（分析化学专业论文）毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子.pdf

上海大学硕士学位论文毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 摘要 毛细管电泳自八十年代初问世以来 迅速发展成为一种重要的分离分析方 法 毛细管电泳具有分离效率高 分析速度快 样品及试剂消耗少和操作成本 低等优点 其应用范围包括无机离子 有机分子及生物大分子等 在食品等领 域有着广阔的应用前景 绪论中回顾了毛细管电泳 c e 的兴起与发展 简单 介绍了c e 的基本原理 分离模式 检测技术 进样技术及其c e 的特点 较详 细的论述了毛细管电泳无机离子的分析以及毛细管电泳技术在食品分析中的应 用 本文采用毛细管电泳法测定了食品试样中的无机离子 如金属离子钙 阴 离子碘酸根和亚硝酸根等 拓展了毛细管电泳技术在食品分析中的应用 为食 品质量控制和食品安全检测提供了新的分析技术 主要研究内容如下 1 毛细管区带电泳法测定奶粉中的钙 钙是人体含量最丰富的矿物元素之一 是人体维持正常生理功能所必需的 一种营养素 本文建立了一种简单 高效 快速测定奶粉中钙含量的方法 采 用毛细管区带电泳一间接紫外检测法 选用3m m o l l 胺三乙酸 8m m o l l 毗啶 缓冲溶液 p h 3 5 分离电压1 2k v 进样1 5s x 0 3p s i 2 5 间接紫外检 测波长2 5 6n m 的条件下 实现了奶粉基质中6 种金属离子 c a 2 m 矿 f e 3 k n a 十 l i 的完全分离 通过对比未消解奶粉与酸消解奶粉中钙含量的分 析结果 认为该方法既可以测定奶粉中游离态的钙离子 又可以测定奶粉中钙 的总含量 并且利用l i 作为内标 提高了定量测定的精密度 该方法对c a 2 的检测限为o 0 3 5m g 几 具有较高的灵敏度 实验回收率也得到满意结果 2 瞬间等速电泳一毛细管区带电泳法测定食盐中的碘酸盐 碘是人体健康所必需的一种微量元素 与人的生长发育和新陈代谢密切相 关 特别是对大脑的发育起着决定性的作用 尤其胎儿容易受碘缺乏的危害 食用加碘盐对碘缺乏病是一种最为有效的防治方法 通常选用稳定性好 成本 低的 0 3 作为食盐的添加剂 本文首次利用瞬间等速电泳一毛细管区带电泳法 测定了食盐中的碘酸盐 方法高效 快速 灵敏 此方法基于瞬间等速电泳在 线预富集的原理提高了方法的灵敏度 利用氯化钠作为背景电解质消除了样品 v 上海大学硕士学位论文毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 基质的干扰 详细讨论了影响富集的缓冲体系 尾随电解质种类和浓度 样品 及尾随电解质导入时间等重要因素 在2 0n u n o l l 十六烷基三甲基氯化铵 c t a c 1 0g l 氯化钠 p h 8 0 作为缓冲溶液 直接紫外检测波长2 1 8n m 电压 8k v 样品和1 5 0 0m m o l l 磷酸盐尾随电解质采用气压0 3p s i 先后导入时 间分别为3 0s 和1 0s 的优化条件下 对样品进行了富集和分离 利用铬酸根作 为内标提高了定量测定的精密度 碘酸根的峰面积和峰高在o 1 0 5m g l 范围 内与碘酸根浓度成线性关系 碘酸根检测限为3 5p g 儿 并且通过与国标氧化 还原滴定法定量结果对比 两种方法无显著性差异 3 毛细管电泳法测定肉制品和矿泉水中的亚硝酸盐 亚硝酸盐是一种毒性较强的物质 广泛存在于各类水体 肉类食品中 摄 取过多量时 会使人中毒 本文采用反向高压电场法 使检测端位于高压的正 极端 用十六烷基三甲基氯化铵 c t a c 改变电渗流方向 对毛细管区带电 泳法和瞬间等速电泳一毛细管区带电泳法测定亚硝酸盐分别进行了研究 两种 方法各有特点 通过对毛细管区带电泳法与瞬间等速电泳一毛细管区带电泳法 的对比 以b r 为内标 利用毛细管区带电泳法分别测定了含量较高的肉罐头中 的亚硝酸盐和瞬间等速电泳一毛细管区带电泳法测定了含量低的矿泉水中的亚 硝酸盐 最后将两种方法分别用于实际样品的测定 实验证明 两种方法都能 使亚硝酸根在5 5m i l l 内实现很好的分离 不受其它离子于扰 定量结果令人满 意 关键词 毛细管电泳 食品 无机离子 钙 碘酸根 亚硝酸根 上海大学硕士学位论文 毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 a b s t r a c t b e c a u s eo ft h ei m h e r e n tf e a t u r e s s u c ha sh i g hs e p a r a t i o ne f f i c i e n c y s h o r t a n a l y s i st i m e e x t r e m e l ys m a l ls a m p l ev o l u m ea n dl o wo p e r a t i o nc o s t c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sh a sb e e ni n c r e a s i n g l yr e c o g n i z e d a sa l li m p o r t a n ta n a l y t i c a l s e p a r a t i o nt e c h n i q u ea n dh a sf l o u r i s h e di nw i d ea r e a ss u c ha si n o r g a n i ci o n s o r g a n i c m o l e c u l e sa n db i o l o g i c a lm a e r o m o l e c u l e s i nt h ei n t r o d u c t i o np a r to f t h i st h e s i s t h e h i s t o r y t h ec u r r e n ts i t u a t i o na n dt h et r e n do fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa r ef i r s t l y r e v i e w e d i nt h ef o l l o w i n g t h ef u n d a m e n t a lt h e o r y t h es e p a r a t i o nm o d e t h e t e c h n i q u eo fd e t e c t i o na n ds a m p l ei n j e c t i o na n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fc e a r eb r i e f l y d e s c r i b e d t h e n t h es t a t u so ft h ea n a l y s i so fi n o r g a n i ci o n sb yc e e s p e c i a l l y a p p l i c a t i o n si nf o o ds a m p l e s i sr e v i e w e d n l i st h e s i sh a sb e e nm a i n l yf o e u s e do n a p p l i c a t i o n so fc ei nd e t e r m i n a t i o no fi n o r g a n i ci o n si nf o o ds a m p l e s s u c ha s c a l c i u m i o d a t ea n dn i t r i t ei o n s a l lt h e s ea r eu s e f u li nb r o a d e n i n gt h ea p p l i c a t i o n so f c et ot h ef o o da n a l y s i s 1 1 1 em a i nb o d yo ft h et h e s i sc o n s i s t so ft h ef o l i o w i n gt h r e e p a r t s 1 d e t e r m i n a t i o no f c a l c i u mi nm i 墩p o w d e r sb yc a p i l l a r yz o u ee l e e t r o p h o r e s i s c a l c i u mi nm i l kp o w d e ri saw e l l k n o w nn u t r i e n to fg r e a tv a l u et oh u m a n h e a l t h as i m p l e s p e e d ya n de f f i c i e n tc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s c z e m e t h o d w a sr e p o r t e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc a l c i u mi nm i l kp o w d e r u n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o n s s i xm e t a li o n s c a 2 m 矿 f e 3 k n a l i c o u l db ec o m p l e t e l y s e p a r a t e d t h eo p t i m u mc z eb u f f e rc o n s i s t e do f3m m o l la m m i o n i u mt r i a c e t i c a c i da n d8m m o i lp y r i d i n ea tp h 3 5 s a m p l ei n t r o d u c t i o ni nt h ec z ew a sm a d e b ya p p l y i n gp r e s s u r eo f 0 3 0p s if o r1 5s v o l t a g eo f1 2k va n dt e m p e r a t u r eo f 2 5 w e r eu s e df o rt h ec z es e p a r 撕o n i n d i r e c tu vd e t e c t i o nw a sc o n d u c t e da t2 5 6m s c o m p a r i n gt h eq u a n t i t a t i v er e s u l t so f c a l c i u md e t e r m i n e dw i t ha c i dd i g e s t e ds a m p l e s a n dw i t h o u td i g e s t e ds a m p l e s i ti n d i c a t e dt h a tb o t hf l e ec a l c i u mi o na n dt o t a l c a l c i u mw e r el i k e l yd e t e r m i n e db yt h ec z ei nm i mp o w d e rs a m p l e s i na d d i t i o n 1 i t h i u mw a se v a l u a t e da st h ei n t e r n a ls t a n d a r dt o i m p r o v ep r e c i s i o no ft h e q u a n t i t a t i v ec z er e s u l t s 1 1 l ed e t e c t i o nl i m i tf o rc a l c i u mw a s0 0 3 5m l a n dt h e r e c o v e r yw a ss a t i s f a c t o r y 2 d e t e r m i n a t i o no fi o d a t ei nt a b l es a l tb yt r a n s i e n ti s o t a e h o p h o r e s i s c a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s i s i o d i n ed e f i c i e n c yi sam a j o rp u b l i ch e a l t hp r o b l e mf o rp o p u l a t i o n s i o d i z e ds a l t i st h e r e f o r ee x p e c t e dt ob ea ni m p o r t a n ts o u r c oo fi o d i n ef o rp e o p l ei nm a n ya r e a so f t h ew o r l d p o t a s s i u mi o d a t e k 1 0 3 i sn o r m a l l yu s e df o rs a l tf o r t i f i c a t i o nd u et oi t s v i i 上海大学硕士学位论文 毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 c h e m i c a ls t a b i l i t ya n dl o w e rc o s t as e n s i t i v e f a s ta n dh i g he f f i c i e n tm e t h o d t r a n s i e n ti s o t a c h o p h o r e s i s c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s t i t p c z e w a sf i r s tt i m e d e v e l o p e df o rd e t e r m i n i n gi o d a t ei nt a b l es a l t t h es e n s i t i v i t yo ft h ep r o p o s e d m e t h o dw a se n h a n c e db yc o u p l i n g 趾o n c a p i l l a r yp r e c o n e e n t r a t i o nt e c h n i q u eu s i n g t h ep r i n c i p l eo f t l t pw i t hc z e t h ei n t e r f e r e n c eo f s a m p l em a t r i xw a so v e r c o m eb y u s i n ge l e c t r o p h o r e t i cb u f f e rc o n t a i n i n gh i g hc o n c e n t r a t i o no fs o d i u mc h l o r i d e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so ft h et i t p c z e s u c ha sc o n c e n t r a t i o no ft e r m i n a t i n g e l e c t r o l y t e e l e c t r o o s m o t i cf l o wm o d i f i e r a n di n j e c t i o nt i m eo ft h et e r m i n a t i n g e l e c t r o l y t ea n ds a m p l e w e r eo p t i m i z e df o rb e s tq u a n t i t a t i v er e s u l t s t h eo p t i m a l t e r m i n a t i n ge l e c t r o l y t ew a s15 0 0m m o l lp h o s p h a t ea n dt h eo p t i m a ls e p a r a t i o n b u f f e rw a s1 0 g l s o d i u mc h l o r i d e q h 8 0 c o n t a i n i n g 2 0m m o l l c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e c t a c t h ew a v e l e n g t ho fu vd e t e c t i o nf o r i o d a t ew a ss e ta t2 1 8n m c a l i b r a t i o ng r a p h sb a s e do np e a l h e i g h ta n dp e a ka r e a s h o w e dg o o dl i n e a r i t y u s eo fc h r o m a t ea st h ei n t e r n a ls t a n d a r ds i g n i f i c a n t l y i m p r o v e dt h ep r e c i s i o no ft h eq u a n t i t a t i v er e s u l t s t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s3 5 峙 l f o ri o d a t e t h eq u a n t i t a t i v er e s u l t so f i o d a t ei nt a b l es a l td e t e r m i n e db yt h et l t p c z e m e t h o dw e r ec o m p a r e d i t l lt h o s eb yt h er e d o xt i t r a t i o n t h e r ew a sn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w om e a n so f t h er e s u l t so b t a i n e du s i n gt h et w om e t h o d s 3 d e t e r m i n a t i o no f n i t r i t ei nm e a ta n dm i n e r a lw a t e rb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s at o x i cs u b s t a n c e n i t r i t ei sw i d e l ye x i s t e di na l lt y p e so fw a t e ra n dm e a t p r o d u c t s t h ec o n s u m p t i o no fh i g h e ra m o u n to fn i t r i t ew i l lc a u s ep o i s o n i n g b a s e d o nt h e c o m p a r i s o n o f c a p i l l a r y z o n ee l e c t r o p h o r e s i s c z e a n dt r a n s i e n t i s o t a c h o p h o r e s i s e a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s t i t p c z e c z e f o rt h e d e t e r m i n a t i o no fh i g h e ra m o u n to fn i t r i t ei nm e a ta n dt i t p c z ef o rt h e d e t e r m i n a t i o no fl o w e ra m o u n to fn i t r i t ei nm i n e r a lw a t e rw e r er e p o r t e dw i t hb ra s t h ei n t e r n a ls t a n d a r d t h ev o l t a g ew a sa p p l i e da st h ec a t h o d ea tt h es a m p l ei n l e ts i d e a n dt h ed i r e c t i o no ft h ee l e c t r o o s m o s i sf l o w e o f w a sr e v e r s e db ya d d i n g e e t y l t d m e t h y l a m m o m u mc h l o r i d e c t a c t ot h e b u f f e r a f t e ro p t i m i z i n gt h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h et w om e t h o d sw e r ea p p l i e dt od e t e r m i n en i t r i t ei nm e a t a n dm i n e r a lw a t e r r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn i t r i t ec a nb ew e l ls e p a r a t e d f r o mo t h e ri o n sw i t h i n5 5m i nb yt h et w om e t h o d sa n dt h eq u a n t i t a t i v er e s u l t sa r e s a t i s f a c t o r y k e y w o r d s c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s f o o d i n o r g a n i ci o n c a l c i u m i o d a t e n i t r i t e v 1 1 1 上海大学硕士学位论文毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 原创性声明 本人声明 所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已发 表或撰写过的研究成果 参与同一工作的其他同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意 签名 壑盘皂 日期 翌2 i g 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留论文及送交论文复印件 允许论文被查阅和借阅 学 校可以公布论文的全部或部分内容 保密的论文在解密后应遵守此规定 签名 划导师签名 避日期 二皇业f 弓 i i 上海大学硕士学位论文毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 第一章绪论 1 1 毛细管电泳研究概况 毛细管电泳 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c e 也称为高效毛细管电泳 h i 曲 p e r f o r m a n e ec a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s h p c e 它是近二十年来发展最快 的分离分析技术之一 是分析科学中继高效液相色谱之后的又一液相分离分析 的重大进展 毛细管电泳将分离柱效提高到上百万理论塔板数 进样量也从色 谱技术的微升水平进入纳升水平 它可以分析从离子到分子 从小分子到生物 大分子的一系列物质 具有高效 快速 样品和试剂用量少 基体效应小 仪 器及操作简便 分析成本低等特点 已经广泛应用于食品 环境监测 药物分 析 生物分析等领域 1 1 1 毛细管电泳的兴起与发展 毛细管电泳法是一种新型的分离分析技术 但是它的历史久远 1 9 6 7 年 瑞典科学家h i e r t e n i 首次提出了毛细管电泳技术 他利用内壁涂有甲基纤维素 内径为3 0 0 岫的玻璃毛细管成功地对金属离子进行了分离检测 并把这种模式 称为毛细管区带电泳 c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s c z e 只是管的内径比现 在的毛细管要粗很多 由于样品过载 未能实现很高的分离柱效 1 9 8 1 年 j o r g e n s o n 和l u c k a c s l 2 l 首次使用内径7 5 岬的石英毛细管和3 0k v 的高电压 获得了高于4 0 万理论塔板数的分离柱效 他们的研究使c z e 取得了突破性进 展 同时奠定了毛细管电泳的理论基础 1 9 8 4 年 t e r a b e 等1 3 发展了基于组分 疏水性差异而实现中性化合物分离的毛细管胶束电动色谱 m i c e l l a r e l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y m e c c 1 9 8 5 年 n j e r t e n 和z h u l 4 1 将两 性电解质引入毛细管电泳中 发展了基于等电点不同而分离的毛细管等电聚焦 电泳 c a p i l l a r y i s o e l e c t r i e f o c u s i n g c i e f 它结合了常规等电聚焦电泳的高分 离能力和现代毛细管电泳的特点 使其成为分离蛋白质的重要方法之一 1 9 8 7 年 c o h e n 和k a r g e r t 5 提出了基于分子量大小筛分机理的毛细管凝胶电泳 上海大学硕士学位论文 毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s c g e 1 9 8 1 年 j o r g e n s o n 和l u e k a e s l 6 1 在1 7 0 脚 内径的毛细管中填充了1 0i n n 的p a r t i s i lo d s 2 在电场作用下成功地分离了9 甲基蒽和芘 获得了3 1 万理论塔板数的柱效 并指出在以电渗流作推动力的 情况下 固定相的填充不规则性对样品区带展宽并不重要 这种技术被称为电 色谱 c a p i l l a r ye l e e t r o c h r o m a t o g r a p h y c e c 电色谱在9 0 年代得到了迅速发 展 是毛细管电泳与色谱法相结合的产物 具有电场力与液压二种驱动力 它 是在毛细管中填充或毛细管壁涂布 键合色谱固定相 依靠电渗流及液压推动 流动相 使中性的和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间分配 系数不同而实现分离的一种电分离模式 兼备毛细管电泳的高分离效率和液相 色谱的选择性 具有很好的发展前景 1 9 9 0 年 瑞士c i b a g e i g y 公司的m a r t z 和w i d r n e r 等r 7 1 首次提出微全分析系统 m i n i a t u r i z e dt o t a lc h e m i c a la n a l y s i s s y s t e m p t a s 的概念和设计 自此微型化 集成化和自动化的芯片毛细管电 泳技术获得了重要发展 1 1 2 毛细管电泳的基本原理 毛细管电泳的基本原理 8 9 1 是根据溶质所带电荷和体积大小的差异 导致在 电场作用下迁移速率的不同而进行电泳分离 其基本仪器结构如图1 1 9 j 毛细管和电极槽首先充有相同组分和浓度的背景电解质 缓冲溶液 样品 从毛细管进样端导入 在毛细管两端加上电压后 荷电溶质便朝与其电荷极性 相反的电极方向移动 若样品组分淌度不同则迁移速度不同 一定时间后各组 分按其淌度大小依次通过检测器被检测出 得到按时间分布的电泳图 电泳用的毛细管通常内径为2 5 1 0 0p m 外径 般为弹性聚酰亚胺外涂层 的熔融石英管 毛细管电阻高 能应用高电场 1 0 0 1 0 0 0 v c m 缩短了分析时 间 而大的表面积 体积比又能有效扩散所产生的热量 避免对流 提高了分离 效率 由于固液接触界面上都将形成双电层 熔硅毛细管在通常 p h 2 5 溶液 中 管内表面的硅羟基 s i o h 会电离成s i f t 而带负电 负电荷表面在溶液中 积聚相反电荷的离子形成双电层 当外加电场时 双电层中的溶剂化的阳离子 2 上海大学硕士学位论文毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 带动毛细管中整体溶液朝阴极迁移 形成电渗流 e e c 拄o o s m o t i ef l o w e o f 组分的流出时间取决于电渗速度和电泳速度的矢量和 一般电渗方向从阳极到 阴极且电渗速度大于电泳速度 因此组分中的阳离子 中性分子 阴离子都能 同时检出 毛细管中e o f 另一重要特征是塞状流 流速在整个横截面上几乎相 等 平流型与高效液相色谱中泵驱动产生的抛物流形不同 它不直接引起组分 区带扩散 这是c e 获得高分离度的重要原因之一 图i i 毛细管电泳仪器基本结构示意图 f i g u r ei is c h e m a t i cd i a g r a mo f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si n s t r u m e n t la h i g hv o l t a g ep o w e rs u p p l y 2c a p i l l a r y 3b u f f e rr e s e r v o i r s 4p te l e c t r o d e s 5ad e t e c t o r 6a c o m p u t e r 1 1 3 毛细管电泳的分离模式 毛细管电泳的分离模式是指采用不同的缓冲溶液或对毛细管壁进行改性之 后 以不同的分离机理对物质进行拆分的方法 正是毛细管电泳有多种多样的 分离模式 才使得其分析对象被拓展到各个领域 在分离过程中 选择正确的 分离模式有利于样品的测定 目前 常见的毛细管电泳分离模式根据其不同的 分离特性可分为以下几种 3 上海大学硕士学位论文毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 1 毛细管区带电泳 c a p i l l a r yz o n ee l e e t r o p h o r e s i s c z e 毛细管区带电泳 1 0 1 1 1 又称毛细管自由电泳 由于操作简单 便于分离条件 优化 是目前c e 中最基本 应用最广泛的的一种模式 在这种模式的分离中 毛细管中仅填充电解质溶液 分离基于溶质因荷质比的差异所引起的淌度的不 同 在直流高压驱动下溶质以不同的速率在分离的区带内进行迁移而被分离 由于e o f 的存在 正负离子都可用c z e 分离 而中性溶质本身在电场中不移 动 随e o f 一起流出毛细管 c z e 的应用范围很宽 包括氨基酸 肽和蛋白质 有机酸 维生素及无机离子等 2 毛细管胶束电动色谱 m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y m e k c 或m e c c 毛细管胶束电动色谱法 1 2 是在c e 所用的缓冲溶液中加入离子表面活性 剂 当表面活性剂的浓度超过了临界胶束浓度后 就形成有一疏水内核 外部 带电的胶束 溶质根据其在胶束相和水相的分配系数的不同而进行分离 溶质 在水相和胶束相 准固定相 之间产生分配 中性粒子因其本身疏水性不同 在两相中分配存在差异而得以分离 m e k c 是唯一的一种既适宜分离带电组分 又能分离中性溶质的模式 m e k c 拓宽了c e 的应用范围 主要用于中性化合 物 手性对映体和药物分子等的分析 常用的表面活性剂有阴离子型的十二烷 基硫酸钠 s d s 和阳离子型的十六烷基三甲基溴化铵 c 1 a b 3 毛细管凝胶电泳 c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s c g e 毛细管凝胶电泳 1 3 l 是将凝胶固定或转移到毛细管中作支持物 凝胶起 分 子筛 的作用 溶质根据其体积大小不同而分离 凝胶能减小溶质的扩散 柱 效按理论塔板数计可达几百万 c g e 柱效高 但高度重现凝胶柱制备较困难 寿命较短 常用于蛋白质 寡聚核苷酸 核糖核酸r n a d n a 片段分离和测 序及聚合酶链反应 p c r 产物分析 c g e 的一种变形是无胶筛分 1 5 以高聚 物溶液作分离介质 高聚物溶液中包含动态网孔 对溶质能起到按大小的筛分 作用 无胶筛分己成功用于核酸的分离 4 毛细管等电聚焦 c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g c l e f 毛细管等电聚焦 l6 是基于物质的等电点不同而进行的分离 将普通等电聚 4 上海大学硕士学位论文 毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 焦电泳转移到毛细管中进行 通过管壁涂层使电渗流减小到最小 以防止蛋白 质吸附及破坏稳定的聚焦区带 在高压作用下 毛细管内部建立p h 梯度 蛋 白质在毛细管中向各自的等电点聚焦 形成明显的区带 再通过检测器分别加 以确认 等电聚焦分离有极高的分辨率 通常可以分离等电点差异小于o 0 1p h 单位的两种蛋白质 经常用于测定蛋白质的等电点和用其它方法难于分离的蛋 白质等 5 毛细管等速电泳 c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s c i t p 毛细管等速电泳 1 7 采用两种不同的缓冲体系 一种是前导电解质 先填充 于毛细管柱中 另一种称为尾随电解质 置于一端的电泳槽中 前者的淌度高 于具有相同电荷的任何样品组分 后者则低于任何样品组分 当毛细管两端加 上电压后 样品组分按其淌度大小依次连接迁移 得到了互相连接而又不重叠 的区带 毛细管等速电泳是一种较早出现的分离模式 可用较大内径的毛细管 在微制备中很有用处 可作为柱前浓缩方法用于富集样品 以解决c e 浓度灵 敏度不如h p l c 的问题 6 毛细管色谱 c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y c e c 毛细管色谱 嘲是将h p l c 中众多的固定相微粒填充到毛细管中 或涂渍到 毛细管壁 以样品在固定相与流动相之间的分配为分离机制 以电渗流或辅以 液压的电渗流为流动相驱动力的色谱过程 c e c 的固定可通过在毛细管中填充 高效液相色谱填料或毛细管壁涂布 键合色谱固定相得到 毛细管色谱是毛细 管电泳与色谱法相结合的产物 兼备毛细管电泳的高分离效率和液相色谱的选 择性 具有很好的发展前景 c e c 在免疫学研究 药物分析中已经取得了很好 的应用 但c e c 用毛细管柱制备难度高和操作条件苛刻是其不便之处 以上所述的几种模式各有利弊 用途不一 以c z e 和m e k c 两种模式最 便利常用 1 1 4 毛细管电泳的检测技术 c e 技术的广泛应用与深入发展所面临的主要挑战是高灵敏度和多模式检 测器的发展 为了适应c e 微体积柱上检测的要求 人们在检测方法和检测器 上海大学硕士学位论文 毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 方面进行了大量和卓有成效的研究1 1 蛇1 l 发展了多种类型的检测器 根据c e 检测器的工作原理 分为紫外可见吸收法 荧光法 激光光热法 电化学测定 法 质谱法 拉曼光谱法和折射指数法等 市售仪器主要采用前两种方法 对 于无机离子的测定 目前报道最多的是采用紫外可见吸收光谱法1 2 2 2 4 表1 1 列出了各种c e 检测器的一般性能及简要特点 表1 1c e 检测器的检测限及其特点 t 曲1 e1 1t h ed e t e c t i o nl i m i ta n df e a t u r e so f c ed e t e c t o r 检测器检测限 m o l l 特点 1 1 5 毛细管电泳的进样技术 毛细管进样量极微 仅n l 级 这给毛细管电泳的进样技术带来了极大的困 难 2 5 l 不仅要求进样准确性高 重现性好 而且所进的样品组成要与原样品组 分有一致性 避免样品失真 为了实现c e 高的分离效率 必须克服进样造成 的区带展宽效应 且应做到使进样系统操作简便 在保证检测器具有相当灵敏 度的前提下 应尽可能减少进样体积 以提高分离效率 目前进样技术主要有 电动力进样 流体动力进样 扩散进样 进样阀进样 电分流进样等 1 0 1 2 1 6 2 5 1 6 上海大学硕士学位论文毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 电动力进样和流体动力进样是最常用的两种进样方法 电动力进样量受较多因 素的影响 如进样时问 进样电压 样品溶液组成 组分的性质以及环境温度 等 因此电动力进样量的重现性还不尽如人意 但由于它操作简便 可以利用 堆积效应富集样品 而且可用于高粘度样品及毛细管凝胶电泳的进样 所以电 动力进样仍是c e 常用的进样方式 与电动力进样相比 流体动力迸样量基本 不受溶液组成和组分性质的影响 而由易受控制的压差和进样时间决定 因而 流体动力进样的重现性较好 是目前c e 中最常见的进样方法 1 1 6 毛细管电泳的特点 毛细管电泳是经典电泳技术和现代微柱技术的结合产物 与色谱技术相比 较 c e 分离速度快 效率高 所需样品量少 而与普通的平板电泳相比 因为 用高电场作驱动力 分离速度快得多 且几乎可以与各种检测器 如m s 联 用 总之 c e 有其独特的优点 2 6 2 8 可概括为 1 高效 理论塔板数达到1 0 s 1 0 6 m c g e 效率可达1 0 7 m 以上 尤其在分 离生物大分子时分离效率很高 2 快速 大多数分离能在1 0m i n 内完成 有的甚至可在几十秒内完成 3 易实现高自动化 c e 是目前自动化程度最高的分离分析方法之一 4 样品用量少 进样体积仅需几个n l 每次样品分析所消耗运行缓冲溶液 在1 5 0 n l 之间 5 测定成本低 试剂用量少 毛细管价格便宜 维持费用极低 6 灵敏度高 常用的紫外检测器的检测限为1 0 4 1 0 弓m o l l 激光诱导荧光 检测器 l i f 可达1 0 1 2 1 0 母m o l l 7 测定模式多 可根据不同需要选择不同的分离模式 且只需一台仪器 8 适用范围广 从无机离子到d n a 片段 都可用于分离 尤其多用于分离 生物多聚体如肽类 蛋白质 核苷酸 金属离子 无机离子及药物 9 样品的预处理要求较低 通常只需配制成水溶液 1 0 环境友好 通常使用水溶液 对人和环境无害 不足之处 制备能力差 光路太短 凝胶 色谱填充柱需要专门的灌制技 7 上海大学硕士学位论文 毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 术 吸附作用大 导致蛋白质等的分离效率下降或无峰 吸附引起电渗变化 进而影响分离重现性等 目前尚难以有效准确控制电渗 同时 c e 与g c 或h p l c 等色谱方法相比 2 9 3 0 l 在定量分析方面仍有一些 不足 主要表现在c e 的检测限偏高 同时c e 线性范围的上限偏低 在进行较 低浓度或较高浓度待测成分的定量分析时局限性较大 由于c e 的色谱峰太锐 对峰面积的积分往往有很大的误差 故c e 的测定误差较g c 及h p l c 大 c e 的进样量太少 也影响准确的定量 此外 在c e 中影响待测组分和载体电解 质迁移率的因素太多 所以c e 也存在标样的迁移时间漂移较大等问题 1 2 毛细管电泳无机离子分析 1 2 1 无机离子检测方法 利用毛细管电泳法分析无机离子 3 3 1 检测通常分为间接检测法和直接检 测法 1 2 1 1 间接检测法 毛细管电泳间接检测法中 检测信号不是来自样品本身 而是来自背景电 解质离子 缓冲溶液或加入其中的添加剂离子 其间接检测法原理 3 3 蚓主要有 两种 一种是样品溶质在毛细管中迁移时 为了保持局部区域的电荷平衡 要 求置换同电荷离子 即在区带内产生电荷的物理置换 使背景电解质离子浓度 降低 从而产生背景信号减弱 通过相对于稳态时背景信号的减弱 负峰 进 行样品溶质的间接测定 另一种是样品溶质经毛细管电泳分离后进入反应区 随即与探针离子发生不同程度的络合反应 使游离探针离子浓度降低 相应的 信号减弱 通过相对于稳态时背景信号的减弱 负峰 进行样品溶质的间接测 定 在间接紫外吸收法中 所选择的添加剂在检测波长处具有强的光吸收 间 接紫外检测的灵敏度主要取决于电解质中背景离子的摩尔吸光系数 同时还与 背景离子 被测离子的电荷和有效淌度有关 间接荧光法中背景含有强荧光物 质 而且其淌度应和被检测物质相近 以获得较对称的峰形 8 上海大学硕士学位论文毛细管电泳法测定食品试样中的无机离子 对于没有吸收 没有荧光和电化学惰性的分析物的毛细管电泳分析 间接 检测是一个更为普遍的检测方法 间接紫外吸收检测己被用于大范围的无机离 子分析口5 4 7 其检测限在1 0 6 1 0 4 m o f l 的范围内 c o u s i n s 3 8 1 采用间接紫外检 测研究了衡量分析物与紫外吸收载体离子发生取代的转移率 当载体离子的淌 度高于待测物离子的淌度时 转移率较高 s h a m s i 3 9 利用萘磺酸盐作添加剂检 测无机阴离子的检测限为1 6 0 g l b r e a d m o r e 4 0 1 采用间接紫外检测有机和无 机阴离子 对2 4 种阴离子在7 分钟内进行了分离检测 激光诱导荧光检测是c e 检测模式中灵敏度最高的一种 可是 本身有荧 光特性的样品很少 大多数物质的量子效率很低或不发荧光 需要柱前或柱后 衍生 而间接激光诱导荧光检测只用一种荧光试剂 样品不经衍生 通过流动 相中背景荧光强度变化测定各种c e 分离组分 是一种高灵敏和通用性强的c e