分子生物学在制药工程上的应用.doc

分子生物学在制药工程上的应用摘要：分子生物学在制药行业的应用遍布各个方向，如：基因工程技术、细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、酶工程技术等方面。下面主要就在抗肿瘤药物方面的具体应用以及药物机制做简要综述。关键词：抗肿瘤药、分子靶点、分子靶向、分子生物学人类肿瘤是在各种致癌因子的作用下, 局部组织的细胞在基因水平上对其生长失去正常调控, 导致克隆性异常增生而来。 其机制, 一般认为是由于细胞原癌基因的激活和 ( 或) 抑癌基因的失活造成的。近年来，随着肿瘤分子生物学及相关学科的飞速发展，人们逐渐认识到细胞癌变的本质可能是细胞信号转导通路的失调导致的细胞无限增殖，抗肿瘤药物研发理念发生了重大转变，从传统细胞毒类药物（主要作用于DNA、RNA和微管蛋白）转移到针对细胞内信号转导通路的新型抗肿瘤药物1。与传统细胞毒药物选择性差、毒副作用强、易产生耐药性等特点不同，靶向细胞内信号转导通路抗肿瘤药物针对于正常细胞和肿瘤细胞之间的差异，能够达到高选择性、低毒性的治疗效果2。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点（包括蛋白酪氨酸激酶、细胞周期蛋白、组蛋白去乙酰化酶以及泛素-蛋白酶体等）3，发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。现就目前上市或正在进行各期临床研究的靶向细胞内信号转导通路抗肿瘤新药研究做一综述。一、 靶向蛋白酪氨酸激酶抑制剂：蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质、主要分布在细胞膜上，可分为受体型和非受体型，其功能都是催ATP的磷酸基转移到下游蛋白的酪氨酸（Tyr）残基上，使其发生磷酸化4。酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中占据十分重要的地位，调节细胞的生长、分化、死亡等一系列生理生化过程。研究显示酪氨酸激酶的功能和肿瘤的发生、发展密切相关，超过50%的原癌基因和癌基因产物都是酪氨酸激酶，酪氨酸激酶异常表达通常导致细胞增殖调节发生紊乱，致使肿瘤发生；另外，酪氨酸激酶还与肿瘤的侵袭、转移、肿瘤新生血管生成以及肿瘤的化疗抗药性密切相关5。因此，酪氨酸激酶被认为是很有希望的抗肿瘤分子靶点，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发是国际抗肿瘤药物研究的热点，目前有超过20个分属不同家族的受体和非受体酪氨酸激酶被作为抗肿瘤药物靶标进行筛选，其中包括表皮生长因子受体（EGFR）血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）血小板衍生生长因子受体（PDGFR）成纤维细胞生长因子受体（FGFR）胰岛素受体（InsR）等6。从1998年至今，已经有多个小分子酪氨酸激酶抑制剂和单抗先后上市，超过100个药物正在进行临床研究。二、靶向EGF、VEGF和PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂：靶向EGFR、VEGFR和PDGFR等受体酪氨酸激酶抑制剂代表了抗肿瘤靶向药物研究中一个重要方向-抑制肿瘤新生血管生成7。这些抑制剂的研发，都是基于对肿瘤新生血管的生成过程的认识。肿瘤组织在很长一段时间处于休眠期，依靠组织渗透维持其生长，肿瘤长到1.0 2.0 mm3时，简单的渗透作用已经不能满足生长所需要的氧气和营养物质以及代谢物的清除，需要血管为之提供养料并运走代谢废料，肿瘤新生血管的生成是肿瘤迅速增殖和转移的重要条件之一，阻断肿瘤新生血管的生成就可有效地抑制肿瘤的生长和转移8 9。针对肿瘤新生血管生成各环节的抑制剂，都能不同程度的阻碍肿瘤新生血管的新生，减慢实体瘤组织生长速度。小分子EGF受体酪氨酸激酶抑制剂是近年来的研究热点之一，抑制EGF受体酪氨酸激酶的活性可以有效地抑制肿瘤的生长10。吉非替尼（Gefitinib）和埃罗替尼（Erlotinib）用于治疗接受过其他化学药物治疗的局部进展期或转移性非小细胞肺癌，临床试验显示出其耐受性好，毒性和不良反应小。抑制VEGFR可选择性地以肿瘤新生血管为靶点抑制肿瘤的生成。目前已有多个疗效较好的VEGF受体酪氨酸激酶的小分子抑制剂进入了临床研究。Zactima是阿斯利康公司开发的口服选择性VEGFR小分子抑制剂，于2006年2月获FDA快速审批资格，用于甲状腺癌的治疗。PTK787 (Vatalanib)是由诺华（Novartis）和先灵（Schering AG）两家制药公司合作开发的口服VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，期临床试验显示其具有良好的耐受性。PDGF主要在成纤维细胞、平滑肌细胞以及肾、睾丸、脑中表达，与肿瘤的发生有密切的关系11。在大多数胶质母细胞瘤中，存在着PDGF及其受体形成的自分泌环路，包括PDGF在肿瘤中的自分泌刺激、PDGF受体的过度表达或过度活化或者通过刺激肿瘤内血管生成，这些过程都会促进肿瘤生长。研究表明，PDGF受体之一的Flt23在急性粒细胞白血病（AML）中过度表达 可引发白血病12。CP-547632是辉瑞（Pfizer）公司开发的新型PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂，其能抑制内皮细胞的增殖，导致小鼠肺癌转移瘤的缩小，期临床试验显示CP-547632具有良好的耐受性 ，目前该药正处于治疗卵巢癌的期临床研究阶段。三、多靶点的酪氨酸激酶抑制剂：基于肿瘤发生发展的复杂性，绝大部分肿瘤不是依靠某一条信号通路来维持其生长和存活的，信号通路之间存在着交叉和代偿13。多靶标药物可以通过抑制多重信号通路或一条通路中上下游的多个分子而达到协同治疗、克服耐药的双重功能14。多靶点的酪氨酸激酶抑制剂目前已成为研究重点，具有广阔的发展前景。其中包括舒尼替尼（Sunitinib）和索拉芬尼（Sorafenib）在内的几个新药均获得了良好的临床评价。四、靶向组蛋白去乙酰化酶抑制剂：肿瘤的发生和诸多基因特别是癌基因的异常表达密切相关，而染色体结构是调控基因表达的重要因素。染色质组蛋白乙酰化和去乙酰化是调节基因表达的关键环节之一，与肿瘤的产生、增殖以及致癌基因和抑癌基因的表达水平有密切的关系15。组蛋白的乙酰化程度由一对功能相互拮抗的蛋白酶-组蛋白乙酰化酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）协调控制。近些年的研究发现HDAC是调控基因转录的关键蛋白酶，其功能的异常与肿瘤的发生和发展有直接关系，当HDAC过度表达，就会导致特定基因的不正常抑制，从而导致肿瘤和其他疾病的发生。因此，如果能抑制HDAC的活性便可增加组蛋白的乙酰化诱导对乙酰化敏感的启动子，从而激活抑癌基因的转录。另外研究发现HDAC抑制剂能激活主要组织相容性复合物、细胞间粘附分子ICAM-1、干扰素/等分子的转录，促进免疫细胞的识别和激活；HDAC抑制剂能抑制缺氧诱导的VEGF表达，抑制新生血管生成16。因此，HDAC成为目前抗肿瘤药物最具潜力的靶点之一。目前已经有10多个不同结构类型的HDAC抑制剂进入了/期临床试验，用于白血病和实体瘤的治疗。这些药物大多能在有效剂量显示出较好的耐受性，并显示出抗p-糖蛋白介导的多药耐药作用。其中SAHA Suberoylanilide hydroxamic acid 的期临床研究表明其具有较好的抗肿瘤效果且无严重的毒性和不良的反应。五、靶向泛素-蛋白酶体通路抑制剂：蛋白降解调控是细胞信号转导的一个重要方面，与基因转录水平的调控相比，这种转录后调控能保证细胞在遇到外界刺激时快速的做出反应17。UPS是真核细胞内依赖ATP的非溶酶体蛋白质降解途径，负责调控细胞内多种蛋白的水解过程，其中包括许多调节细胞生长、信号转导、基因转录和凋亡的重要分子。泛素介导的蛋白降解是一个复杂的多级反应，其过程主要是利用泛素活化酶E1 泛素结合酶E2与泛素，蛋白连接酶E3将泛素连接至目标蛋白作为标识，并送至20S蛋白酶体进行降解，最后由泛素分解酶将泛素分解并回收再利用18。UPS通路与肿瘤的发生、生长和转移都密切相关，该级联反应中各个环节都成为抗肿瘤药物作用的潜在靶点。通过阻断泛素分子C末端的腺苷酸化或与ATP分子竞争结合的策略来阻碍泛素的激活，根据E1与E2相互作用的结合域特异地设计能够干扰其相互作用的小分子化合物阻碍泛素分子在E1和E2之间的传递等，都能达到抗肿瘤的作用19。首个上市的以UPS为靶点的小分子抑制剂（Bortezomib Velcade PS-341）就是直接抑制于蛋白酶体活性，该化合物已先后于2003年5月和2004年4月被美国FDA和欧盟药品审评管理局EMEA 批准用于复发性和难治性多发性骨髓瘤的治疗。六、靶向细胞周期蛋白抑制剂：细胞周期蛋白（Cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase CDK）均属于细胞周期调节正控蛋白。其中，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过与Cyclin结合的复合形式出现 激活CDK活化底物磷酸化，驱动细胞周期各相进程，引起细胞的生长和增殖。在细胞的癌变过程中，通常都伴随着Cyclin的过度表达和CKIs的缺失，CDK的活性失去控制，细胞周期处于失控状态；肿瘤细胞的另外一个特点是细胞周期检查点缺陷，造成对细胞损伤应答的缺失。然而，这种周期检查点关卡的缺失，使得细胞对外界的损伤更加敏感，可以应用于肿瘤的治疗，增加放化疗的敏感性20。基于肿瘤细胞的上述特点，恢复肿瘤细胞的周期调控和取消检查点等都成为潜在的抗肿瘤作用靶点。具体策略包括对CDK的直接催化抑制，阻碍CDK的激活，干扰周期素与CDK的相互作用，影响周期素水解失活和抑制细胞周期检测点等21。目前，已经有多个细胞周期的调节剂进入了临床研究，其中植物来源的黄酮类物质Flavopiridol能明显抑制CDK1、CDK2和CDK4 阻碍细胞通过G1/S和G2/M期检测点，能抑制多种肿瘤细胞关卡的缺失，使得细胞对外界的损伤更加敏感又能被应用于肿瘤的治疗，增加放化疗的敏感性22。另外，星型孢菌素（Staurosporine）的类似物UCN-01除了抑制PKC外，还可直接抑制CDK1和CDK2的活性和细胞周期检测点激酶Chk1的活化，目前，正在进行临床期实验。结语：靶向细胞内信号转导通路抗肿瘤药物的成功上市，为新一代抗肿瘤药物的研发提供了乐观的前景。但是，必须看到靶向信号通路抑制剂只有在该信号通路高度激活的肿瘤上才产生更好地疗效，随着肿瘤分子生物学和细胞生物学的研究发展，越来越多的有效靶点被用来作为抗癌药物设计的基础，基于结构和作用机制的药物设计已成为当前发现抗肿瘤药物的主流方式，这种方式有望提供高效低毒、高选择性的抗肿瘤药物，肿瘤治疗提供新方向。参考文献：1 Kummar,S.M,Gutierrez et al. 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