（生物化学与分子生物学专业论文）镉致hek293细胞离体线粒体损伤的研究.pdf

镉致h e k 2 9 3 细胞离体线粒体损伤的研究 摘要 镉可以诱导h e k2 9 3 细胞发生凋亡并且其凋亡依赖于线粒体途径。研究镉 诱导的线粒体损伤对于镉的分子毒理学机制的阐明和镉所致的损伤与致癌机理 的研究具有重要意义。本文对镉诱导的i - i e k2 9 3 细胞离体线粒体损伤做了如下 研究工作： l 镉对h e k2 9 3 细胞离体线粒体膜的损伤 建立镉致h e k2 9 3 细胞离体线粒体膜损伤模型，采用分光光度法检测c d c l 2 诱导的线粒体渗透性转变孔的开放情况；通过透射电镜鉴定c d c l 2 诱导的线粒体 形态的改变；采用荧光分光光度计检测线粒体膜电位的变化。结果显示：c d c l 2 能够诱导h e k 2 9 3 细胞离体线粒体的功能损伤，镉严重损伤了线粒体的膜系统， 导致线粒体膜电位的急剧下降，c d c l 2 能诱导线粒体渗透性转变孔的开放，并且 这种开放能够被环胞素( c s a ) 所抑制；电镜结果显示c d c l 2 诱导下线粒体肿 胀变形。 2 镉致h e k2 9 3 细胞离体线粒体活性氧及抗氧化系统的变化 本实验利用荧光探针d c f h d a 检测了线粒体内r o s 含量的变化；测定 了线粒体内两种主要的抗氧化酶s o d 和g s h p x 的活力；同时测定了线粒体内 m d a 的含量变化。结果表明：镉能够引起r o s 含量的显著增加；s o d 和 g s h p x 酶活力在镉的作用下降低明显。说明c d c h 诱导的离体线粒体氧化损伤， 氧化应激可能在镉引发的细胞凋亡过程中起重要作用。 3 镉对i i e k2 9 3 细胞离体线粒体酶活力的影响 检测c d c h 对h e k2 9 3 细胞离体线粒体酶活力的影响，主要对与细胞呼吸 相关的a t p a s e 和l d h 进行了测定。结果表明：c d c l 2 能诱发h e k2 9 3 细胞 离体线粒体内多种酶活力的明显下降，并且随着c d c l 2 浓度的增加， n a + k + a t p 酶、c a 2 + m g + - a t p 酶和l d h 活力都有的显著降低，说明镉可能 破坏了线粒体的呼吸系统，对细胞的能量代谢造成阻碍。 关键词：镉线粒体线粒体渗透性转变孔线粒体膜电位活性氧抗氧化酶 镉致h e k 2 9 3 细胞离体线粒体损伤的研究 a b s t r a c t c a d m i u mc a ni n d u c ea p o p t o s i si nm a n yk i n d so fc e l l s s t u d y i n gt h ed a m a g eo f i s o l a t e dm i t o c h o n d r i ai n d u c e db yc a d m i u mi sn e c e s s a r yf o ru st oc u r el o t so f d i s e a s e sc a u s e db yc a d m i u m a n di ti sa l s ov e r yi m p o r t a n tf o rt h em o l e c u l a r t o x i c o l o g i c a ls t u d yo fc a d m i u m t h i sp a p e rs t u d i e ds o m ea s p e c t so fc a d m i u m - i n d u c e dd a m a g eo fi s o l a t e dm i t o c h o n d r i af r o mh e k 2 9 3c e l l s ： 1t h ed a m a g eo fm i t o c h o n d r i am e m b r a n ei n d u c e db yc a d m i u m t h eo p e n i n go ft h em i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ( m p t p ) w a st e s t e d b ys p e c t r o p h o t o m e t e r m o r p h o l o g i c a lc h a n g e so fm i t o c h o n d r i aw e r eo b s e r v e du n d e r t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ea n dm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ( m m p ) w a s m o n i t o r e db ys p e c t r o f l u o r i m e t e rw i t hf l u o r e s c e n c ed y er h - 1 2 3 t h er e s u l t ss h o w e d t h a tm p t po fe x p o s e dg r o u p sd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h a to ft h ec o n t r o lg r o u p ，a n d i tc a nb ei n h i b i t e db yc sa m i t o c h o n d r i ai n c u b a t e db yc d c l 2w e r ef o u n ds w e l lu n d e r t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e 2t h ec h a n g eo fr o sa n da n t i o x i d a s e si n d u c e db yc a d m i u m t h ec o n t e n t so fr o sw e r ed e t e c t e dw i t hd c f h d a s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，g i u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ( g s h p x ) a n dt h ec o n t e n t so fm a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) w h i c hr e l a t e dw i t ho x i d a t i v es t r e s sw e r ea l s om o n i t o r e d t a k e nt o g e t h e r , o u rr e s u l t s s h o w e dt h a tt h e d a m a g e o fm i t o c h o n d r i ai n d u c e db yc d c hm a yi n v o l v e m i t o c h o n d r i a ld i s r u p t i o ni n c l u d i n gb o t ht h ei n c r e a s i n go ft h er o sc o n t e n t sa n dt h e d e c r e a s eo fa c t i v i t i e so fa n f i o x i d a s e s a n dt h ec o n t e n t so fm d ao fe x p o s e dg r o u p s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t ht h a to fc o n t r o lg r o u p 3t h ei m p a c to fc a d m i u mo ns o m ee n z y m e si ni s o l a t e dm i t o c h o n d r i a t h ea c t i v i t i e so fa t p a s ea n dl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( l d h ) w e r em e a s u r e db y s p e c t r o p h o t o m e t e nw ef o u n dt h a ta c t i v i t i e so fn a + k + - a t p a s e ，c a 2 + _ m 9 2 + - a t p a s e a n dl d hw e r ed e c r e a s e d 谢t ht h ei n c r e a s e dc o n c e n t r a t i o no fc d c h ；i ts u g g e s t s t h a tc d c l 2m a yl e a dt oe n e r g ym e t a b o l i s mo b s t a c l e si nh e k 2 9 3c e l l sd a m a g e k e yw o r d ：c a d m i u mm i t o c h o n d r i a m p t pm m pr o s a n f i o x i d a s e s 镉致h e k 2 9 3 细胞离体线粒体损伤的研究 ) c 日盯 1 日 镉( c a d m i u m ， d ) 是环境和食物链中最常见且不易消除的重金属污染物。 镉在生物机体中有蓄c 积作用，它在体内的生物半衰期长达1 0 一- 3 5 年，被美国毒 理管理委员会( a t s d r ) 列为第六位危及人体健康的有毒物质，能对人体肾、睾 丸、肺、肝、脑、骨等多种人体器官和组织造成损伤，具有致畸、致突变、致癌 作用，镉接触与生殖损害、肿瘤和衰老等有一定的关系。随着现代工业的迅猛发 展，镉污染的问题已日益严重化，因此镉显然存在着对人类潜在的危害。但迄今 为止，对慢性镉中毒尚无有效的疗法。许多动物实验和人群流行病学研究表明， 长期低剂量接触镉可导致以近曲小管损害为主要特征的肾脏损害。有关镉致肾损 伤的机理，自体内、体外实验研究发现镉引起肾细胞凋亡是肾毒性的分子机制之 二。镉致肾细胞凋亡的研究成为镉分子毒理学研究的一个热点，但凋亡机制尚未 阐明。 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 是一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式，是机体生长 发育，细胞分化和病理状态中细胞的自主性死亡过程，是一种自发性的、由行将 死亡的细胞内部特定的基因所操纵的过程，因此又被称为程控性细胞死亡 ( p r o g r a m m e dc e ud e a t h ) 。凋亡对于机体的生长发育和机体体内稳态维持有极其重 要的作用，凋亡的失控可导致多种疾病，包括癌症和自身免疫功能紊乱。凋亡常 伴有细胞皱缩，细胞质、细胞核和染色体浓缩，细胞膜出泡，蛋白降解，d n a 断裂等现象，最终出现凋亡小体并进入继发性坏死阶段。 随着对细胞凋亡研究的不断深入，发现在多种形式的哺乳动物细胞凋亡中， 线粒体起着中心调控作用，在某种意义上，线粒体可以决定细胞的生死存亡。线 粒体具有氧化磷酸化、传递电子、贮存c a 2 + 、能量代谢、抗活性氧化等重要生 理作用，它为细胞的各种生命活动提供基础能量。细胞凋亡过程中许多重要事件 的发生都与线粒体密切相关，包括死亡促进因子的释放如细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ，c y tc ) 和凋亡诱导因子( a p o p t o s i s - i n d u c i n gf a c t o r ，a i f ) 等、电 子传递链的改变、线粒体膜电位( a w m ) 的丧失、细胞内氧化还原状态的改变、 b e l - 2 家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等。不同信号的传导最终都集中到线粒体 上来启动或抑制这些事件及其效应的产生。线粒体的结构和功能的改变，能加速 r i 镉致h e k 2 9 3 细胞离体线粒体损伤的研究 核凋亡特征的出现，并是限制细胞凋亡进程中关键的一步。 研究镉诱导的肾细胞的凋亡及凋亡机制对于镉的分子毒理学机制的阐明和 镉所致的损伤与致癌机理的研究具有重要意义，对治疗由镉引起的各种疾病如致 肿瘤和致衰老有重要作用。本文对镉诱导离体线粒体损伤作了如下研究工作： 1 镉对h e k2 9 3 细胞离体线粒体膜的损伤 培养h e k2 9 3 细胞，提取线粒体并作分组处理。采用分光光度法检测c d c l 2 诱导的线粒体渗透性转变孔的开放情况；通过透射电镜鉴定c d c l 2 诱导的线粒体 形态的改变。利用荧光探针r h1 2 3 通过荧光分光光度计检测了线粒体膜电位的 变化。结果显示：c d c l 2 能够诱导h e k2 9 3 细胞离体线粒体的功能损伤，镉严 重损伤了线粒体的膜系统，导致线粒体膜电位的急剧下降，不同浓度c d c l 2 能 不同程度地诱导线粒体渗透性转变孔的开放，且呈一定的浓度效应依存关系， 并且这种开放能够被c s a 所抑制；电镜结果表明，c d c l 2 诱导下线粒体肿胀变 形、基质变浅、嵴变短变少甚至消失，高浓度的c d c l 2 可以引起部分线粒体肿 胀破裂。 2 镉致h e k2 9 3 细胞离体线粒体活性氧及抗氧化系统的变化 培养h e k2 9 3 细胞，提取线粒体并作分组处理。利用荧光探针d c f h d a 检测了r o s 含量的变化。检测了镉诱导下与氧化应激相关的s o d 和g s h p x 的活力及m d a 的含量变化。结果表明：c d 0 2 能够诱导r o s 含量的显著增加。 同时两种主要的抗氧化酶s o d 和g s h p x 活力也有显著降低，说明氧化应激 在c d c l 2 诱导的离体线粒体损伤中起重要作用。 3 镉对h e k2 9 3 细胞离体线粒体酶活力的影响 以分光光度法检测c d c l 2 对h e k2 9 3 细胞离体线粒体酶活力的影响，主要 对与细胞呼吸相关的a t p a s e 和l d h 进行了测定，结果表明：c d c h 能诱发 h e k2 9 3 细胞离体线粒体内多种酶活力的明显下降，并且随着c d c l 2 浓度的增 加，各种酶活力也显著降低。说明镉可能破坏了线粒体的呼吸系统。 i v 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新 的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 第一部分文献综述 第一部分文献综述 第一章线粒体渗透性转变孔与细胞凋亡的关系研究 第一章线粒体渗透性转变孔 与细胞凋亡的关系研究 线粒体是细胞内主要的a t p 生产中心，在人的衰老、癌症的细胞凋亡、信 号转导过程中起着非常重要的作用【1 1 。研究发现，线粒体内也包含一些与细胞凋 亡有密切关系的物质，如细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ，c y tc ) 、凋亡诱导因子 ( a p o p t o s i s - i n d u c i n gf a c t o r , a n d 、c a 寸和活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 等。在凋亡信号的刺激下，线粒体膜通透性增加，由此产生一系列关键性变化， 包括c y tc 的释放、线粒体跨膜电位( 甲m ) 的下降、细胞内氧化还原状的改 变、b c l 基因家族成员的介入等。不同信号的转导最终集中到线粒体上激活或抑 制这些事件的发生，再经相应的信号传导通路调控凋亡团。因此，线粒体在细胞 凋亡的发生中起着重要作用，弄清线粒体在细胞凋亡中的作用机制，对于研究细 胞凋亡的调控机制具有重要的理论意义，同时对于开发药物来治疗癌症、老年痴 呆症也具有广阔的应用价值和开发前景( 如最近开发的一些抗肿瘤新药若丹明、 亚砷酸盐、白桦脂酸等均能直接作用于线粒体诱导凋亡) ，另外也是克服肿瘤治 疗过程中细胞凋亡耐受的一种新策略。因此，详细研究线粒体渗透性转变孔道和 它的调控机制很重要。 在细胞凋亡时，线粒体发生一系列与细胞凋亡密切相关的变化，包括形态和 功能的转变，其中以线粒体膜通透性的转变( p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n ，p t ) 尤为重 要b o y a 等【3 】研究发现p t 是许多凋亡通路的关键步骤。z a m z a m i 也证实p t 是细胞凋亡早期的决定性变化。p t 可导致线粒体电子传递链与氧化磷酸化解偶 联、a t p 合成下降、线粒体内膜电位丧失、c a 外流、还原性谷胱甘肽和n a d p h 减少、细胞内活性氧增多、a i f 和c 吼c 释放，从而启动细胞凋亡程序，激活 细胞内核酸内切酶、蛋白酶，发生细胞凋亡。目前研究认为，线粒体渗透性转变 孔( m i t o c h o n d r i ap e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ，m v t v ) 的开放是引起细胞凋亡发生 的直接原因。线粒体膜通透性转换与m p t p 开放有关，m p t p 开放可引起一系 列与细胞凋亡相关的事件发生，促进m p t p 开放的物质( 苍术苷、二酰胺) 可 诱导细胞凋亡，而抑制m p t p 开放的物质( 米酵菌酸、含二巯基的多肽) 可阻 抑凋亡。被称为细胞生死开关的m p t p ，已引起医学界的广泛关注，有望成为调 第一章线粒体渗透性转变孔与细胞凋亡的关系研究 控凋亡的药物靶点。 l 线粒体通透性转换孔( m p t p ) 的结构及生理功能 1 1 线粒体通透性转换孔( m p t p ) 的结构 线粒体通透性转换孔( m i t o c h o n d r i o np e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ，m p t p ) 被 称为细胞生死开关的m p t p ，是位于线粒体内外膜之间由多个蛋白质组成的复合 通道，又称为线粒体大通道，其确切组成目前尚不清楚。z a m z a m i 等【4 】报道该复 合体至少由胞质的己糖激酶0 a e x o k i n a s e 1 ) 、外膜的外周苯二氮卓受体( p e r i l 口i h e r d b e n z o d i a z e p i n er e c e p t o r ) 、电压依赖性阴离子通道( v o l t a g e - d e p e n d e n ta n i o nc h a n n e l ， v d a c ) 、肌酸激酶、内膜的腺苷酸转位子( a d e n i n en u c l e o t i d et r a n s l o c a t o r , a m ) 及 基质的亲环蛋白d ( c y c l o p h i l i nd ) 组成。但目前公认的观点是，v d a c 与a n t 是m p t p 的必要和主要组成部分。m p t p 的开放会导致线粒体膜通透性的转 变，线粒体膜的通透化正由于其与细胞凋亡的密切关系以及在细胞保护中的重要 地位而越来越受到研究者的重视。 1 1 1 电压依赖的阴离子通道( v d a c ) v d a c 是位于线粒体外膜上的一种含量丰富的蛋白质，分子量为3 3k d ， 能在脂质双分子层中形成一个大的电压门控通道，主要作用在于线粒体内外的物 质运输【5 1 。v d a c 依靠线粒体膜电位水平表现两种导电性，在低电位时，估计直 径为2 5 3 0n m ，而在高电位时为1 8i l m 。一个v d a c 开放时每秒可通 过2 x 1 0 6 个a t p 。通道关闭时，v d a c 的导电性减少5 0 ，但单价离子仍可 通过，a t p 的流动则完全被阻断【6 1 。s h i m i m 等嘲发现b a x 和b a k 能加速 v d a c 的开放，b c l x l 和v d a c 靠得很近，与v i ) a c 连接后使v d a c 关闭。 缺乏v d a c 的线粒体不发生b a x 6 b a k 诱导的线粒体跨膜电位丧失和c y tc 释放，提示b c l 2 家族蛋白和v d a c 结合在细胞凋亡发生中参与调节线粒体跨 膜电位和c y tc 的释放。在随后的研究中发现，具有b e l 2 家族蛋白n 端同 源性区域p , r - ! 4 的b c l x l 能抑制v d a c 的活性，b e l 2 和b e l x l 的b h 4 寡 肽也能抑制含b a x 的脂质体上v d a c 的活性和分离的线粒体中跨膜电位的丧 失r 7 1 。 2 第一章线粒体渗透性转变孔与细胞凋亡的关系研究 1 1 2 腺苷酸转位酶( a n t ) a n t 是一个位于线粒体内膜的跨膜蛋白，它的底物为a d p 、a t p 、d a d p 瞵j 。 a n t 被可转运的底物占据时，将在两种构型间转换，一种构型是a n t 与 a d p a t p 的结合位置在线粒体内膜的基质侧，即膜状态( m - s t a t e ) ，此构型使 m p t p 抑制；另一种则是a n t 与a d p a t p 的结合位置在线粒体内膜的胞浆 侧，即胞浆状态( c s t a t e ) ，此构型使m p t p 激活。有研究显示胞浆状态构型对 于m p t p 的开放是必须的【9 】。研究还发现，a n t 的基因产物可以导致凋亡的所 有特征，如线粒体跨膜电位的消失、c y tc 的释放和天冬半胱氨酸蛋白酶家族 ( c a s p a s e ) 的激活。有两种点突变的a n t 虽然失去了其已知的转运a d p 和 a t p 的活性，但它们的n 端仍能诱导凋亡，表明a n t 的致凋亡潜力是不依 赖于其对a d p 和a t p 的转运活性，其自杀效应是通过m p t p 上蛋白之间的 相互作用来介导的【l o 】。 1 2 线粒体通透性转换孔( m p t p ) 的生理功能 生理条件下，m p t p 直径约为0 2 0 3 m ，m p t p 处于可逆的低水平开 放状态，仅允许分子质量低于3 0 0 的物质通过，线粒体跨膜电位可逆性降低， 其功能是转导电信号和钙信号，起着调节线粒体和胞浆之间物质流动的作用。但 病理条件下，c a 2 + 从胞质内质网释放使线粒体超载时，m p t p 进入不可逆的高 水平开放状态，分子质量小于1 5x 1 0 3 的物质能通过线粒体内膜。这种信号的 转导过程是不可逆的，且与m p t p 上钙结合位点的饱和度高度相关，其开放状 态决定着线粒体功能的发挥。凋亡过程中m p t p 的结构变化还没有定论，有些 研究认为其核心结构是内膜的a n t 以及与其相连的亲环蛋白d ，尤其是在钙 超载、过氧化及腺嘌呤核苷酸耗竭时【l l 】。也有研究认为，b c l - 2 家族能够连接 a n t 和v d a c ，从而激活或抑制m p t p ，即外膜的v d a c 起始动作用【1 2 1 。 m p t p 的一些性质已被确认【1 1 】：( 1 ) m p t p 开放可引起线粒体呼吸链解链，氧 化磷酸化消失，产生大量活性氧，引起能量传递中断；( 2 ) m p t p 开放使线粒体 基质和胞质内的离子得以平衡流动，使原来存在的跨膜电位下降；( 3 ) m p t p 开 放造成线粒体基质呈高渗状态而肿胀，外膜破裂。这些效应使细胞a t p 水平下 降、胞质c a ，水平上升、心及c y tc 释放、c a s p a s e 3 激活，最终导致细胞 3 第一章线粒体渗透性转变孔与细胞凋亡的关系研究 死亡。线粒体基质肿胀也并不出现在所有凋亡细胞中，但这促使人们对线粒体外 膜通透性的其他调节机制进行研究。 2 线粒体通透性转换孔( m p t p ) 的调控 m p t p 具有感受器的功能，g s h 、n a d h 、n a d p h 、a t p 、a d p 、二价阳 离子的浓度、线粒体基质的p h 值，这些参数的改变均能引起m p t p 的开放高 浓度c a 2 + 、低浓度a t ) 、氧化应激、游离脂肪酸及电子传递链抑制剂均能诱导 m p t p 的开放。而米酵菌酸、环胞菌素a 、含二巯基的多肽则抑制m p t p 开放， 阻抑凋亡【1 3 1 。其中，c a 2 + 和活性氧r o s 的调节尤为重要。 2 1c a 2 + 与m p t p 的调控 胞浆内c a = 冲通过线粒体膜上的载体和钠钙泵的钠钙交换而进入线粒体。通 过这两个转运系统和钠氢离子泵，在呼吸链释放的氢离子驱动下，介导缓慢、 连续的钙循环使c a 2 + 进入线粒体。 近年研究发现，细胞质内c a p 浓度的增加或c a 稳态失衡与细胞凋亡密 切相关。v d a c 的表面存在c a 2 + 结合位点，c a 通过结合m p t p 上的金属结 合位点，是m p t p 开放的重要因素【1 4 1 。正常时线粒体内c a 2 + 浓度保持在o 2 1 0 9 m o l l 。用e d t a 与线粒体内c a 2 + 螯合后，开放的m p t p 迅速关闭( 小于 5 0m s ) 。当线粒体内游离c a 达到一定浓度后，m p t p 重新开放，从而显示 m p t p 开放是由线粒体内游离c a p 浓度所决定【1 5 1 。研究表明，当c a 2 + 浓度低 于0 2 9 m o l l 时，m p t p 失活；而浓度高于1 0 9 m o l l 时，则诱导m p t p 开 放。在缺血缺氧或氧化应激时，胞浆内c 矗2 + 缓慢i 逐渐的增加，并顺着电化学 梯度通过转运系统流入线粒体内，造成线粒体内c a 2 + 超载，引起m p t p 开放。 研究还发现在缺乏外源性腺苷酸或存在高磷酸、过氧化物时，线粒体c d 2 + 超载 总是引起m p t p 的开放。因此m p t p 开放是c a ，诱导细胞死亡的重要途径。 2 2 氧化应激与m p t p 的调控 活性氧r o s 是m p t p 又一重要调节因素。k a r b o w s k i 1 6 1 、t a k e y a m a 1 7 】等 报导氧化应激引起线粒体膜通透性改变，m p t p 开放，诱发凋亡。在病理条件下， 4 第一章线粒体渗透性转变孔与细胞凋亡的关系研究 超氧阴离子来源有：( 1 ) 黄嘌呤氧化酶的催化反应；( 2 ) 中性粒细胞的作用。 0 2 一在超氧化物歧化酶作用下形成h 2 0 2 。在c a p 存在下，t - 丁基过氧化氢 ( f - b u t y l h y d r o p e r o x i d e ，z - b h p ) 等过氧化物及磷酸等可以通过谷胱甘肽过氧化物 酶、谷胱甘肽还原酶和嘧啶核苷转氢酶的连续作用导致g s h 和嘧啶核苷的氧化 而诱导m p t p 开放；b e m a r d i 发现氧化应激诱导的m p t p 开放是通过氧化 m p t p 上的硫醇而触发的；亚砷酸盐具有氧化硫醇的作用，它也能通过这一途径 诱导m p t p 开放【1 5 】。因此孔道结构中的s s 和s - a s s 结构导致m p t p 开 放，而( - s h - ) 和s h ，s ( n e m ) 则使m p t p 关闭。由于正常条件下g s h 是 维持通道的二巯基残端处于还原状态的主要物质。因此线粒体内谷胱甘肽的高度 还原状态是m p t p 维持在关闭状态的重要因素。而g s h 的氧化作用是诱导 m p t p 开放的关键。h a w o r t h 和h u n t e r 发现a n t 含有硫醇结构。因此过氧化 物等可能通过作用a n t 从而诱导m p t p 开放。由此可以看出氧化应激和c a 2 + 是m p t p 开放的两个必要条件。 3 线粒体通透性转换孔( m p t p ) 与线粒体内的凋亡因子 3 1 m p t p 与线粒体跨膜电位( a v m ) 线粒体a y m 的丧失是凋亡效应阶段早期一个不可逆性特征，被许多学者称 为凋亡的特异性标志。z o r a t t i d 1 趵等的研究表明，线粒体岫下降由m p t p 开 放引起，阻止m p t p 开放可阻止、i ，m 下降，从而防止凋亡的发生。不过，线 粒体的跨膜电位下降不是可检测到的最早凋亡变化【1 9 1 。有关凋亡细胞中与、l ，m 的关系也有不同报道。 m p t p 是线粒体内外信息交流的中心枢纽，功能的发挥依赖于其开放状态。 生理情况下，m p t p 周期性开放，防止外室正离子过度蓄积，以维持线粒体内电 化学平衡态，保持氧化还原通路的畅通。细胞凋亡过程中，m p t p 不可逆性开放， 导致内膜两侧离子梯度消失，、i ，l n 降低，呼吸链与氧化磷酸化失偶联，线粒体 基质膨胀，外膜破裂，释放出膜间促凋亡蛋白，最终引起细胞凋亡。 3 - 2 细胞色素c ( c y t c ) 正常情况下，c y tc 是一个定位于线粒体内外膜间隙( i n t e r m e m b r a n es p a c e ， 第一章线粒体渗透性转变孔与细胞凋亡的关系研究 i m s ) 的水溶性蛋白质，稳定地结合于线粒体内膜，不能通过外膜。c 舛c 具 有双重功能，除参与呼吸链的电子传递外，在细胞凋亡的启动中，c y t c 作为一 个凋亡起始因子也起着重要作用。在这里，一个核心的问题是c y tc 究竟通过 哪一种途径释放到细胞质中，目前普遍认为c y tc 是通过线粒体m p t p 或 b c l 2 家族成员调控的线粒体外膜通透性而释放到细胞质中的。在缺血再灌注引 起钙超载的模型中细胞凋亡和坏死都可以看到m p t p 开放【2 0 】，外膜破裂，细胞 c y tc 的释放，但这不能解释有些凋亡细胞有c y tc 的释放但没有线粒体的肿 胀和膜电位的下降。另外，m p t p 能被c a s p a s e 抑制剂阻断，但c y tc 不能阱】。 事实上，由c ”c 诱导的c a s p a s e 的活化又能开放m p t p ，且c y tc 激活的 c a s p a s e 3 可特异性地切割b c l 2 ，使其失去对m p t p 的抑制作用，从而释放更 多的c y tc ，放大了凋亡信号 2 2 1 。这些说明m p t p 对c y tc 的释放有促进作用， 却不能证明有始动作用。b a x 插入外膜形成较大通道的模型中，它起到载体作用， 允许分子质量2 0 0 0 x 1 0 3 以下的分子通过矧，但目前这些模型都是在脂质体中模 拟，是不是c y tc 的始动因素，能否因此使内膜损伤很小而没有电位变化，还 有待进一步研究。当c y tc 缺乏时，a t p 减少，活性氧生成过度，是细胞凋亡 的另一原因【2 4 】。 另外，在正常细胞中只有1 5 的c y tc 存在i m s ，其余的存在于嵴上， c 舛c 由于嵴间连接的狭窄不能进入i m s ，而在凋亡时其宽度由1 9n m 变为 5 7n m 。另外，变形也使各嵴之间联系紧密。所以在线粒体外膜通透性改变时， 需要嵴的重塑，大量c y tc 才分布到i m s ，再释放到细胞质。嵴的重塑机制与 线粒体外膜通透性不同，用t b i d 而且不依赖b a x 、b a k 诱导凋亡时，可以用环 孢菌素a 抑制m p t p 打开，结果发现嵴并没有重塑，这说明m p t p 参与了嵴 间c y tc 的移动，而t b i d 要诱导线粒体外膜通透性的改变而致细胞凋亡需要依 赖b a x 、b a k 。c y tc 释放导致的后果与细胞类型有关。在有的细胞中，释放到 细胞质中的c y tc 可被利用，将c a s p a s e 激活，导致细胞凋亡，而在有的细胞 中存在内源性c a s p a s e 抑制剂，释放的c y tc 将无法诱导c a s p a s e 3 介导的凋 亡，大量的c y tc 的释放引起电子传递链的丢失，最后细胞向坏死的方向发展。 h a t a i 等【2 5 】用h e l a 细胞的离心上清液体系来研究c a s p a s e 3 激活及d n a 的 片段化机制，发现c a s p a s e 一3 的激活依赖于c y tc 。 6 第一章线粒体渗透性转变孔与细胞凋亡的关系研究 3 3b e l 2 家族与m p t p 许多研究已表明原癌基因b c l 2 是调节细胞凋亡途径中的一个重要因素， 随着研究的深入，又发现许多基因结构与b e l 2 相似，具有保守的b h l 和b h 2 区( b h ：b e l 2 同源结构域) ，参与细胞凋亡的调节。线粒体外膜上有许多b e l 2 蛋白家族。蛋白质三级结构分析显示，他们具有成孔道的结构域，b c l - x l 、b e l 2 、 b a x 、b i d 等能结合到人工膜上，形成离子通道。 在细胞存活状态下，b a x 以b h 3 结构域与b e l 2 及b e l - x l 的b h 3 结构 域形成异质二聚体，s h i m i z u 等 2 0 3 运用脂质体运载v d a c 系统模拟线粒体，研 究b e l 2 家族与c y tc 释放的关系，发现b e l x l 直接与v d a c 结合，使之关 闭；而b a x 、b a k 能加速v d a c 开放，c y tc 从v d a c 漏出脂质体，缺乏 v d a c 的线粒体，b a x 、b a k 不能促进c y tc 的释放，这一研究表明，作为外 膜m p t p 的v d a c ，是c y tc 释放的通道，受b e l 2 蛋白家族调节。这一新 发现有待更多的研究来证实。对线粒体研究发现，m p t p 位于富含b a x 、b e l 2 、 b c l - x l 的地方。体外实验中b a x 、b e l - 2 、b e l x l 可形成脂质双分子层通道，由 于b a x 和b c l x l 、b e l 2 有不同的离子选择性，b a x 促进m p t p 开放，释放 c y tc ，激活c a s p a s e 级联反应，诱导细胞凋亡口7 】；b e l 2 、b e l x l 抑制m p t p 开 放，阻止细胞凋亡网。b e l 2 和b e l x l 还可通过调节线粒体内外膜之间基质的 p h 值，增加质子外流，提高c a 寸缓冲能力，维持甲m 稳定。s h i m i z u 等 2 9 1 发现从高表达b e l 2 的细胞株和b e l 2 转基因小鼠分离出的线粒体仍能维持 甲m 和m p t p 稳定，进一步研究证实b e l 2 的存在增加了矿的外流，即使 使用s f 6 8 4 6 ( 一种促进矿内流的物质) ，b e l 2 在短暂的质子内流之后介导质 子外流。b e l 2 在线粒体外膜的过量表达抑制了异丙苯过氧化氢或苍术苷诱导的 m p t p 开放，却不能抑制其他因素，如5 0 0 1 t m o y lc a s + 或肼( d i a m i d e ) 诱导的 m p t p 开放。因此，b e l 2 只能在较窄的范围内抑制p t 的发生。b e l 2 抑制p t 的机制是阻止一些小分子如c a 寸从基质中释放以及a i f 从内外膜之间释放到 胞质中。 7 第一章线粒体渗透性转变孔与细胞凋亡的关系研究 参考文献： 1 n e w m e y e rd ，f e r g u s o nm s m i t o c h o n d r i a ：r e l e a s i n gp o w e r f o rl i f ea n d u n l e a s h i n gt h em a c h i n e r i e so f d e a t h t c e l l ，2 0 0 3 ，1 1 2 ( 4 ) ：4 8 1 2 4 9 0 2g r e e nd r ，r e e dj c m i t o c h o n d r i aa n da p o p t o i s s c i e n e ，1 9 9 9 ，2 8 1 ：1 3 0 9 1 3 1 3 3 b o y ap ，r o q u e sb ，k r o e m e rg n e we m b o m e m b e r s r e v i e w ：v i r a la n db a c t e r i a l p r o t e i n sr e g u l a t i n ga p o p t o s i sa tt h em i t o c h o n d r i a ll e v e l 叨e m b oj ，2 0 0 1 ，2 0 ( 1 6 ) ： 4 3 2 5 - 4 3 3 1 4z a m z a m in k r o e m e rg n 坞m i t o c h o n d r i o ni na p o p t o s i s ：h o wp a n d o r a sb o x o p e n s 闭n a tr e v m o lc e l lb i o l ，2 0 0 1 ，2 ( 1 ) ：6 7 7 1 5s h i m i z us ，n a r i t am ，t s u j i m o t oy b c l - 2f a m i l yp r o t e i n sr e g u l a t et h er e l e a s eo f a p o p t o g e n i ec y t o c h r o m ecb yt h em i t o e h o n d r i a lc h a n n e lv d a c 【j 】n a t u r e ，19 9 9 ， 3 9 9 ：4 8 3 4 8 7 6r o s t o v t s e v at k , k o m a r o va ，b e z r u k o vs m ，c o l o m b i n im v d a cc h a n n e l s d i f f e r e n t i a t eb e t w e e nn a t u l a lm e t a b o l i t e sa n ds y n t h e t i cm o l e c u l e s 【j 】jm e m b r b i o l ，2 0 0 2 ，1 8 7 ：1 4 7 1 5 6 7s h i m i z us ，k o n i s h ia ，k o d a m at ，t s u ji m o t oy b h 4d o m a i no fa n t i a p o p t o t i c b d - 2f a m i l ym e m b e r sd o s e sv o l t a g e d e p e n d e n ta n i o nc h a n n e la n di n h i b i t s a p o p t o t i cm i t o c h o n d r i a lc h a n g e sa n dc e l ld e a t h j 】p r o cn a i la c a ds c iu s a ，2 0 0 0 ， 9 7 ：31 0 0 3 1 0 5 8j a v a d o vs a ，l i r ak h ，k e r rp m ，s u l e i m a nm s ，a n g e l i n ig d ，h a l e s t r a pa p p r o t e c t i o no fh e a r t sf r o m r e p e r f u s i o ni n j u r yb yp r o p o f o l i sa s s o c i a t e dw i t h i n h i b i t i o no ft h em i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n 阴c a r d i o v a s cr e s ，2 0 0 0 ， 4 5 ：3 6 0 - 3 6 9 9c r o m p o t nm t h em i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r ea n di t sr o l ei nc e l l d e a t h 阴b i o c h e mj ，1 9 9 9 ，3 4 1 ：2 3 3 - 2 4 9 10d eg i o r g if ，l a r t i g u el ，b a u e rm k , s c h u b e r t 八g r i m ms ，h a n s o ng t r e