（生药学专业论文）蓝细菌pcc6803染色体上毒素抗毒素基因的研究.pdf

独创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进行研究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容以外 本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均己在文中以明确方式 标明 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 事 象亨 e t 期 2 4 年多月罗日 蓝细菌p c c 6 8 0 3 染色体上毒素一抗毒素基因的研究 t h er e s e a r c ho nt h et o x i n a n t i t o x i ng e n eo f s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3c h r o m o s o m e 2 0 0 8 年5 月 江苏大学硕士学位论文 摘要 毒素一抗毒素系统基因广泛存在于细菌染色体上 它们可被环境胁迫诱导的 上调表达蛋白酶所激活 作为原核细胞的胁迫反应因子 参与或介导中度胁迫条 件下细胞的生长抑制或死亡 但只有大肠杆菌染色体上的部分毒素一抗毒素系统 基因通过试验证明 并且它们的生理功能所知甚少 对大肠杆菌染色体上的 m a z e f 系统研究证明可介导环境胁迫诱导的细胞程序性死亡 但由于毒素一抗毒 素系统基因在不同种属细菌的同源性较低或相差很大 该系统确切的生理功能因 缺乏充分的试验结果的支持而颇受争议 因此对不同种属细菌染色体上毒素一抗 毒素系统基因的功能的研究 对完善细菌细胞程序性死亡理论 揭示细菌适应环 境胁迫的分子机制具有重要的理论价值 同时 由于毒素 抗毒素系统中的毒素 蛋白对细菌细胞的毒性作用 有学者提出以抗毒性蛋白女 1 m a z e 为靶标筛选出破 坏毒素蛋白和抗毒素蛋白之间相互作用的化合物 使毒性蛋白游离出来从而选择 性地杀死目标细菌 为解决临床上抗生素耐药性致病菌的控制问题提供了新思 路 具有重要现实意义 本研究以蓝细菌p c c 6 8 0 3 为研究对象 对其染色体上可 能的毒素一抗毒素系统基因进行研究 主要研究内容包括 1 根据细菌染色体上毒素 抗毒素系统基因的遗传结构特点和保守序列的同 源性 利用分子信息学技术系统分析了蓝细菌p c c 6 8 0 3 染色体上可能的毒素 抗 毒素系统基因 利用本研究构建的双诱导调控启动子的大肠杆菌重组系统 试验 鉴定了1 2 对可能的毒素 抗毒素系统基因对大肠杆菌细胞的毒性作用和抗毒性作 用 2 1 根据在大肠杆菌细胞中的分析结果 构建了受铜离子诱导表达的整合性重 组系统 利用该系统分析了s s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 s s r l l l 4 s l r 0 6 6 4 和s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0 在 p c c 6 8 0 3 细胞中的毒性和抗毒性作用 3 构建了s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0 s s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 s s r l l l 4 s l r 0 6 6 4 基因对缺失的突变 株 以及以上各毒素一抗毒素系统基因表达调控质粒 对分析这些系统的表达调 控模式具有重要价值 根据上述研究得到以下结果 1 利用本研究构建的双诱导调控启动子的大肠杆菌重组系统 试验分析了 江苏大学硕士学位论文 1 2 对可能的毒素 抗毒素系统基因中毒素基因对大肠杆菌细胞的毒性作用 其中 7 个基因诱导表达后对细胞具有显著的毒性作用 7 个具有显著的细胞毒性作用 基因的上游基因诱导表达后 能抑制毒性基因表达产物的细胞毒性作用 这7 对基因包括s s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 s s r l l l 4 s l r 0 6 6 4 s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0 s s l 2 j 3 8 哂1 1 1 0 9 2 s s r 2 9 6 2 s l r l7 6 7 s s 的3 8 5 s l l 0 2 0 5 s s l l 0 0 4 s l l 0 5 2 5o 2 铜离子诱导s s l 2 9 2 1 s l r 0 6 6 4 和s l r 2 0 8 0 表达产物对蓝细菌p c c 6 8 0 3 具有 细胞毒性作用 而铜离子诱导s s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 s s r l l l 4 s l r 0 6 6 4 和s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0 的共表达时 细胞的毒性作用被抑制 根据上述结果s s l 2 9 2 1 s l r 0 6 6 4 和s l r 2 0 8 0 为毒素基因 而对应的上游基因s s l 2 9 2 0 s s r l l l 4 和s s r 3 5 3 2 为抗毒素基因 这3 对基因中相邻的两个基因共同构成p c c 6 8 0 3 染色体上的毒素一抗毒素系统基 因 3 在实验室正常培养条件下 这些基因的缺失并不影响细胞的正常生理功 能 这些突变株的构建为确定这些基因的生理功能和表达调控打下了基础 关键词 集胞藻p c c 6 8 0 3 细胞程序性死亡 毒素基因 抗毒素基因 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t t o x i n a n t i t o x i ng e n es y s t e m s t as y s t e m s i sw i d e l yd i s t r i b u t e da m o n gb a c t e r i a c h r o m o s o m e s a c t i v e db yp r o t e a s ei n d u c e dt oo v e r e x p r e s sb ye n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s t as y s t e m sc a l lt a k ep a r ti no rm e d i a t ec e l lg r o w t hi n h i b i t i o no rc e l ld e a t ha sa p r o k a r y o t i c c e l ls t r e s s f a c t o r h o w e v e r o n l yaf e wt as y s t e m s o nb a c t e r i a c h r o m o s o m e sh a v eb e e nd e m o n s t r a t e db ye x p e r i m e n t a lt e s ta n di t sf u n c t i o na n d p h y s i o l o g i c a lr o l ea r en o tq u i t ed e a r t h er e s e a r c hh a ss h o w n t h a tm a z e fs y s t e mo n e c o l ic h r o m o s o m ec a nm e d i a t e p r o g r a m m e d c e l l d e a t h 口c d i n d u c e db y e n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s b e c a u s et h es e q u e n c eo ft as y s t e m si nb a c t e r i ah a sal o w h o m o l o g y n o tm a n yr e s e a r c hh a sb e e nd o n e t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fc h r o m o s o m e t a s y s t e m si ss t i l lu n d e rd e b a t e t h e r e f o r e t h es t u d yo nt h ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no f t as y s t e mi nd i f f e r e n tb a c t e r i ah a sa ni m p o r t a n tv a l u et oc o m p l e t et h et h e o r yo f p c da n du n d e r s t a n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fb a c t e r i a a d a p t a t i o n t o e n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s m o r e o v e r b a s e do nt h et o x i c i t yo ft o x i cg e n ei nt h et a s y s t e m s i th a sb e e ns u g g e s t e dt om a k ea n t i t o x i np r o t e i n e g m a z e i t sat a r g e t f r e d s m a l lm o l e c u l e st h a td i s r u p tt h et ai n t e r a c t i o na n df r e et h et o x i nt ok i l lp a t h o g e n i c b a c t e r i a t h i sw o l l l dp r e s e n tan o v e lo p p o r t u n i t yf o ra n t i b a c t e r i a lt h e r a p y t h e p r e s u m e da ts y s t e m so ns y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3c h r o m o s o m ei ss t u d i e di nt h i s t h e s i s i ti n c l u d e s 1 a c c o r d i n gt ot h eg e n e t i cs t r u c t u r ea n dh o m o l o g yo fc o n s e r v a t i v es e q u e n c e w e a n a l y z e d1 2p a i r so fg e n e sw h i c ha l ep r e d i c t e da sa ts y s t e m so ns y n e c h o c y s t i s s p p c c 6 8 0 3c h r o m o s o m eu s i n g m o l e c u l a ri n f o r m a t i c s t e c h n i q u e b yu s i n g t h e p l a s m i dw h i c hh a st w op r o m o t e r si n d u c e db yi p t ga n da r a b i n o s er e s p e c t i v e l y w e a n a l y z e dt h et o x i na n da n t i t o x i nf u n c t i o no fp r e s u m e d1 2p a i r so fg e n e si ne c o l i 2 b a s e do nt h er e s u l t si ne c o l i r e c o m b i n a t i o np l a s m i d si n d u c e db yc o p p e ra r e c o n s t r u c t e d t h et o x i na n da n t i t o x i nf u n c t i o no fs s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 s s r l h 4 s l r 0 6 6 4a n d s s r 3 5 3 2 一s l r 2 0 8 0i np c c 6 8 0 3i sc h e c k e db yu s i n gt h o s ep l a s m i d ss y s t e m 3 t h ed e l e t i o nm u t a n t so fs s r 3 5 3 2 一s l r 2 0 8 0 s s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1a n ds s r l l l 4 s l r 0 6 6 4a r ec o n s t r u c t e d i na d d i t i o n t oa n a l y z et h ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o np a t t e m m 江苏 大学硕士学位论文 o ft h o s ea t s y s t e m s e x p r e s s i o nr e g u l a t i o np l a s m i d sa l ec o n s t r u c t e d t h i ss t u d yh a st h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n s 1 b yu s i n gt h ep l a s m i dw h i c hh a st w op r o m o t e r si n d u c e db yi p t ga n da r a b i n o s e r e s p e c t i v e l y w ea n a l y z e dt h et o x i na n da n t i t o x i nf u n c t i o no fp r e s u m e d1 2p a i r so f g e n e si ne c o l i a f t e ri n d u c t i o n 7o ft h e mh a v es t r o n gt o x i ce f f e c tt oe c o l i a f t e r i n d u c i n gt h ec o r r e s p o n d i n gu p s t r e a mg e n e s t h et o x i c i t yc a nb ei n h i b i t e d t h ep a i ro f g e n e s i n c l u d e s s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 s s r l l l 4 s l r 0 6 6 4 s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0 s s l 2 1 3 8 s u l 0 9 2 s s r 2 9 6 2 s l r l7 6 7 s s l 0 3 8 5 s l l 0 2 0 5a n ds s l l 0 0 4 s h 0 5 2 5 2 t h ep r o d u c t so fs s l 2 9 2 1 s l r 0 6 6 4a n ds l r 2 0 8 0i n d u c e db yc o p p e f r e s p e c t i v e l y h a v et o x i ce f f e c tt op c c 6 8 0 3 h o w e v e r w h e ns s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 s s r l h 4 s l r 0 6 6 4a n d s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0a r ec o e x p r e s s e di n d u c e db yc o p p e r t h et o x i c i t yc a nb ei n h i b i t e d a c c o r d i n gt ot h er e s u l t s s s l 2 9 2 1 s i r 0 6 6 4a n ds l r 2 0 8 0a r et o x i cg e n e s a n dt h e c o r r e s p o n d i n gu p s t r e a mg e n e ss s l 2 9 2 0 s s r l l l 4a n ds s r 3 5 3 2a l ea n t i t o x i cg e n e s t h e y a l e3a t s y s t e m si np c c 6 8 0 3 c h r o m o s o m e s 3 w h e nc e l l sa l ec u l t i v a t e du n d e rt h en o r m a lc o n d i t i o n t h ed e l e t i o no ft h et a s y s t e m sd o e sn o ta f f e c tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n t h ec o n s t r u c t i o no fe x p r e s s i o n r e g u l a t i o nm u t a n th a v ee s t a b l i s h e df o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo fp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o na n dt h er e g u l a t i o ns y s t e m k e yw o r d s s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 p r o g r a m m e dc e l ld e a t h t o x i ng e n e a n t i t o x i ng e n e i v 江苏大学硕士学位论文 第一章 文献综述 目录 1 1 1 蓝细菌p c c 6 8 0 3 概况 1 1 1 1 蓝细菌简介 1 1 1 2 蓝细菌p c c 6 8 0 3 的生理 生化特征 1 1 1 3 蓝细菌基因图的制定 2 1 1 4 蓝细菌全基因组测序 2 1 1 5 蓝细菌的遗传系统 3 1 1 6 蓝细菌p c c 6 8 0 3 的遗传操作系统 3 1 2 细菌细胞的程序性死亡和 毒素一抗毒素系统 7 1 2 1 细胞程序性死亡 p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p c d 7 1 2 2 细菌细胞的程序性死亡 7 1 2 3 细菌细胞程序性死亡的机制 8 1 2 4 细菌 毒素 抗毒素系统 8 1 3 蓝细菌p c c 6 8 0 3 基因组中的 毒素 抗毒素系统 1 2 1 4 本项研究的目的和内容 1 2 第二章蓝细菌p c c 6 8 0 3 染色体上毒素 抗毒素基因在大肠杆菌中的克隆和鉴定 1 4 2 1 材料和方法 1 4 2 1 1 菌株及培养条件 1 4 2 1 2 分子生物学操作方法 1 5 2 1 3p c c 6 8 0 3 染色体的提取方法 1 5 2 1 4p c r 反应体系的建立 1 5 2 1 5 毒素或抗毒素 毒素基因诱导表达及细胞活性分析 1 7 2 2 结果 1 7 2 2 1p c c 6 8 0 3 染色体上毒素一抗毒素系统基冈序列分析 1 7 2 2 2 双诱导调控启动子质粒的构建 1 7 2 2 3p c c 6 8 0 3 染色体上毒素基因的扩增 克隆 鉴定 1 9 2 2 5p c c 6 8 0 3 染色体上抗毒素基因的扩增 克隆 鉴定 2 2 2 2 6 含毒素和抗毒素基冈重组质粒中克隆片段在e c o l ib l 2 1 d e 3 的诱导表达 2 4 2 2 7 毒素 抗毒素基因诱导表达对细菌生长的影响 2 5 2 3 讨论 2 8 第三章s s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 s s r l l l 4 s l r 0 6 6 4 s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0 在蓝细菌p c c 6 8 0 3 中的毒性 抗 毒性作用 v 江苏大学硕士学位论文 3 1 材料和方法 3 0 3 1 1 菌株及培养条件 3 0 3 1 2 实验方法 3 1 3 1 3p c c 6 8 0 3 的转化 3 2 3 1 4 诱导表达突变株诱导方法及表型分析 3 2 3 2 结果 3 3 3 2 1 诱导s l r 0 6 6 4 和s s r l l l 4 s i r 0 6 6 4 共表达重组质粒的构建 3 3 3 2 2 诱导s l r 2 0 8 0 表达和s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0 共表达重组质粒的构建 3 5 3 2 3 诱导s s l 2 9 2 1 表达和s s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 共表达重组质粒的构建 3 6 3 2 4 铜离子诱导表达突变株构建 3 7 3 2 5 铜离子诱导表达突变株细胞活性分析 3 8 3 3 讨论 8 第四章s s l 2 9 2 0 s s i 2 9 2 1 s s r l l l 4 s l r 0 6 6 4 s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0 缺失突变株和表达调控突变株构 建 4 1 材料和方法 4 1 4 1 1 菌株及培养条件 4 1 4 1 2 实验方法 4 1 4 结 j 乏 4 3 4 2 1s s r l l l 4 s l r 0 6 6 4 基因的缺失突变重组质粒的构建 4 3 4 2 2s s l 2 9 2 0 s s l 2 9 2 1 基因的缺失突变重组质粒的构建 4 4 4 2 3s s r 3 5 3 2 s l r 2 0 8 0 基冈的缺失突变重组质粒的构建 4 4 4 2 4 缺失突变株的构建 4 5 4 2 5 毒素一抗毒素系统基因表达调控质粒的构建 4 5 4 2 6 毒素一抗毒素系统基因表达调控突变株的构建 4 8 4 3 讨论 4 9 第五章主要结论与展望5 1 5 1 主要结论 5 1 5 2 研究展望 5 2 致谢 参考文献 v i 6 0 5 4 江苏大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 蓝细菌p o c 6 8 0 3 概况 1 1 1 蓝细菌简介 蓝细菌 c y a n o b a c t e r i a 亦称蓝藻 b l u e g r e e na l g a e 是一群种类繁多 分 布广泛 能进行放氧光合作用的原核生物 具有完整的光合系统 传统上植物学 家把蓝细菌定为藻类中的蓝细菌门 近十几年来 根据其原核生物的结构和遗传 特点 将蓝细菌归为细菌 属革兰氏阴性细菌 形态上可分为单细胞 无分化丝 状体 具异形胞丝状体和具分叉的丝状体n 1 在长期的进化过程中 这类生物发 展了一套独特的形态和生理生化机制 能在各种不同的生物环境中生衍 广泛分 布于地球上各种类型的水环境中 为海洋和内陆地区最重要的原初生产者 蓝细 菌具有多样性 独特的生理特征以及重要的进化地位 在蓝细菌分子遗传学研究 中不断借鉴其它微生物研究的技术方法 使其成为分子遗传学的理想材料 其特 点是 1 蓝细菌的结构和遗传复杂性类似于革蓝氏阴性细菌 2 一些蓝细菌 有天然的转化系统和有效的转移系统 3 用兼性异养蓝细菌来建立分离光合作 用突变株对有关基因进行遗传分析 比利用高等植物方便 并且可避免植物细胞 器基因与核基因的相互作用 4 根据密码子使用的偏向性 蓝细菌细胞已成为 外源基因表达的理想宿主乜1 蓝细菌的分子生物学和基因工程在近1 5 年来得到了 较快的发展 它已经成为基因工程的有效工具 1 9 9 6 年 集胞藻6 8 0 3 s y n e c h o c y s t i s s p p c c6 8 0 3 基因组全序列的测定完 1 标志着蓝细菌基因工程已经步入了基 因组后时代 目前 鱼腥藻7 1 2 0 a n a b a e n as p p c c7 1 2 0 基因全序列也已完成 螺旋藻的测序也在积极的展开 这一切都表明蓝细菌分子生物学己成为分子生物 学的研究热点之一 1 1 2 蓝细菌p o c 6 8 0 3 的生理 生化特征 蓝细菌p c c 6 8 0 3 是一种单细胞嗜中温蓝细菌 在b g 一1 1 培养基中最适生长温 度为3 0 2 在2 5 4 0 c 温度区间较适合其生长 它不仅能进行光合自养生长 而 且还能利用葡萄糖进行异养生长 它具有天然的d n a 转化系统 被称为光合系统 的分子生物学研究的重要模式 江苏大学硕士学位论文 1 1 3 蓝细菌基因图的制定 在蓝细菌基因组早期的研究中 由于未能建立适合噬菌体转导或染色体结合 转移系统 基因组结构的研究局限于限制酶切图谱定位 利用染色体步查技术已 将a n a b a e n av a r i a l i l i s9 6 0 个克隆的c o s m i d s 文库分为4 0 个连锁族 并把一些 基因定位于这些连锁族内h 1 但是这一技术难以绘制出完整的基因图 因为有一 些藻染色体片段可能无法在e c o l i 中克隆 在c o s m i d s 连锁群之间形成空缺 制定蓝细菌基因图真正突破是大片段染色体操作的脉冲直变角场电泳 p h o g e 的应用 选择一些在a n a b a e n ap c c 7 1 2 0 染色体上仅有极少的识别位点 的限制酶对染色体完全酶切并做p h o g e 和s o u t h e r n 杂交 从而完成基因组的大尺 度物理图谱畸1 研究结果表明尽管蓝细菌基因也以操纵子的形式组织 但功能相 关的的基因并非集中在一处 而是分散于染色体上不同的位置 编码光系统i 光系统i i 复合体的基因及异形胞包被结构相关的基因等该如此 而且表明 a n a b e a n a 的基因图与叶绿体的基因图在排列顺序上明显不同 除a n a b e a n ap c c 7 1 2 0 外 s y n e c h o c o c c u sp c c 7 0 0 2 6 8 0 3 的染色体物理图谱 也早已相继完成 1 1 4 蓝细菌全基因组测序 由于蓝细菌基因物理图谱的制定和上世纪九十年代基因测序技术的飞速发 展 使得更精细全面的解析基因的结构和功能成为可能 其中 集胞藻 s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 是单细胞 可异养生长的种类 具有天然的d n a 转化系统 被称为光合系统的分子生物学研究的重要模式砸3 该种全基因组序列 于1 9 9 6 年公布 在3 6 m b 的基因组中 由3 1 6 8 个可能的蛋白编码基因 占基因组 总长的8 7 o 还有两个r r n a 基因丛和4 2 个t r n a 基因 基因组中有9 9 个类似插入 因子 i s 的结构 但只有2 6 个可能编码完整的转座酶 h t t p 唧 k a z u s a o r j p c y a n o 另一个被测序的单细胞集胞藻是集胞藻 s y n e c h o c o c c u ss p w h 8 1 0 2 基因组大小为2 7 2 e a 有2 4 2 6 个蛋白编码基因 该种广泛分布于全世界海洋中 是地球上主要的原初生产者之一 不具有任何明 显的胞外结构 却能够推动自身以2 5 m m s e c 的速度在海水中运动 可进行遗传 j 操作 已完成测序的丝状固氮蓝细菌有鱼腥藻 a n a b a e n as p 7 1 2 0 和点念珠藻 n o s t o cp u n c t i f o r m e a t c c 2 9 1 3 3 鱼腥藻7 1 2 0 基因组大小为6 4 m b 除染色体 2 江苏大学硕士学位论文 外 还包括6 种质粒 染色体上有5 3 6 8 个蛋白编码基因 4 个r r n a 基因丛和4 8 个t r n a 基因 4 个小结构r n a 基因 4 5 蛋白编码基因序列与已知功能的蛋白基因相似 2 7 假定蛋白基因 2 8 的基因与已知或推测的蛋白无显著的相似性 6 0 多个已报 道参与异形胞形成和固氮作用的基因位于染色体上 1 9 5 个基因编码二元信号转 导系统的组分口1 点念珠藻除异形胞分化外还可进行异养生长 产生厚壁胞子 和藻殖段 侵染并与植物共生嘧1 在鱼腥藻中发展起来的基因转移系统和转座子 诱变方法均适用于该种 但转座子诱变效力较低圈1 其基因组大小为9 2 m b 有7 4 3 2 个蛋白编码基因 1 1 5 蓝细菌的遗传系统 蓝细菌具有植物型放氧光合作用特性 进行光合作用的细胞器一内囊体的膜 结构和功能与真核生物叶绿体的类似 根据蓝细菌与叶绿体的r r n a t r n a 序列 转录 翻译的机制比较所得结果 支持叶绿体的内共生起源假说 它们d n a 中的 g c 为3 5 7 1 反映了遗传上的异质性 由于蓝细菌包含有许多基本的植物功能 特别是对于具有异养生活能力的蓝细菌 如集胞藻6 8 0 3 失去光合作用的类囊体膜 的突变株仍然可利用糖源正常生长 们 是研究光合作用等过程的理想模型系统 鱼腥藻p c c 7 1 2 0 是一种丝状固氮蓝细菌 在缺氮诱导后有些细胞能分化成具有固 氮作用的异形胞 由于在上世纪末已建立了完善的遗传分析系统 已成为一维生 物体细胞分化研究的模式n 1 1 6 蓝细菌p c c 6 8 0 3 的遗传操作系统 蓝细菌遗传操作系统的建立始于上世纪八十年代 包括蓝细菌的诱变 突变 株筛选 基因的转移转化 不同功能质粒的构建 由于建立了完善的遗传分析系 统 蓝细菌中的许多种已成为研究某些生理生化分子机制的有效生物模式 蓝细 菌p c c 6 8 0 3 的遗传操作主要包括基因转移和诱变 1 1 6 1 基因转移系统 基因转移系统包括转化和接合转移两种方式 首先 蓝细菌p c c 6 8 0 3 是可天 然转化的单细胞蓝细菌之一 蓝细菌自然转化的机理最近才有所阐明 y o s h i h a r a 等人发现s y n e c h o c y s t i s p c c6 8 0 3o f rs l r 0 1 9 7 为外源基因进入所必须 染色 体d n a 质粒及p c r 产物都可以作为其转化的外源d n a 一般认为蓝细菌d n a 转化感 3 江苏大学硕士学位论文 受态细胞出现于指数生长期 但没有峰值 当细胞进入静止期 或耗尽氮源 或 力h d n a 前遇黑暗 转化效率明显降低 蓝细菌p c c 6 8 0 3 生长至0 d 7 3 0 为0 6 0 8 转化效率较高 供体d n a 与受体d n a 进行双交换的同源片段长短影响转化效率 较 长的同源片段 转化效率较高 一般同源片段不短于5 0 0 b p 其它因素也可能通 过影响d n a 吸收或受体染色体不同位置重组频率不同而影响转化效率 另外 外 源d n a 浓度和受体细胞与d n a 温育的时间也会影响转化效率 w i l lj a m s 1 9 8 8 证实 温育时间在1 5 d 时内 转化效率随时间延长而提高 6 d 时以后呈降低趋势 因此温育时间在2 6 d 时比较好 温育时应有较合适的光强 同时外源d n a 浓度 越大 转化效率越高n 2 1 3 1 此外 接合转移也是蓝细菌基因转移最常用的方法 一般用于丝状种类的蓝 细菌 对单细胞蓝细菌同样适用 在接合质粒介导下 通过细胞间直接接触而进 行质粒d n a 转移口胡 三亲接合转移系的过程如图 1 1 所示 是通过细胞间接触介 导 借助一个广谱性接合质粒 使目的基因从一个细菌 如e c o l i 转移至另一 个细菌 如蓝细菌 接合转移涉及三种质粒 运载质粒 c a r g op l a s m i d 具有o r i t 位点 目前人们使用的运载质粒有两种 由p b r 3 2 2 衍生的质粒和r s f l 0 1 0 衍生的质粒 辅助质粒 h e l p e rp l a s m i d 提供d n a 转移必需的转移功能 含 有m o b m o b i l i t y 基因 其产物能识别b o m b a s i so fm o b i l i z a t i o n 位点 且含 a v a l 或e c 0 4 7i i 甲基化酶基因 从而使运载质粒避免限制性内切酶的降解 接 合质粒 c o n j u g z t i v ep l a s m i d 能够在不同宿主间自主转移 提供转移功能 其上的t r a 基因 控制接合毛的生成 将运载质粒转移至受体细胞 3 种质粒各自 有不同的复制子 可以存在于不同的大肠杆菌细胞中 也可以存在于相同的大肠 杆菌细胞中 在实际操作中 参与接合转移的细胞有三个 含有接合质粒的 e c o l i 菌株 含有运载质粒和辅助质粒的e c o li 菌株 蓝细菌细胞 所以又 称为三亲接合转移系统 见图 卜1 1 5 o 在接合转移时 接合质粒先转到辅助质 粒和运载质粒所在的细胞中 在接着运载质粒转移到蓝细菌细胞中 多个质粒要 在同一个细胞中稳定存在 各个质粒必须是具有不同复制子的相容质粒 并具有 不同的抗性基因以便标记识别m 1 在转移之前 运载质粒首先在o r i t 位点被m o b 基因的编码的产物切开一个缺刻 带缺刻的运载质粒再在t r a 基因产物作用下从 供体细胞转移到受体细胞中 三亲接合转移方法的发现使蓝细菌的转化效率比自 4 江苏大学硕士学位论文 然转化法提高了1 2 个数量级 余利红等 2 0 0 2 曾通过接合转移将带有大肠杆 菌乳糖操纵子的广宿主质粒导入蓝细菌p c c 6 8 0 3 使它们获得了利用乳糖生长的 能力 图 1 1 1 1 6 2 诱变 突变株对于探究代谢过程的未知基因及已知基因的功能是十分重要的 转入 的d n a 可通过自主复制 同源或非同源交换的形式在宿主细胞中生存 d n a 的整合 有两种方式 1 同源整合 导入的d n a 片断与宿主的基因组的同源区域发生交 换使外源d n a 稳定整合在蓝细菌染色体上 有单交换与双交换两种类型 见 图 卜2 借助双交换整合可对基因进行敲除或插入失活 单交换可使蓝细菌基 因组中一个d n a 片断出现两个拷贝 此外 借助同源重组也可对已知序列的基因 进行定向插入诱变 随着多种蓝细菌基因组序列的完成 利用定向诱变 大规模 地研究基因的功能已成为可能 也是当前功能基因组学研究的主要任务之一 2 非同源整合 如转座子的整合 它可随机地插入到基因组上 天然的转座子及人 5 江苏大学硕士学位论文 工的转座子均可以成功的用于对蓝细菌基因组的随机插入突变 因此定向诱变或 随机插入诱变修饰蓝细菌基因组 可获得各种类型突变株 c h a u v a t 等将c m 或i 1 n 抗性的d n a 片段与酶切过的蓝细菌染色体d n a 连接 直接转化p c c 6 8 0 3 获得了光 合突变株 b a t r a n s f o r m a t i o no l rc o n j u g a t i o no fp l a s m i di n t ow i d e t y p es t r a i n w i md o u b l e c r o s s o v e rr e c o m b i n a t i o n b t r a n s f o r m a t i o no rc o n j u g a t i o no fp l a s m i di n t ow i d e t y p es t r a i n w i t hs i n g l e c t o s s o v e rr e c o m b i n a t i o n 图1 2 质粒的整合类型 f o r mb r y a n td a 1 9 9 4 嘲 所有用于诱变的技术都需要考虑蓝细菌的遗传和形态特征 有些蓝细菌至少 有1 0 一1 5 个拷贝的单一基因组n 6 3 带有新导入突变的细胞是一个杂合体 因此必须 通过几轮的分离纯化才能得到纯合体 在丝状蓝细菌中 藻丝中即使有一个细胞 带有一个野生型拷贝的基因 将表现出野生型的表型n 刀但可通过超声波将藻丝处 理成单细胞 从长出的藻落中 可逐步分离只有突变基因组的突变株n 羽 6 弦 暑i 一 州 叫 一 1 2 细菌细胞的程序性死亡和 毒素一抗毒素系统 1 2 1 细胞程序性死亡 p r o g r a m m e dc ei ld e a t h p c d 细胞程序性死亡 p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p c d 概念是1 9 7 2 年由美国病理 学家k e r r 等人首次提出的 近十几年来已成为生物学界研究的热点问题之一 n 钔 它是由细胞自身的程序性自杀机制激活的细胞死亡现象 在多细胞真核生物 中 程序性的细胞死亡是由细胞表面的死亡受体介导 通过一系列的半胱氨酸蛋 白酶 c a s p a s e s 啪1 作用而启动 维系个体结构稳定 功能平衡和生长发育所必需 的基本生物学过程 一般存在于个体的发育过程中 导致细胞功能和形态学上的 改变 如蛋白质的水解 d n a 和r n a 的降解 细胞的收缩 以及细胞碎裂形成凋亡 小体 a p o p t o t i cb o d i e s 等 并最终导致细胞的死亡 在多细胞的有机体中伴随 着细胞形态结构和生理变化的死亡是细胞死亡的主要方式 其意义在于消除过多 潜在的有害细胞乜1 翻 最初是以细胞的死亡为特征的一种形态学的改变而被定 义的 并称为 细胞凋亡 嘲 现今 随着凋亡机制研究的深入 这一概念的 外延和内涵有了很大变化 凡是细胞内死亡程序所介导的任何形式的细胞死亡 即不论由什么因素诱导 以及是否表现出 凋亡 所具有的细胞特征 统称为细 胞程序性死亡乜1 1 1 2 2 细菌细胞的程序性死亡 根据传统观点 认为细菌不存在细胞程序性死亡 但近十年的研究结果清 楚的表明环境胁迫可诱导细菌细胞的程序性死亡 在细胞或无芽孢的杆菌中 细 胞的程序性死亡是由一个特有的遗传系统来介导的 它包含了一对特定双组分的 基因 双组分之一是稳定的毒素 而另一个是能够阻止毒素致死行为的抗毒素 直到近期 这种细菌的 细胞程序性凋亡 基因系统在大肠杆菌的低拷贝质粒 中被发现 这一系统介导细菌细胞 分离后杀死作用 即在细菌细胞分裂后的 子代细胞丢失含有这一系统的质粒 或其它的染色体外遗传因子 时 细胞就会 被选择性的杀死 这是由于质粒上含有抗毒素基因以及毒素基因 抗毒素基因的 产物不稳定 容易降解 而毒素基因的产物比较稳定 因此细胞需要不断的合成 抗毒素蛋白来中和毒素蛋白 y a r m o l i n s k y 和c o l l e a g u e s 把这样一对负荷质粒基 因称为 毒素一抗毒素系统 因为它们导致细菌宿主沉溺于质粒上不必要的基因 7 江苏大学硕士学位论文 成分 且这种情况持续存在嘲一 和其它一些非常精确的阻止质粒丢失的机理 例 如复制控制 质粒的分配 以及多聚体的溶解 一样啪脚瑚j 细菌宿主细胞内低 拷贝质粒的稳定性是由杀死无质粒细菌的机理来维护的 而这一机理以 毒素一 抗毒素系统 为条件 1 2 3 细菌细胞程序性死亡的机制 细菌细胞程序性死亡可分为两种机制 一种为种群中部分细胞发生死亡 这就涉及到细胞发生分化 在胁迫条件下 细菌群体中一部分细菌可执行特殊的 功能 剩下的未分化细菌提供养料 一旦未分化的细菌获得足够的养料时 分化 的细菌细胞便死亡 另一种为无明显细胞分化行为的细菌凋亡 细菌通过p c d 过 程阻止缺陷细胞 如损伤的细胞等 的继续分裂和细胞间的信息传递 从而清除 这些细胞 以保证种群的存活 在大肠杆菌中 其程序性死亡属于后者 p c d 机 制由一个独特的基因系统所介导 这个独特的系统y a r m o l i n s k 等人称之为 毒素一 抗毒素系统 a d d i c t i o nm o d u l e 嗍 1 2 4 细菌 毒素一抗毒素系统 1 2 4 1 细菌 毒素一抗毒素系统 的种类 在细菌中已经鉴定出两种不同的典型 毒素一抗毒素系统 一种是蛋白毒素 一抗毒素系统 即由稳定的毒素产物和不稳定的抗毒素产物所构成的毒素一抗毒素 系统m 1 另一种是反义r n a 毒素一抗毒素系统 在稳定的毒素从其信使r n a 合成得 到毒性蛋白质 但是抗毒素成分是一种小的不稳定反义r n a 分子 这种反义r n a 分子通过与毒素蛋白的m r n a 互补配对阻止毒性蛋白的合成 3 2 o 在细菌细胞中质 粒携带这种 毒素一抗毒素系统 但是 在游离的质粒细胞内 这种不稳定的反 义r n a 分子被迅速降解 毒素翻译 随后导致无质粒的细胞死亡 3 0 蛋白质的 毒素一抗毒素系统 最显著的特征是具有惊人的组织和功能基团 主要包括 1 一个蛋白质 毒素一抗毒素系统 包含两段邻近基因 2 第二 个基因片段的产物是一种短期存在的蛋白质 它能够对抗由第一个基因片段产生 的毒性作用 3 这种抗毒性蛋白是由模块中的上游基因编码的 4 毒性和抗 j 毒性蛋白是共同表达的 5 这种抗毒性蛋白被过度地合成 6 这种毒性和抗 毒性蛋白非常小 毒性蛋白拥有1 0 0 1 3 0 个氨基酸 而抗毒性蛋白则仅仅包含 8 江苏大学硕士学位论文 8 0 8 5 个氨基酸 7 以上所说的毒性和抗毒性蛋白可以相互作用 8 这种抗 毒性蛋白会被一种特殊的细菌蛋白酶降解 9 这种 毒素一抗毒素系统 能够 在转录水平上进行自身调节 这一过程既可以通过毒素和抗毒素的复合物 同时 也可以通过单独的抗毒素来完成 位于不同染色体外遗传因子或大肠杆菌染色体 上的蛋白质 毒素一抗毒素系统 具有相似的基因结构和功能 尽管如此 它们 也很少具有同源性瞰j 此外 这些 毒素一抗毒素系统 的毒性和抗毒性蛋白本 身的性质也有所不同 细菌蛋白酶能够降解抗毒性蛋白 1 2 4 2 位于质粒上的蛋白毒素一抗毒素系统 根据蛋白质的 毒素一抗毒素系统 的基因所在遗传物质上的位置可分为两 类 一类是位于质粒上的 毒素一抗毒素系统 另一类是位于染色体上的 毒素 一抗毒素系统 大肠杆菌中质粒r 1 和质粒r 1 0 0 就是依赖毒素一抗毒素系统介导机制稳定维持 其低拷贝的质粒 它们的毒素一抗毒素系统位于每个质粒复制起始区的附近 r 1 质粒中的毒素一抗毒素系统称为 p a r d r 1 0 0 质粒中的称为