膜蛋白整体解决方案.doc

膜蛋白整体解决方案提起膜蛋白，浮现在广大从事蛋白研究的科研工作者脑海中的是两点：1.膜蛋白功能的重要性。2.膜蛋白研究的困难性。众所周知，膜蛋白在细胞间接触、表面识别、信号转导、酶活性和运输方面都扮演着重要的角色。由于它们功能多样，也就成为理想的药物靶点。然而，膜蛋白的生化和结构研究一直都很缓慢。Protein Database的统计数据表明，在成功解析出三维结构的蛋白中，膜蛋白只占1%，这与膜蛋白占总蛋白的1/3的总量的差别巨大。由此也可以看出膜蛋白研究确实困难重重。图 1. 利用QIAgenes优化序列，昆虫细胞体外进行膜蛋白表达。利用 EasyXpress Insect Kit II，crude lysates （T）， supernatant （S）， and pellet fraction （P） by SDS-PAGE and western blotting using PentaHis antibodies. Note that microsomes with integrated membrane proteins are visualized in the pellet fraction （P） after centrifugation of the reaction.由于膜蛋白的过表达可能对细胞有毒性，并且在纯化时很难选择合适的溶解试剂，再加上目前对膜蛋白晶体培养缺少有效方法和模型，所以要想顺利地获得膜蛋白的三维数据更是难上加难。幸亏技术总在进步，创新的产品也不断涌现。QIAGEN在2009年推出了膜蛋白的整体解决方案：QIAgenes Expression Kit-解决膜蛋白表达难题；Ni-NTA membrane Kit-高效率纯化重组膜蛋白；NeXtal Cubic Phase Kit-轻松获得膜蛋白晶体不再是梦想。QIAgenes Expression Kit预制蛋白表达载体，可以帮你克服蛋白（包括膜蛋白）表达的难题。该预制表达载体采用最先进的GeneOptimizer软件，对DNA序列进行以下方面的优化：稀有密码子，GC含量，ARG位点，可变剪切点，mRNA二级结构等因素进行优化，确保优化后的序列能在E.coli的体内，体外，真核细胞的体内或体外，以及哺乳动物细胞中进行高效表达。成功表达了膜蛋白，接下来的挑战就是怎么分离出表达的膜蛋白。与可溶性蛋白不同，膜蛋白具有单重或多重跨膜结构容易发生聚集，导致膜蛋白很难溶解。目前常用的方法就是去污剂进行膜蛋白的溶解。去污剂同时具有疏水和亲水区域，和膜蛋白可以形成膜蛋白-去污剂的复合物，从而可以进行进一步的纯化。但是这里必须要指出的是，由于膜蛋白的种类不同，适合其溶解的去污剂类型也不一样，这就需要在溶解膜蛋白是筛选一系列的去污剂以获得最佳的溶解效果。为了从事膜蛋白研究工作者的宝贵时间，QIAGEN推出了Ni-NTA Membrane Protein Kit，专门用于带有His标签的重组膜蛋白的溶解和后续纯化。Ni-NTA Membrane Protein Kit有两部分组成，一部分是膜蛋白的溶解试剂，该部分包括7种最常用的去污剂，用于供客户筛选最适合自己的去污剂；另一部分是Ni-NTA纯化试剂，用于在膜蛋白溶解用，利用His标签和Ni-NTA的亲和特性进行进一步纯化。该试剂盒最大的优势在于帮助膜蛋白研究者在最短的时间筛选得到最优的去污剂，并且进行Ni-NTA纯化获得纯度高的膜蛋白。图 2. 利用QIAGEN Ni-NTA membrane Kit筛选最适合NhaA 的去污剂类型。实验结果表明，OG和NG不适合该膜蛋白的溶解，可以选择DM， LDA0， DDM Cy6， 和FOS 进行NhaA溶解. M： His-tagged marker proteins。图 3. 选择DDM进行NhaA的溶解，然后利用Ni-NTA进行纯化。TP: total protein; SF: soluble fraction; FT: flow-through fraction; W: wash fraction; E: eluate; M: markers.在成功的纯化得到膜蛋白后，如果想获得膜蛋白的三维结构，又要面临一个难题。据Protein DataBase 的统计数据表明，在成功解析出结构的蛋白中，膜蛋白只占了1%左右的比重。由此也可以看出，膜蛋白缺乏缺乏有效的结晶方法。目前常用脂立方相法建立膜蛋白的结晶实验。但是该方法存在以下局限性：1.步骤超多，建立实验过程非常复杂2.容易造成结晶孔间的交叉污染3.不适合高通量实验4.浪费膜蛋白。为了使膜蛋白的结晶成功率提高，QIAGEN开发出了NeXtal CubicPhase Kit。NeXtal CubicPhase Kit之所以能够提高膜蛋白结晶的成功率，主要原因：1.采用NeXtal CubicPhase plate，这种结晶板修饰了monoolein (MO，用于建立脂立方相)，另外这种结晶板具有非常好的光学特性，在可见光下就可以观测到膜蛋白晶体。2.采用专门的膜蛋白结晶溶液，QIAGEN专门开发出CubicPhase III Suite用于膜蛋白结晶。 NeXtal CubicPhase Kit非常适合高通量膜蛋白结晶。