比如 双波长光度法、导数光谱法，相干光谱法等等，极大地提高了紫外一可见吸收光谱的 选择性、灵敏度和自动化程度，拓宽了应用领域。 1 3 2 紫外一可见吸收光谱的测量原理 紫外一可见吸收光谱的定量依据是l a m b e r t - - b e e r 定律。当一束平行单色光通过 单一均匀、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成 正比。如果溶液的浓度一定，则吸光度与液层的厚度成正比：如果液层厚度一定，则 吸光度与溶液的浓度成正比。这个关系称为l a m b e r t - - b e e r 定律，其表达式为 彳= g ( ；) = - g ( 争) = 占c z 式1 1 中：a 是吸光度和光密度，无量纲；而是入射光强度；，是透射光强度；丁是透 光度；c 是浓度，以t o o l l - i 为单位；，是光在溶液中经过的距离，单位为锄，8 是溶 液的摩尔吸光系数，即i m o l l 1 溶液的吸光度，单位为l m o l 4 c m l 。 其中8 与吸光物质本身的性质有关，是吸光物质在特定波长、温度和溶剂条件下 的吸光度，反映了该物质的吸收光能力 l a m b e r t - - b e e r 定律不仅适用于溶液，也适用于均匀非散射气体和固体，适用于 可见、紫外和红外光区。 1 3 3 紫外一可见吸收光谱的电子跃迁类型 紫外一可见吸收光谱是分子中价电子的跃迁产生的。因此，这种吸收光谱决定于 分子中电子分布和结合情况。生物分子有三种不同性质的价电子：单键盯电子，双键 ，r 电子和氧、氮、硫和卤素等杂原子上的未成键的孤对电子( 称为一电子) 。盯键电子、 幻 司 jl i f 图1 1 分子的电子能级跃迁 孙 掌 磊如啦 图1 2 常见电子能级与其对应的波长范围及强度 万键电子、丹电子能级高低顺序及生物分子吸收光子后发射价电子跃迁如图1 i 所示。 在紫外一可见光区域内，电子跃迁类型主要有四种：盯_ 仃+ ，厅呻叮，r 啼矿，厅哼矿， 3 硕士论文 乙酸分子缔舍结构的荧光光谱分析 发能级数目不多，与原子具有众多激发能级的情况不同，故荧光寿命是分子的一种特 征参数。它和荧光光谱一样，可用于研究分子的结构和反应。通过测量荧光寿命，可 以得到有关分子结构和动力学方面的信息。由于分子中的每个原子都受到预期相互作 用的其它原子的各种强力和弱力的作用，这种作用在较短时间内可以认为是一种弹性 力，因此经过一段时间之后整个分子的结构将有所变化。用时间分辨的荧光测量技术 研究分子动力学，需要用短暂的脉冲光源激发，结合单光子计数技术，根据荧光寿命 和时间及温度的关系，就可以获得分子的构象动力学信息。 1 4 1 荧光分析的特点 1 4 1 1 灵敏度高 荧光分析的最大特点是灵敏度高。与常用的分光光度法比较，荧光是从入射光的 直角方向检测，即在相对的暗背景下检测荧光的发射，而分光光度法是在人射光的直 线方向检测，即在亮背景下检测暗线。因此一般荧光分析的灵敏度要比分光光度法大 2 3 个数量级。例如，对容易致癌的3 、4 一苯并芘的测定，采用分光光度法，可检 测到1 0 石数量级；而采用荧光法可以达到l o 母数量级。 1 4 1 2 选择性强 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。所以荧光法既能依据特征发射，又可按照特 征吸收，即用激发光谱来鉴定物质。假如某几种物质的发射光谱相似，可从激发光谱 差异区分它们。若其吸收谱相同，则可用发射谱将其区别。因此，与只能得到待测物 质的特征吸收光谱的分光光度法相比，在鉴定物质时，荧光法选择性更强 1 4 1 3 样品用量少及方法简便 由于灵敏度高，所以可大大减少样品用量。特别在使用微量池时，只需l om 样 品。用荧光法测定蛋白质中色氨酸的含量时，只用4 0 鹏的样品即可另外荧光分析 方法简便，快速。 1 4 1 4 能提供较多的物理参数 可提供包括激发光谱、发射光谱及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振 等许多物理参数。这些参数反映了分子的各种特性，且通过它们可以得到被研究分子 的更多信息，这也是分光光度法不能相比的地方。当然用荧光分析法得到的常常是分 子的局部信息，而不象x 光衍射法那样能同时得到一个分子结构的全部信息。 1 4 2 荧光光谱的主要参量 荧光分析能给出的信息与测量方式有关，可根据实验目的来选择。常用的基本参 数有： 5 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 1 4 2 1 荧光强度与荧光量子产额 荧光强度是荧光分析的最基本参量，指在一定仪器条件下，所测得的荧光强弱。 它和光源强弱( 功率) 、激发与发射波长及单色器的缝宽、样品及其浓度、探测器的 灵敏度等有关。因此实际测得的荧光强度只是一个相对量，作图时，可用任意单位表 示。一般都用测得强度和标准样品在相同测量条件下，测得的强度之比来表示。 荧光量子产额( f l u o r e s e e n c eq u a n t u my i e l d ) 也称荧光效率或量子效率，它表示 物质发射荧光的本领，指发射光子数与吸收光子数的比值，是荧光测定的基本参数之 一。在大分子构象的研究中尤为重要。若用p 代表荧光量子产额，则有 口2垄塾茎鲞塑坌王墼：茎塾塑三墼 激发态的分子数吸收光子数 ( 1 2 ) 式中：舻值与物质本身性质和溶剂有关，对于发强荧光的分子( 如荧光素) ，其量子 产率在某些情况下将接近于l ，而无明显荧光的化学物质其妒值则接近于零；同一物 质的p 还和激发波长有关，如奎宁o 1 m o l l 在硫酸溶液中置于2 5 0 c 下，以波长为 3 1 3n m 光激发时妒值为1 ，而以3 4 5n l n 光激发时伊值为o 9 8 。此外，9 值还与温度 有关，一般温度高时，p 值下降，这种现象称为温度淬灭( t e m p e r a t u r eq u e n c h i n g ) 。 根据l a m b e r t - - b e e r 定律，吸收前后的光强( 光子数) 为而与l 则 i = 1 0 1 0 一e l( 1 3 ) 式中；b 为摩尔吸光系数；c 为样品浓度；，为光程；e c l 称为光密度。 被吸收光子数厶为 l = 厶一0 1 0 一日叫)( 1 4 ) 所以，荧光强度f ( 用光子数表示) 应为 f = 毋l ( 1 1 0 一日)( 1 5 ) 荧光量子产额与荧光强度是两个不同的概念，9 指发光效率，是一个百分数，而 f 则是发光物质所发射的光子数。 当浓度小时，1 0 一别* l 一2 3 日酣，由式( 1 5 ) 可得 f = 2 3 矾日一( 1 6 ) 式( 1 6 ) 表示f 与c 成正比但在浓度逐渐增大时，f 增长减慢，最后达到饱和值。 实际上，由于存在浓度淬灭现象，当浓度达到某一值再继续增大时，荧光强度反而降 低。因此用荧光强度测某物质浓度时，必须利用，与c 成正比的浓度范围 1 4 2 2 峰位和谱带宽度 峰位指激发峰或发射峰的波长，常用符号k 表示。谱带宽度通常用。半宽”表 6 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 示。即峰的强度值一半时，其横坐标上的波长宽度。表示谱带宽度的方法还有多种， 如用光谱的有效面积除以峰值高度等。 1 4 2 3 荧光寿命 荧光寿命( 1 i f et i m e ) 又叫荧光的期间，即处于激发态的时间。它也是荧光特性中 的一个重要参量。它不仅在荧光动力学的计算中很重要，而且还能提供其它许多信息， 如二聚物与激发络合物的形成，能量转移和分子内基团与基团距离的测定以及分子的 旋转扩散等。 荧光寿命的定义有很多种，最简单的定义是：当发光过程是符合指数衰减规律时， 去掉激发光后，分子荧光强度降到激发时最大荧光强度的1 e 所需要的时间，用f 表 示。分子从吸收光能到发射荧光之间有一定的时间间隔。同种分子这一时间不完全相 同，即一定时间内，将有一定百分数的激发分子发射光子。这与放射性核素的衰变规 律相同。设初始荧光强度为而，则经过t 时间后的荧光强度，为 j = f o e - “t ( 1 7 ) 即经过f 时间后，荧光强度降低为原来的l e 。f 值可用专门仪器测定，不同物质的f 值不同，如人血清白蛋白( 水溶液) 为4 5n s ，色氨酸( 水溶液) 为2 6 璐等。 1 4 2 4 荧光偏振与荧光各向异性 荧光的偏振也是荧光的一种参量，用荧光的偏振可以反应分子的结构状况，以及 分子的运动状况。 光是一种电磁波，而电磁场的振动方向互相垂直。若只考虑电场，则自然光中含 有各方向的电场，分布均匀。经过一块偏振片后，只有某一平面内的电场可以通过， 故称为平面偏振光( 或线偏振光，迎着光线前进方向观察，电场变化方向在一直线内) 。 若某一平面内光的强度占优势，其它方向较弱，则称为部分偏振光。用平面偏振光激 发分子后，若分子在发射前方向不变，则所发射荧光是偏振的；若分子有转动，则测 出的荧光是部分偏振光。因此荧光偏振也称为荧光去偏振( f l u o r e s c e n c e d e p o l a r i z a t i o n ) 。 荧光偏振程度的大小用荧光偏振度p ( p o l a r i z a t i o n ) 表示，其定义为 r r p = 等 ( 1 8 ) 十上 式中：肭起偏器与检偏器平行时测出的荧光强度，这时入射光和荧光的振动方向都 与这两束光线所在的水平面垂直；l 则为检偏器转动9 0 0 后即与起偏器垂直时测得的 荧光强度。 p 值和分子排列的有序性及分子在介质中旋转运动有关，因而可通过测定p 值来 了解这一性质。 7 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 荧光偏振的另一表述是各向异性，用，表示，则有 ，：善直 ( 1 9 ) i ih + 2 i l 。 通常是在稳定条件下测量偏振度及各向异性，即入设光是恒定的，这时观察到的 p 与y 是体系的平均运动。若光源用n s 脉冲偏振光，则可测量随时间变化的易与l ， 这样就可探测不同时间的运动，称为时间分辨技术 1 4 3 荧光与结构的关系 1 4 3 1 电子跃迁类型 研究表明，荧光很难由波长低于2 5 0 衄的紫外辐射的吸收引起，因为此种辐射 的能量足以使激发态分子发生预离或离解波长为2 0 0 皿的辐射相当于大约 1 4 0 k c a l t o o l ，这一能量可使大多数分子中的某些键断裂。因此，由盯一盯跃迁所 产生的荧光很少看到。实验证明，万一石跃迁发射荧光要比疗哼厅跃迁发射荧光更 常见。这是由于石一t 跃迁属于电子自旋允许的跃迁，具有较大的摩尔吸光系数8 ， 它一般比属于禁阻跃迁的万一万跃迁的8 大1 0 0 1 0 0 0 倍；其次，万一7 跃迁的寿 命约1 0 - 7 1 矿，比厅一开跃迁的寿命1 0 巧1 0 4 要短，因此在与各种失活过程竞争 中石+ 专万跃迁更有利；此外，在石_ - 跃迁过程中，因岛与兀能级差较大，通过 系间窜跃至三重态的速率常数也较小，这有利于荧光的发射。 。 1 4 3 2 共轭效应 含有低能的石+ _ z 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。大多数未取 代芳香烃类在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度的增加，荧光峰红移、荧光量 子产率增大。含大的共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能发光，但数目比 芳香化合物要少的多。 绝大多数荧光团含有芳香环或杂环。细胞色素的血红素辅基、卟啉、类胡萝h 素、 黑色素等等都是共轭体系。 1 4 3 3 取代基作用 如苯环上有取代时可使最大吸收波长发生位移并使荧光峰也发生相应的改变，此 外，也影响荧光效率。芳环上有羧基、羰基或亚硝基等吸电子取代基时常常会妨碍荧 光的发生。而给电子取代基一o h 、一n h 2 、- - o c h 3 会使荧光强度增加。 1 4 3 4 平面刚性结构效应 有刚性结构的分子容易发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。这是因为 刚性和平面性增加，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，即使外转移能 量损失减少，从而有利于荧光的发射。此外，当荧光物质被吸附在固体表面上时，常 常也使荧光增强。 8 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 1 4 4 影响荧光光谱峰值位置厶。的因素 2 7 1 荧光分析的主要特点是灵敏度高，但因此也容易受到各种因素的干扰，如样品 的浓度、温度、p h 值以及样品中杂质等。为了得到可靠的结果，实验设计和操作中 需要考虑设法减少这些因素的影响。 1 4 4 1 环境极性 环境( 如溶剂) 的极性是一个对磊。有重要影响的因素。同一种荧光团在不同 极性的环境中，其五。可能会有所差别。一般来说，激发态的极性比基态要强，因此 被激发的荧光团将趋向于与极性溶剂相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化， 偶极子重新取向，而这又会反过来影响荧光团的基态和激发态能级，减少激发态的能 量，引起发射谱的红移。 1 4 4 2 溶液的p h 值 如果荧光团为弱酸或弱碱，则溶液p h 值的改变常对厶。有影响。这是因为弱酸 和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光厶。也会发生变化。而溶液粘 度增加也可能使五。产生蓝移 1 4 4 3 能量转移 分子之间的能量转移有以下几种形式 ( 1 ) 当一个激发分子与另一基态分子 发生碰撞时，前者可将能量转移给后者，叫 碰撞能量转移，通常将会引起荧光的淬灭。 ( 2 ) 激发分子将其激发能以辐射形式释 放，本身回到基态，另一分子则吸收此辐射 光子处于激发态，该过程叫重吸收。假如另 一分子与激发分子是同一种，则此过程叫自 吸收。由于这一过程是一个分子释放光子， 另一个分子再吸收，所以此过程又叫辐射能 量转移。此时可能引起荧光淬灭，也可能有 新的荧光产生。如图1 3 所示，供体( 荧光 团) s 受激发射的光子被受体( 荧光团) a 重吸收，a 又发射荧光光子。 i 皇三兰l 图1 3 荧光团能量转移跃迁示意图 实箭头线表示吸收；虚箭头线表示辐射 ( 3 ) 当两个分子具有相同的激发能量变化( 或受体比供体激发能级稍低一些) ， 且达到一定的距离时，通过两个分子在空间产生的电磁相互作用，供体分子s 可将其 激发能转移给受体分子a ，这就是非辐射共振能量转移。这种能量转移方式相当于两 个偶联的电偶极子的振动，当两个电偶极子的振动频率相同时，相互问就发生共振作 9 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 用，从而转移了能量，所以又叫共振能量转移。共振能量转移的分子跃迁也可用图 1 3 表示，供体与受体间激发能级有一小的电子能量差厶这种能量转移的特点是过 程中不包含光子的发射与再吸收，所以有别于重吸收，此时两分子很靠近但又不碰撞， 所以有别于碰撞转移。 共振能量转移需要有三个条件：一是能量供体与能量受体分子间的距离要在5 1 0n l n 之间；二是供体的荧光光谱必须与受体的吸收光谱要有重叠，重叠愈大转移效 率愈高，通常不同分子间的光谱重叠比相同分子间的重叠( 假若有重叠的话) 要更大 一些；三是供体必须是发荧光的分子( 荧光团) ，并且在没有受体存在时，供体的荧 光量子效率愈高，则能量转移效率也愈大。 共振能量转移可以在分子内进行也可以在分子间进行。5n 1 1 1 是一般生物大分子 的直径大小，也是生物膜厚度的大小，所以在生物大分子和膜上可进行能量转移。共 振能量转移可以在不同分子间进行，也可以在相同分子间进行。浓度淬灭与浓度去偏 振现象都可以作为在相同分子闻进行能量转移的证明。杂质淬灭，特别是敏化荧光可 以作为不同分子问进行能量转移的证明。 如果两种荧光团的荧光频率接近，则当两种基团足够接近时，用一种荧光团吸收 光能激发使之处于激发态后，处于激发态的这种荧光团可能将激发能转移到另一种荧 光团，使第二种荧光团进入激发态，产生第二种荧光团特有的荧光。 显然，由无论是碰撞能量转移、重吸收能量转移还是共振能量转移引起的荧光淬 灭或产生新的荧光，都可能对厶。造成影响。 1 4 5 影响荧光强度的因素 由式( 1 6 ) 可知，凡是会影响荧光量子产额妒的环境因素也必然会影响荧光强度 f 。 1 4 5 1 温度的影响 溶液温度对荧光的影响是很大的。温度降低会增加凡因为降低了碰撞与非辐射 失活的概率。如荧光素的乙醇溶液在0 0 c 以下每降低1 0 。c ，荧光量子产率增加3 ， 当温度降至一8 0 0 c 时，荧光量子产率为1 0 0 。 1 4 5 2 环境极性的影响 或f 会随着环境极性的减小而增加。一种可能的机制是：在非极性的溶剂中， 系间交连的速率会减少。 1 4 5 3 光照的影响 荧光团吸收光能，可能造成某一个键的断裂，这一现象称为光化分解 ( p h o u ) d i s s o c i a t i o n ) ，光化分解会造成荧光逐渐减弱。尤其是对于稀溶液来说，光化分 解现象较为严重。 l o 硕士论文 乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 1 4 5 4 样品浓度的影响 由式( 1 6 ) 可知，在样品浓度较低时，f 与荧光团的浓度成正比但到了一定浓度 以后，就不再存在这种正比关系，如式( 1 5 ) 所示。 当荧光团的浓度过大时，分子间的能量转移更易发生，当然也易发生淬灭现象。 这样就使出射荧光强度反而低于浓度较小时的荧光强度。 另外，浓度过高还可能形成样品分子的二聚物或多聚物，因而降低荧光强度。 还有当溶液较浓时，均匀分布在样品池中的荧光团吸收强烈，越进入溶液内部， 荧光团被激发的机会越少，因为大量的激发光在到达池内之前就被吸收。这样，从垂 直于激发光入射方向检测到的荧光就很微弱。 1 4 5 5 溶液粘度的影响 荧光强度一般随介质粘度的升高而增强。因为介质粘度增加，减少了分子碰撞， 从而减少了能量损失 1 4 5 6 溶解氧的影响 溶解氧的存在往往可使溶液的荧光强度降低，这可能是由于荧光物质的光化学诱 导氧化所致。然而，更常见的是发生淬灭现象，这是由于氧分子的顺磁性，这种顺磁 性能促进激发分子发生系间窜跃而变成三重态。其它顺磁性物质也会导致荧光淬灭现 象的发生。 1 4 5 7 膜电位的影响 有些能和膜结合的荧光团的荧光强度会随着膜电位的改变而改变，这种变化有的 是由于带电的荧光团随膜电位变化而在膜内外重新分布，有的是由于荧光团的荧光光 谱在电场下发生改变。据此现象可以用来监测膜电位的变化。 1 4 6 荧光淬灭 荧光淬灭指的是荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强 度下降的物理或化学作用过程。荧光淬灭作用在荧光分析中有降低待测物质的荧光强 度的不良作用，但也可以利用某种物质对某一荧光物质的荧光淬灭作用而建立对该淬 灭剂的荧光测定方法。荧光淬灭过程可以分为两种：动态淬灭和静态淬灭。 1 4 6 1 碰撞淬灭 双分子的作用过程的基本条件是两个分子的紧密接近，即“碰撞”。对于基态分 子的动力学碰撞，要求两分子相互接触，而对于处在激发态的分子而言，不一定需要 两个作用分子的直接接触，它们之间便可能发生光学碰撞作用。光学碰撞的有效截面 要比动力学碰撞的有效截面大得多。无论是动力学碰撞还是光学碰撞都会影响双分子 反应的速率常数。 动态淬灭过程是与自发的发射过程相竞争从而缩短激发态分子寿命的过程。动态 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 淬灭s t e m - - v o l m e r 方程是描述动态淬灭程度的一个比较常用的关系。溶液中荧光物 质分子膨和淬灭剂分子q 相互碰撞而引起荧光淬灭的最简单情况表述如下： ( 1 ) m + 砂专i m ( 吸光过程)l 速率 ( 2 ) 1 m ! 乙哼m + 砂( 荧光过程) f m + 】 ( 3 ) 1 吖+ q l m + q( 淬灭过程) 膨k 】 根据恒定态的假设，当激发态分子1 m 生成的速率等于它的去活化的速率时， 1 肘的浓度保持不变，即 尘蝴：o ( 1 1 0 ) - 二= i 在没有双分子淬灭过程的情况下，1 m 的速度表示为c m 寸 1 膨 o2 赤2 忐。 k ，+ k k + k k f + k i 假如存在双分子淬灭过程的情况下，1 m 的浓度表示为【1 m + 】 1 膨 2 石南 秽= 华= 忐 办= 华= 南 ( 1 1 2 ) ( 1 t 3 ) ( 1 1 4 ) 未加入淬灭剂时的荧光强度( 昂) 与加入给定浓度的淬灭剂时的荧光强度( f ) 之比为 争= 雾= 锴小穗均 = l + 心f o 【q 】= 1 + 繇【q 】 式( 1 1 5 ) 中：为没有淬灭剂存在时荧光分子的平均寿命：j 0 为s t e m v o l m e r 淬灭常数；j 0 是双分子淬灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率，因此它意味着 这两种衰变途径之间的竞争 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 式n 1 5 ) 即为s t e r n - - v o l m e r 方程式。该式说明了加入淬灭剂后荧光强度的改变和 淬灭剂浓度间的关系。 1 4 6 2 能量转移淬灭 电子能量转移可分为辐射能量转移和非辐射能量转移两种类型。非辐射能量转移 又有两种不同的假设，可分为共振能量转移和交换能量转移。 1 辐射能量转移 。 辐射能量转移过程事实上是荧光的再吸收过程，即荧光分子( 能量供体) 所发射 的荧光为淬灭剂( 能量受体) 所吸收，从而导致后者被激发。该过程可以描述如下： d d + h r( 1 1 6 ) 4 + 砂_ 4 ( 1 1 7 ) 2 共振能量转移 当供体分子和受体分子相隔的距离远大于供体一受体的碰撞直径时，只要供体分 子的基态和第一激发态两者的振动能级间的能量差相当于受体分子的基态和第一激 发态两者的振动能级间的能量差，此时仍可发生从供体到受体的非辐射能量转移，通 常也称为长距离能量转移。 3 交换能量转移 交换能量转移是发生在比共振能量转移更短的距离内的能量转移现象。当供体分 子和受体分子两者的电子云相互接触时，即相距不大于它们的动力学碰撞的直径时， 供体分子和受体分子能量最高的电子可能相互改变位置，激发态供体分子的光电子可 能改变位置成为原先处于基态的受体分子的电子结构部分，而供体分子又从基态受体 分子那里交换取得一个电子从而返回基态。交换能量转移作用的大小与供体及受体的 跃迁几率无关。对于单重态一三重态这样的禁阻跃迁来说，在短距离内，交换能量转 移过程占支配地位。 1 4 6 3 转入三重态的淬灭 分子从激发单重态到三重态的体系间窜跃过程是可能发生的，此时多余的振动能 将在碰撞中损失掉。转入三重态的分子在低温下可由三重态发生辐射跃迁而重新返回 到基态，并伴随着发射波长较长的磷光。由三重态返回到基态的跃迁也是自旋禁阻的， 因而这一过程进行的速率较慢，发光分子的平均寿命较长，这便使得激发态分子在发 光之前有可能发生许多振动作用，从而使所得到的光谱具有复杂的精细结构。羰基化 合物，其最低激发单重态是的( ”，石1 。在激发态( 矗，石) 下，有利于提高函乃系间窜 跃过程的量子产率，使得荧光量子产率减小。由于? i t 斗石的跃迁是部分禁阻的，因 而石专押的跃迁也是部分禁阻的，处于( 聆，石) 态的最低激发单重态的寿命要比处于 ( , 7 ) 态的长，从而转化为三重态的几率比较大此外( ? , r ) 态的岛和乃之间的能 1 3 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 量间隙通常比较小，这更有利于加速& 乃系间窜跃过程的速率。 杂原予具有孤对的非键( n ) 电子，因而杂环化合物在受激发时通常产生万一万 跃迁，所得到的最低激发单重态是( 聆，石+ ) 态硝基化合物、重氮化合物和羰基化合物 等，其激发单重态都容易转变为三重态，因而容易产生荧光淬灭现象 1 4 7 荧光分析法在化学分析中的应用 荧光分析法因其灵敏度高、易于操作而尤其受到分析化学工作者的青睐。在荧光 分析中，可以采用不同的实验方法以进行分析物质浓度的测量。只要分析物质本身发 荧光，就可利用简单的直接测定法。间接的荧光测定方法常用的有两种：第一种是通 过化学反应将非荧光物质转变为适合于测定的荧光物质；第二种方法是荧光淬灭法 利用荧光分析法可以进行无机化合物、有机化合物的分析。在生理科学研究工作及医 疗工作中，所遇到的分析对象常常是分子庞大而结构复杂的有机化合物，如维生素、 氨基酸和蛋白质、胺类、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等，利用荧光分析法的 高灵敏度可以测定它们在试样中的低微含量荧光分析法，特别是新近发展起来的同 步荧光法、导数荧光法、时间分辨荧光法、相分辨荧光法、偏振荧光法、低温荧光法 等新技术，都具有灵敏度、选择性好、取样量少、方法快速简便等优点，因而已成为 各种领域中进行痕量和超痕量物质分析的一种重要工具。脂肪族有机化合物，包括醇 类、醛、酮、有机酸、脂肪酸、脂以及糖类等分析，都广泛地采用了荧光分析口例。 1 4 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 2 乙酸分子结构的研究现状 2 1 乙酸的物理和化学性质p o 】 乙酸是一种无色有强烈刺激性气味的液体，熔点是1 6 6 叼，沸点是1 1 7 9 0 c ，密 度1 0 4 9 2 9 c m 3 当室温低于1 6 6 。c 时，无水乙酸就凝结成冰一样的晶体，故通称冰 醋酸。它是食醋的主要成分，普通食醋中含有3 5 乙酸，所以乙酸又被俗称为醋 酸。乙酸可以与水互溶并易溶于有机溶剂。 乙酸的分子表达式为c h 3 c o o h ，是具有( 2 - - 0 基团的分子。由于这种c = o 基团 的存在，乙酸分子之间以及乙酸与其它含有施h 或者受h 位点的分子之间存在着一 种特殊的氢键( h y d r o g e nb o n d ) 反应，分子可以通过这种特殊的氢键作用聚合在一起。 一个乙酸分子具有4 个施h 位点：o - h 基团中的h 原子，以及甲基基团中的3 个c _ h 键h 原子；同时拥有2 个受h 位点：0 _ h 基团中的o 原子和c = o 基 团中的o 原子其分子空间结构及各原 子的排列方式如图2 1 所示。乙酸分子的 这一分子特征，使得在不同的条件下， 乙酸分子自身或与其它物质分子之间的 缔合存在着很多种可能性。乙酸的分子 缔合也一直是多年来的研究热点之一。 2 2 分子缔合中的氢键 图2 1 乙酸分子的空间结构 1 - o 原子。2 - h 原子，3 4 2 原子 在乙酸的分予缔合过程中起着重要作用的是氢键。氢键作用广泛存在于分子间。 水、乙醇、乙酸等的分子缔合现象以及蛋白质和核酸分子的立体结构等，都与氢键有 关。 ( 1 ) 氢键的形成 当电负性很强的元素x 与氢原子形成共价键时，共用电子被强烈的吸向元素x ， 而使h 原子显正电性。而且h 只有一个电子，这样h 原子的核几乎裸露出来，近乎 于质子状态。此时h 原子的半径很小，因而无内层电子、带部分正电荷的氢原子和 硕士论文乙酸分子缔合结构的荧光光谱分析 附近另一个电负性很大、含有孤对电子并带有部分负电荷的y 原子有可能充分靠近， 从而产生静电吸引作用。即产生氢键x h y 。 ( 2 ) 氢键形成的条件 乱要有一个与电负性很大的元素x 形成强极性键的氢原子。 b 要有一个电负性很大，含有孤对电子并带有部分负电荷的原子y 。 c x 和y 的原子半径要小。这样空间位阻较小。一般来说能形成氢键的元素为n 、 o 、f 。 ( 3 ) 氢键的特点 乱键能：氢键的键能只有几十k j m o l ，大于分子间力，远小于化学键能。即氢 键是一种很弱的键。 b 具有方向性和饱和性：本质上与共价键的方向性和饱和性不同。 方向性：x h y 三个原子在同一方向上。是由于这样的方向使得成键两原子 电子云之间的排斥力最小，形成的氢键最强，体系也更稳定。 饱和性；每一个x h 只能与一个y 原子形成氢键，这是由于h 的原子半径很 小，若再有一个原子接近时，会受到x 、y 原子电子云的强烈排斥。 c 分子内也存在氢键。除了上面讲的分子间可以形成氢键外，像h n 0 3 分子，苯 酚的邻位上有n 0 2 、- - c o o h