（分析化学专业论文）小分子及细胞检测的生物传感器研究.pdf

硕i 学位论文 摘要 植物激素是植物体内天然存在的一系列有机化合物 对植物生命活动的各个 环节起着重要的调节作用 传统的化学 生物技术难以对植物激素进行快速精确 地测定 研究高灵敏 简便 快速 可靠地植物激素测定方法对植物激素的研究 和农业生产具有重要意义 利用化学与生物传感器技术检测疾病标志物 进行临床疾病的准确 快速诊 断以及流行病的现场筛选与群体监控 是当前医学上既新颖又极具吸引力的热门 研究课题之一 近年来核酸适体得到广泛的研究和应用 核酸适配子 核酸适体 a p t a m e r s 是由人工从含大量自由序列的核酸文库中通过体外筛选分离出来的核 酸序列 能以高的亲合力同各种靶分子 小分子 蛋白质 甚至整个细胞 特异 性结合 在本研究论文中 主要内容包括 一 基于酶联免疫技术进行对植物激素脱落酸的检测 在第二章中 人工合成牛血清蛋白 脱落酸 a b a b s a 的交联物包被酶联 板 采用间接争竞酶联免疫反应 i c e l i s a 实现对脱落酸的检测 该方法简单 可靠 易操作 具有良好的灵敏度 在l0n g m l l0 0 0n g m l 范围内成良好的 线性关系 最低检出浓度为1 4n g m l 在农业生产上具有重要的实用价值 二 主要基于核酸适体的检测生物物质的传感器 具体内容如下 在第三章中 基于核酸适体对目标物的强亲合力和高识别性 以及纳米金独 特的光学和化学特征 提出一种基于纳米金凝集变色的均相非标记比色检测技术 用于腺苷的检测 通过目视比色法和u v v i s 分光光度法 均可获得较为理想的 响应性能 如灵敏度 选择性和线性范围 在第四章中 结合c e l l s e l e x 技术筛选得到能特异性识别人急性淋巴白血 病细胞的核酸适体的高特异性和压电传感器灵敏的优点 发展了一种能快速实现 全血样品中自血病细胞的识别新技术 该方法简便 快速 灵敏 可望用于癌症 的早期诊断 治疗方案的选择及愈后的判断 关键词 植物激素 间接竞争酶联免疫 压电传感器 核酸适体 纳米金 i i 小分了及细胞的生物7 感器研究 a bs t r a c t p h y t o h o r m o n ei san a t u r a ls u b s t a n c ew h i c hca nr e g u l a t et h elif ec o u r s ea n dt h e p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t i e do fp l a n t p h y t o n o r m o n er e s e a r c hi s v e r ys i g n if i c a n t t o a g r i c u l t u r e h o r t i c u l t u r ea n do t h e rr e l a t e df i e l d s a n dc a l l sf o rar a p i d p r e c i s ea n d c o n v e n i e n tm e a s u r e m e n t p r o c e d u r e d u et ot h el i m i t e do ft h et r a d i t i o n a l p h y t o h o r m o n a la n a l y s i s u s eo fc h e m o b i o s e n s i n gt e c h n i q u e st od e t e c tt h em e a n i n g f u lb i o m a r k e r sf o r t h ea c c u r a t ea n dr a p i dd i a g n o s i so fc l i n i c a ld i s e a s e sa sw e l la sf o rt h ef i e l ds c r e e n i n g a n dm a s sm o n i t o r i n go ft h ee p i d e m i cd i s e a s e sh a sb e e nan o v e l a t t r a c t i v ea n dh o t t o p i ci nt h ec u r r e n tm e d i c a ls t u d i e s a p t a m e rh a v eb e e nw i d e l yr e s e a r c h e da n du s e d n o w a p t a m e ra r ei s o l a t e df r o mr a n d o m s e q u e n c en u c l e i ca c i dl i b r a r i e sb y i nv i t r o s e l e c t i o n t h e ya r es y n t h e t i co l i g o n u c l e o t i d e sw i t hh i g hb i n d i n ga f f i n i t yf o rab r o a d r a n g eo ft a r g e t s i n c l u d i n gs m a l lm o l e c u l e s p r o t e i n s o re v e nw h o l ec e l l s i nt h i sp a p e r t h ed e t a i lm a t e r i a l sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s 1 e s t a b l i s h m e n to fi c e l l s a k i tf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa b s c i s i ca c i d i nc h a p t e r2 w es y n t h e s i z e dt h ea b a b s ac o n j u g a t ec o a t i n ge l i s a p l a t e s a i n d i r e c tc o m p e t i t i v ee n z y l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y i c e l i s a k i tw a sd e v e l o p e d f o rt h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o nt oa b a t h er e s u l ts h o w e de l i s a k i tw a ss i m p l e r a p i d s e n s i t i v e t h el i n e a rr a n g eo ft h ea s s a yw a sb e t w e e n10n g m l 10 0 0n g m l w i t ht h ed e t e c ti o nl i m i tb e i n g1 4n g m l w h i c hd e m o n s t r a t e dt h er e l i a b i l i t ya n d p r a c t i c a lf e a s i b i l i t yo ft h e s ep r o p o s e da g r i c u l t u r ep r a c t i c e 2 a p t a m e r b a s e db i o s e n s o ra s s a ys y s t e m s i nc h a p t e r3 ah o m o g e n e o u s c o l o r i m e t r i cs y s t e mf o ra d e n o s i n ed e t e c t i o nh a s b e e nd e v e l o p e db a s e do nt h ea g g r e g a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e si n d u c e db yt h e a d e n o s i n eb i n d s s p e c i f i c a l l y t ot h ea p t a m e r p r o b ep r o b e e x c e l l e n tr e s p o n s e c h a r a c t e r i s t i c s f o re x a m p l e s e n s i t i v i t y s e l e c t i v i t ya n dl i n e a rr e s p o n s er a n g e a r e o b t a i n e du s i n ge i t h e ru v v i ss p e c t r o p h o t o m e t e ro rt h en a k e de y e i nc h a p t e r4 am e t h o df o rt h er a p i dd e t e c t i o no fl e u k e m i ac e l l si nw h o l eb l o o d s a m p l e sh a sb e e nd e v e l o p e db a s e do n ag r o u po fa p t a m e r s f o r t h e s p e c i f i c r e c o g n i t i o no fl e u k e m i ac e l l sa n dt h es e n s i t i v ep i e z o e l e c t r i cc r y s t a ls e n s o r t h e d e v e l o p e dm e t h o di se x p e c t e dt oh o l dg r e a tp r o m i s ei nm e d i c a ld i a g n o s t i c sd u et o t h ee a s eo fi m p l e m e n t a t i o n h i g hs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y k e yw o r d s p h y t o h o r m o n e i c e l i s a p i e z o e l e c t r i cs e n s o r a p t a m e r n a n o p a r t i c l e i i i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果 除了文中特别加以标注引用的内容外 本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品 对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担 作者签名 7 习橛绎日期狮g 月y 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查 阅和借阅 本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文 本学位论文属于 1 保密口 在年解密后适用本授权书 2 不保密团 请在以上相应方框内打 作者签名 邓研日期 m 年多月堂日 别磁辄堑蔹醐 匆年 月厂日 硕一 学位沦文 第1 章绪论 有人把2 1 世纪称为生命科学的世纪 也有人把2 1 世纪称为信息科学的世 纪 生物传感器正是在生命科学和信息科学之间发展起来的一门交叉学科 它是 由生物 化学 医药 电子技术等多学科相互渗透综合成长起来的一门高新技术 由于其有灵敏 特异 快速 准确和经济实用等特点 在诞生至今的四十年多年 来展现出了强大的生命力 已经成为日常生活和工业生产中不可或缺的重要因素 被广泛应用于国民经济的各个部门如环境监测 药物加工 食品分析 生物医学 诊断和国防建设等方面 成为生命科学和信息科学技术发展的一个重要方向 生 物传感器的研究开发 已成为世界科技发展的新热点 形成2 l 世纪新兴的高技 术产业的重要组成部分 1 1 生物传感器 生物传感器 b i o s e n s o r 是利用生物特异性识别过程来实现检测的传感器件 生物敏感元件包括生物体 组织 细胞 细胞器 细胞膜 酶 抗体 核酸等 而生物传感器是利用这些从微观到宏观多个层次相关物质的特异性识别能力的器 件总称 它涉及生物 化学 固体物理学 微电子学等等 融合了信息技术和生 物技术 在临床诊断 食品和药物分析 环境保护以及生物技术 生物芯片等领 域有着广泛的应用前景 1 1 1 生物传感器的原理 生物传感器以固定化的生物敏感元件作为生物敏感单元 与被测目标高度选 择性的发生反应 换能器则能敏感捕捉生物敏感单元与目标物之间的作用过程 并将其表达为可检测的物理信号 当待测物与具有分子识别作用的特殊技术固定 在换能器内 或表面 生物敏感单元作用时 产生光学 热学 压电学或电化学 等响应信号 最后把所得的电信号经过电子技术的处理后 在仪器上显示或记录 下来 其信号大小与分析物含量或浓度存在定量关系 从而实现对待测物质的定 量检测 生物敏感单元是生物传感器的关键部件 由基质和生物敏感元件组成 可做敏感材料的生物材料有 酶 免疫系统 微生物 生物组织 细胞和d n a 由于待测物与生物组分之间产生可逆识别 因此 传感器在保持生物敏感组分有 效活性情况下 可对同一底物反复多次检测 l a j 1 1 2 生物传感器的特点 与传统的分析方法相比 生物传感器这种新的检测手段具有以下优点 4 小分了及细i j 色 的生物传感器研究 1 根据生物反应的特异性和多样性 理论上可以制成测定所用生物物质的传 感器 因而测定范围广泛 2 专一性强 只对特定底物起反应 一般不需进行样品的预处理 它利用自 身具有的优异选择性把样品中被测组分的分离和检测统一为一体 3 体积小 响应快 样品用量少 可以实现连续在位检测 4 准确度高 般相对误差可以达到l 5 可进行活体分析 而且通常其敏感材料是固定化生物元件 可以反复多次 使用 6 传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪 因而便于推广普及 7 操作系统比较简单 容易达到自动分析 1 1 3 生物传感器的分类 生物传感器的分类方法多种多样 一般按照以下几个方面进行分类 5 按照生物传感器上分子识别敏感元件不同分为酶传感器 免疫传感器 微生 物传感器 细胞传感器 d n a 传感器 组织传感器 分子印迹传感器等 按照生 物传感器的信号换能器不同可分为光热生物传感器 声波生物传感器 电化学生 物传感器 热敏生物传感器 场效应传感器 压电生物传感器等 按照传感器输 出信号的产生方式不同可分生物亲和型和催化型生物传感器 按照检测对象的多 少又可分为单功能型和多功能型 1 1 4 生物传感器的发展前景及展望 依赖于生物技术 电子学 微电子学最新成果的不断渗透和发展 未来生物 传感器将重点以生物感受系统水平为主攻目标 以期开发出像人类嗅觉器官 味 觉器官更灵敏 更新颖的生物传感器 6 0 未来的生物传感器将具有以下特点 1 功能多样化 将进一步涉及医疗保健 疾病诊断 食品检测 发酵工业等各个领 域 2 微型化 随着微电子机械系统技术和纳米技术不断深入到传感技术领域 生物传感器将不断微型化 各种便携式生物传感器的出现使人们在家中进行疾病 诊断 在市场上直接检测食品将成为可能 3 智能化与集成化 未来的生物传 感器将与计算机紧密相连 自动采集数据 更科学 更准确地提供结果 实现采 样 进样 结果一条龙 形成检测的自动化系统 同时 芯片技术将越来越多地 进入传感器领域 实现检测系统的集成化 一体化 4 成本低 高灵敏 高稳 定性和高寿命 随着生物传感器技术的不断进步 必然要求不断降低成本 提高 灵敏度 稳定性和延长寿命 5 市场普及化 由于生物传感器的独特优势 其 生产的工业化程度也在逐渐的提高 伴随着智能化的增强 将生物传感器用于与 人类生活密切相关的领域 能减少分析时间 降低成本 提高安全系数 在提高 人类的生活质量方面 生物传感器将发挥重要作用 硕l j 学息论文 免疫技术 1 2 1 免疫技术分析基础 免疫技术 i m m u n o a s s a y 是指利用抗原 a n t i g e n a g 与抗体 a n t i b o d y a b 之间高特异性反应 即免疫反应 实现对抗原 抗体或相关物质进行检测的 分析方法 免疫分析具有高灵敏性 特异性强 重复性好 样品及试剂用量少 实验方法易规范和操作 自动化等诸多优点 目前在生命科学的许多领域及医学 检测工作中得到广泛的应用 8 1 1 在免疫测定中 能引起动物机体特异性免疫应答的化学物质叫抗原 抗原具 有免疫原性和抗原性两种特征 免疫原性是指能引起免疫应答的性质 而抗原性 是指与抗体反应的性质 两者并不一致 如抗原进入机体后 可刺激机体产生抗 体和引起细胞免疫 而半抗原 h a p t e n 进入机体可与抗体反应但不能引起免疫应 答 抗原的反应性取决于抗原决定簇 a n t i g e n i cd e t e r m i n a n t 或称为表位 e p i t o p e 一个抗原分子可带有不同的决定簇 抗体是有机体在抗原刺激作用下由淋巴细胞合成的一类能与该抗原发生特异 性球蛋白 世界卫生组织和国际免疫学联合会先后决定 将具有抗体活性以及与 抗体相关的一类球蛋白 通称为免疫球蛋白 i m m u n o g l o b u l i n i g 抗体主要分布 在体内血清中 1 2 2 免疫分析法的分类和研究进展 按照反应机制的不同 免疫分析法可以分为竞争法和非竞争法 按照测定过 程的某些步骤的差异可分为均相免疫分析和非均相免疫分析 按照反应中是否引 入标记物可分为非标记免疫分析方法和标记免疫分析方法两大类 非标记型免疫 分析法包括免疫粘连凝集法 免疫沉淀分析法 补体结合分析法 免疫电泳分析 法 脂质体溶解分析法 免疫粘连凝集法 浊度分析法等 虽然这些方法在分析 过程中检测相不需要与过量试剂分离 但因其灵敏度较低 一般只用于定性或半 定量分析 针对上述非标记免疫分析法的缺点 标记免疫分析方法依靠在分析体 系中引入灵敏的探针分子和标记技术 实现对物质的超灵敏检测 现代的免疫分 析基本上都采用标记免疫分析法 现将免疫分析技术的研究进展综述如下 一 放射性免疫分析法 r i a 1 9 5 9 年y a l o w 和b e r s o n 仓 j 建了放射免疫分析 r i a 12 1 巧妙地将传统的免疫 方法和现代标记方法相结合 为生物医学的微量物质分析开创了新的领域 引 放射 性标记技术是利用放射性物质标记抗原或抗体 再进行抗原抗体的结合反应 通 过对放射信号的检测从而对目标进行测定 应用于实验分析的核素通常是指碘一 1 2 5 1 2 5 i 磷一3 2 3 2 p 碳一1 4 1 4 c 氟 3 h 应用最多的是1 2 5 i 根据反 小分了及细咆的生物f e 感器研究 r 酶免疫组化 酶免疫技术l f 均相酶免疫测定 如删玎和c e d i a 酶测定 固相酶免疫测定 如e l i s a 种固相标记免疫学技术 其利用微孔膜易与多种蛋白质方便交联 而且具有过滤 性及毛细管作用 使所有反应液均自膜上滤过 具有浓缩作用 从而提高方法的 灵敏度 生物素 亲和素系统 b a s 是一种新型生物反应方法系统 是以链亲和 素和酶的结合物作酶标记物 除具有高度的亲和力 特异性外 还可偶联抗体等 一系列大分子活性物质 又有可被酶 荧光素 同位素等标记的特征 对免疫反 应具有多级放大功能 b a s 常与荧光 酶联 p c r 免疫技术联合使用 使得免疫 技术的检测方法更灵敏 快速 简单 经济 三 荧光免疫分析法 f i a 用荧光物质作标记的免疫分析法称为荧光免疫分析法 f i a 本世纪4 0 年 代 c o o n s 采用荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原 首次创建了荧光 抗体检测技术 1 9 荧光免疫法具有专一性强 灵敏度高 标记物不易失活 价格 低廉 无放射性污染等优点 至今 f i a 已广泛应用于微量 超微量物质分析测 定 f i a 常用的荧光标记试剂有 异硫氰酸荧光素 f i t c 四乙基罗丹明和四甲 基异硫氰基荧光素 f r i t c 等 2 0 之2 1 常用的方法有荧光显微法 荧光偏振法 荧光淬灭法和荧光增强法 以常用荧光素作为标记物的荧光免疫测定往往受血清成分 试管 仪器组件 等的本底荧光干扰 以及激发光源的杂射光的影响 使灵敏度受到很大限制 时 间分辨荧光免疫测定 t i m er e s o l v e df l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y t r f i a 是针对 这缺点加以改进的一种新型检测技术 目前成为免疫分析的研究热点 其时利用 稀土配合物的特殊荧光性质建立起来的一种以镧系荧光配合物特别是铕 e u 配 合物作为荧光标记物的免疫分析方法 利用这类荧光物质有长荧光寿命的特点 延长荧光测量时间 待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定 所得信号完 全为长寿命镧系螯合物的荧光 从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰 四 化学发光免疫分析法 c l i a 化学发光免疫分析法是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方 法 始于2 0 世纪7 0 年代末 2 3 1 化学发光免疫分析包括两个部分 即免疫反应 系统和化学发光分析系统 化学发光的检测原理和r i a 与f i a 相似 方法具有 灵敏度高 特异性强 标记物稳定 无放射性污染等优点 但发光不稳定 结果 不易重复 与其它方法相比的显著特点是快速 用于化学发光检测的发光光度计 设备要求简单 化学发光免疫分析法 特别是与使用a c r i d i n i u m 衍生物作为标记物的化学发 光免疫分析法和酶免疫分析法相比具有更高的灵敏度 2 4 2 5 近年来 使用三氯联 吡啶钙r u b p y 3 2 络合物和三丙胺 t p a 两种电化学活性底物的电化学发光免 疫法被开发出来 26 1 该法用于c e a a f p d i g o x i n 等物质的免疫分析测定 且 小分了及细胞的生物传感器研究 能实现高效稳定的发光 目前 电化学发光免疫技术已从实验室研究进入常规临 床诊断应用 随着各种自动发光分析仪器的面世 以及不同类型试剂盒的不断推 出 势必推动其迅速发展 五 电化学免疫分析法 e c l i a 电化学免疫分析法 e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y e c i a 是将免疫技术与电 化学检测相结合的一种免疫分析新方法 1 9 5 1 年由b r e y e r 和r a d c l i f 首次应用 2 他们用极谱方法测定了由偶氮标记的抗原 这成为电化学免疫分析的开端 这 要早于b e r s o n 和y a l o w 发明的r i a 法 但由于电化学分析技术及仪器的限制 这种方法当时还不能满足测定抗原的需要 所以 该方法在近3 0 年没有引起科 学家的重视 6 0 7 0 年代后 电化学分析仪器及技术有了突破性的进展 如离子 选择性电极 液相色谱电化学检测 电化学流动注射分析 微分脉冲伏安法 阳 极溶出伏安法等方法的发展 可以用现代电化学技术测定小体积的样品中的痕量 物质 从而使得电化学免疫分析法以其崭新的内容及独特的优点得以迅速的发展 2 8 2 9 1 1 3 核酸适体 1 3 1 核酸适体以及s e l e x 技术 核酸适体 a p t a m e r 源于拉丁语a p t u s 即t of i t 有配对 适应之意 也称 为核酸适配体 适配体 适配子等 它是人工合成的一段一般长度在2 0 一 6 0 个 碱基左右的单链寡聚核苷酸片段 可以是d n a 也可以是r n a t 3 0 j 它通过指数 富集配体系统进化 s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t s e l e x 技术从人工构建的随机序列的核苷酸文库里通过体外筛选分离出来 其 解离常数很小 n m 或p m 级 能够同各种靶分子 小分子 蛋白质 无机离 子甚至整个细胞 特异性结合p 1 1 s e l e x 技术是2 0 世纪9 0 年代初分子进化工程技术建立的一项新的体外 筛选技术 利用此项技术 可以从随机的 库容为1 0 1 5 左右的寡核苷酸库中筛选 到与靶目标物高度结合的序列 然后通过数轮的筛选 分离和扩增 得到我们需 要的d n a 或r n a 即核酸适配体 a p t a m e r 其基本思想是和达尔文进化理论一样 在试管中模拟大自然的进化 具体包 括自发突变 自然选择和大量繁殖三个过程 1 利用分子生物学技术可以将一 定长度的核苷酸的不同组合都合成出来 组成一个包含了这一长度核酸分子所有 可能突变的文库 这一过程就如同达尔文进化论中的自发突变 2 单链的随机 寡核苷酸序列 容易与蛋白质 核酸等靶物质形成具有二级结构的复合物 靶分 子与随机的这种特异性地结合类似于进化论中的自然选择作用 3 通过一定的 颂t 学位论女 方法把适配体从适配体一靶物质复合物中分离出来 把分离出来的适配体进行 p c r 扩增 变性成单链 进行再一轮的筛选 反复循环进行这个过程 这种扩增 就如同进化论中的大量繁殖 经过数轮反复筛选与扩增 对最终得到的适配体进 行克隆 测序 整个筛选过程简单 快速 经济 实用 在很短的时间内即可获 得具有和靶分子高亲和力 高特异性地核酸适体 技术路线见图l 1 1 3 2 目前 虽然s e l e x 技术的研究与应用还有待于不断推进与深入发展 但是 其在生物学 基础医学 临床诊断 治疗试剂的研制及药物筛选等方面的研究方 面已经显示出广阔的发展空间与应用前景 图1 1s e l e x 拄术路线圈 1 3 2 核酸适体的特点 1 高特异性和高亲和力 通过s e l e x 的多次筛选得到的核酸适体能够具有类似抗体对目标分子的高 特异性和亲和力 由于适配体与其靶分子有很大的接触面积 3 0 4 0i l i i l 2 3 3 1 能 分辨靶物质结构上细微的差别 使其可以完全避免非特异性结合 核酸适体与靶 物质之间的亲和力甚至常大于抗原抗体之间的亲和力 其解离常数一般为1 1 0 9 l 1 0 1 2 m o l l 3 4 3 5 而且随着体外筛选技术的芨展 筛选出的核酸适体与配体间 将有更高的亲和力 2 与靶分子作用范围广泛 文库中核苷酸随机序列的多样性与立体结构的复杂性使人们能够筛选出与不 同种类物质分子发生特异性结合的核酸适体 包括蛋白质 如 酶 3 6 3 7 生长因 小分了及细胞的生物传感器研究 子 3 8 3 9 抗体 4 0 1 细胞 4 1 4 2 基因调控因子 4 3 4 4 等较大的分子以及金属离子 4 5 4 6 1 有机小分子 如氨基酸 4 7 4 8 抗生素 4 9 可卡因 5 们 腺苷 5 0 5 1 等 多肽 5 2 1 等小 分子量的物质 理论上 只要筛选的核苷酸库容量足够大 就可以通过s e l e x 技 术筛选出针对任何靶分子的适配子 3 体外筛选以及其它 核酸适体由体外人工合成f 53 1 结构简单 纯度高 批间误差小 也更迅速和 廉价 分子量小 相对分子质量为8 1 0 3 1 5 1 0 3 左右 与靶分子结合空间位阻 小 核酸适体还具有较大的稳定性和可修饰性 可通过改变筛选条件及筛选后修 饰 使适配子适应不同反应体系的需要 不仅如此 由于核酸适体无免疫原性 不产生免疫反应 在体内的稳定性好 能够进行多次的变性和复性 因此可反复 使用和长期保存 由于核酸适体的诸多优点使其在生化分析研究领域引起较多的注意 在生物 分子的快速检测与某些传染病的诊断方面也发挥着重要的作用 1 3 3 核酸适体与配体的相互作用 核酸适体与配体结合时 通常会通过构型适配形成一些稳定的二级结构 如 发卡 h a i r p i n 茎 环 s t e m 1 0 0 p g 四聚体 g t e t r a m e r 假节 p s e u d o k n o t 鼓包 b u l g e 等等 决定这些结构的碱基往往是与配体结合的重要位点 采用核 磁共振及x 射线衍射等手段可以从结构上对核酸适体与靶分子的作用机理进行 较为深入的研究 从获得的一些高分辨的核酸适体与配体复合物的三维结构中发 现核酸适体与靶分子主要通过 假碱基对 的堆积作用 氢键作用 静电作用和形 状匹配等产生高特异性地结合力 假碱基对 的堆积是指配体的方向环部位与核酸分子的碱基平面平行 并有 重叠 类似于核酸分子里的碱基堆积作用 如 茶碱分子中的芳香环能与其核酸 适体分子中的碱基重叠 但茶碱分子7 一n 上的h 被甲基取代后 即咖啡因 这 种平行关系被破坏 能结合茶碱的核酸适体就不能识别咖啡因分子 亲和力相差 1 0 4 倍 5 5 1 在多数的核酸适体 配体复合物中 尤其是核酸适体 蛋白质复合物 堆 积作用扮演一个关键角色 其次是氢键作用 如 分子的侧链进入核酸分子折叠 部位的深处 与核酸的碱基形成较强的氢键是核酸适体识别精氨酸的重要原因p 引 形状匹配和静电作用是核酸适体能特异识别氨基葡糖苷的主要原因 5 7 1 1 3 4 核酸适配体的应用和发展前景 核酸适配体的出现 使人们认识到核酸不仅是遗传信息的存储和转运载体 而且也可作为各种功能分子 在不同环境下寡聚核苷酸可采取迥然不同的构象 可以为任何靶分子提供足够对的 包纳几乎所有可能存在的空间构象的底物 核酸适配体对蛋白质的高结合力和特异性可与蛋白质的抗体相媲美 且与抗 硕 学位论文 体相比具有很多优越性 可以对蛋白质实时检测跟踪 从而成为蛋白质组学研究 中的重要工具 尤其是在以细胞为基础的肿瘤蛋白质学方面 将是今后核酸适配 体研究的热点领域 另外 由于核酸适配体与蛋白特异性结合后能抑制蛋白的功 能 而且它缺乏免疫原性 体内渗透力强 因此是一种很有发展前途的药物分子 可以制剂用于干扰疾病的发生发展过程 人们已开发一些与肿瘤 艾滋病 肝炎 等相关的蛋白质的核酸适体 些已经进入临床试验 可望发展成新型药物 不 仅如此 核酸适体因为在不同的条件下可以反复变性 复性以及与配体结合后通过 构型适配引起构型改变的特点 能够解决现有传感器平台的一些问题 因此其在 生物传感器 分子开关等领域里将有很广阔的应用前景 5 8 在生物传感方面 寻找高特异性的新核酸适体 提高核酸适配体生物传感器 的灵敏度和适用性 加速核酸适配体传感器检测过程的快速化 自动化已成为适 体生物传感器的研究的主要方向 根据检测信号的不同 可分为电化学核酸适配 体传感器 光学核酸适配体传感器 压电核酸适配体传感器等 1 3 4 1 电化学核酸适配体传感器 电化学核酸适配体传感器是把核酸适体与目标分子作用的生物信号转化为电 信号的传感器 电化学适配体传感器由于其设备简单 能耗低 使用方便 方法 灵活多样 易微型化等优点 直是分析化学工作者重点研究的领域 电化学核酸适配体传感器大多是利用适体与目标结合设计 通过电化学参数 直接测量 如阻抗和电流 或者通过某些标记物简介测量 另一种设计是利用适 体的某些生化特征作为d n a 酶底物或构想开关 也有基于链置换或者是结构转 换诱导的构想来设计的 根据检测信号的不同可以分为电流型 阻抗型 压电型 等 根据是否应用标记物产生检测信号 电化学核酸适配体传感器可大致分为标 记型和非标记型 一 标记型电化学核酸适体传感器 1 利用酶的化学放大功能 在核酸适体上标记酶作为识别元素 主要是 过氧化物酶和葡萄糖脱氢酶等 通过催化其相应的底物来产生电信号 m i r 等 5 9 报道了基于辣根过氧化酶 h r p 放大电化学信号来检测凝血酶的电化学适体传 感器 类似地 依次将巯基化免疫球蛋白 i g e 适体 i g e 生物素标记i g e 适 体 亲和素标记的碱性磷酸酶固定至金电极表面 通过检验碱性磷酸酶催化反应 实现了对i g e 的定量分析1 6 2 在核酸适体上标记具有电化学活性物质 如二茂铁 亚甲基蓝 道诺 霉素等 作为识别元素 通过这些物质在电极表面发生氧化还原反应或者作为杂 交指示剂 测定其产生的电流信号 寡聚单链d n a 或r n a 形成多种热力学稳 定的三维空间结构 是其与靶分子特异高效结合的基础 这种结合前后的结构差 异 可以通过具有电活性的物质来识别 从而达到了检测靶分子或者区分s s d n a 小分了及细胞的生物传感器研究 和d s d n a 的目的 x i a o 6 z u o 6 2 1 p l a x c o 6 3 1 等都对这方面进行了报导 3 采用无机纳米粒子 女1 a g a u 的放大功能 各种纳米粒子因具有比 表面积大 催化能力强等性质 除了用作适体固定基底用于传感器增敏 作为标 记物用于信号放大也是一种很好的选择 d o n g 等 6 4 采用阻抗技术 结合纳米金 的放大作用 高灵敏地检测了固定在金电极表面的凝血酶的含量 4 利用一些带正电荷的电活性有机分子 如阳离子染料 阳离子聚电解 质等也可通过静电作用吸附到带负电磷酸骨架的适体链上或嵌入双链缝隙中 产 生电化学信号 基于此方法的电化学传感器也有报道 6 5 6 6 二 非标记型电化学核酸适配体传感器 在没有标记物存在时 获得的电化学检测信号往往是基于亲和对结合后所导 致的传质或电子传递位阻变化 c a i 等 6 7 设计了一种非标记电化学适配体传感器 来检测溶解酵素 在铟锡氧化物电极上组装上亲和素 与修饰了生物素的核酸适 体链结合 由于核酸适体带有负电荷 阻止了f e c n 6 3 与电极表面进行电子传 递 当加入目标物溶解酵素后 带正电荷的溶解酵素与其核酸适体链结合 导致 电子传递阻力降低 f e c n 6 弘m 能够与电极表面进行电子传递 利用前后电流值 的变化可以对溶解酵素进行定量检测 此外 z a y a t s 等 6 8 设计了一种用非标记的 阻抗方法来检测三磷酸腺苷的电化学适配体传感器 用共价键合的方法在电极表 面组装上三磷酸腺苷的适体 与其一端互补的链杂交 然后加入三磷酸腺苷目标 分子 其适体与三磷酸腺苷结合形成其特有的3 d 结构 双链结构解离 1 3 4 2 光学核酸适配体传感器 光学核酸适配体传感器是把核酸适体与目标分子作用的生物信号转化为光信 号的传感器 由于光学检测既可以在界面上进行 也可以在均相中完成 检测的 技术较多 容易与其它的信号放大技术相结合 因而 方案设计灵活 研究较多 一 基于荧光的核酸适配体传感器 一般的d n a 或者r n a 不产生荧光信号 但通过体外合成可以根据实际需 要对核酸适体进行后天修饰 根据其标记的不同 我们可以将其分为单色的荧光 变化 仅在核酸适体上标记一个荧光基团 和双重的荧光变化 包括荧光基团和 淬灭基团 1 单发色的荧光团 m o n o c h r o m o p h o r i ca p p r o a c h 目标物与核酸适体的结合引起结构重组 从而导致的构象变化引起荧光发生 变化 j h a v e r i 等 6 9 等报道了一种荧光检测方法 他们设计了两个方案来检测目标 物 一个是用适配体先和一个在链中间标记了荧光基团的核酸链杂交 此时 利 用碱基自身的淬灭作用 荧光淬灭 当适配体与目标物结合后 标记了荧光基团 的核酸链被置换下来 发出荧光 2 双发色的荧光团 b i o c h r o m o p h o r i ca p p r o a c h 硕f j 学位论文 基于双发色的荧光传感器的设计类似与分子信标 最初分子信标被用于检测 核酸链 如果将核酸适体两端分别修饰特定的荧光基团和淬灭基团 可以构建类 似于分子信标的信号探针 目标物质与其核酸适体的结合引起核酸适体的构型发 生变化 致使荧光共振能量转移效率发生改变而产生相应信号 7 引 例如 h a m a g u c h i 等 7 l 将含有凝血酶的核酸适体链的核酸链两端分别标记荧 光素和淬灭基团 当没有加入目标物时 核酸链因杂交而形成双链 适体折叠成 封闭的发夹结构 引入目标物后 因核酸适体结合凝血酶的能力大于其自身的杂 交能力 核酸适体信标能够形成稳定的核酸适体 靶物质的复合物 适体构型的改 变导致荧光素与淬灭基团之间的距离发生改变 从而产生可以检测的荧光信号 后来s t o j a n o v i c t 7 2 1 r a z v a n 7 3 1 等也相继报道了基于荧光淬灭能量转移的传感器 二 基于光吸收法的核酸适配体传感器 光吸收法的核酸适配体传感器是基于适体与靶分子结合作用前后吸光度的变 化或最大吸收波长 颜色 的改变进行检测的适体传感器 一般又可称为比色法 核酸适配体传感器 s t o i a n o v i c 等 7 4 j 设计了核酸适体的比色探针 用于可卡因的检 测 其基本原理是将核酸适体与花青染料结合 由于是非特异性结合 当加入可 卡因后 可卡因取代染料和核酸适体特异性集合 通过测量染料分子在特定波长 的吸光度变化可以测定可卡因的浓度 此外 由于纳米金所具有的较好的吸光系数和取决于距离的光学性质 纳米 金溶液吸收特定波长可见光后会引起表面电子的共振而呈现特殊的颜色 纳米金 溶液所呈现的颜色与纳米颗粒间的距离存在直接关系1 75 当纳米颗粒间距大于粒 子的平均直径时显红色 大致相等或略低于平均直径时 显蓝色 7 引 因此 用于 不同物质如蛋白质 77 1 腺苷 5 0 5 1 金属离子 7 8 1 过氧化氢 7 9 1 和糖类 8 0 8 1 1 特异性检 测的基于纳米金团聚的光度检测法已有不少报道 l i u 等 5 0 l 报道了基于适体和纳米颗粒的通用传感器用于快速测定腺苷和可卡 因 将纳米金的表面修饰上带筑基的d n a 链 当目标物不存在时 由于核酸适 体链与两条分别修饰了纳米金d n a 链的杂交 纳米金之间的距离较近 因此形 成聚集体 显示淡紫色 加入目标物 由于核酸适体改变其结构与可卡因的特异 性结合 带核酸链的纳米金从原有的杂交复合物上挤下去 导致纳米金之间距离 增大 聚集体解体 体系颜色从紫色变为红色 因而实现对目标分子的方便检测 后来 l i 等哺2 j 报道了基于非标记的纳米金团聚的用于h 矿 的比色检测 当 没有目标分子时 纳米金的表面由于有核酸适体链的保护 在高离子的盐浓度条 件下不会发生团聚 当加入于h 9 2 离子和n a c l 0 4 一种离子强度破坏剂 可以 防止其它金属离子与h 9 2 离子结合产生不易溶解的产物 后 由于核酸适体链与 h 9 2 离子形成t h 9 2 t 的稳定结构 构型的改变改变了原有的纳米金的稳定性 产生团聚 纳米金颜色变蓝 从而对h 9 2 离子能够进行定量检测 小分了及细胞的生物传感器研究 1 3 4 3 压电核酸适配体传感器 l8 8 0 年雅克 居里和皮埃尔 居里兄弟首先发现了石英等一些晶体的压电现 象 后来1 9 5 9 年 s a u e r b r e y 推导出气相中有关晶体表面所载质量与谐振频移的 s a u e r b r e y 方程 8 3 1 a f 泖爿 1 1 f 是由晶体吸附外来物质后引起的振动频率的变化 h z k 是常数 a 为 被吸附物所覆盖的面积 f 是压电晶体的基本频率 m 是被吸附物质的质量 从方程可知 压电石英晶体谐振频率的改变与晶体表面质量负载的变化呈简单的 线性关系 压电传感器具有装置简单 灵敏度高 选择性好 响应速度快以及实 时动态检测等优点 因此得到人们的广泛关注 根据其检测环境的不同 压电传 感技术可分为压电气相传感技术和压电液相传感技术 根据其检测原理的不同 压电传感器可分为质量响应型和非质量响应型 8 4 目前 针对压电石英晶体研究的较多的是压电免疫传感器 主要用于微生物 如白色念珠菌 85 1 肠道菌 8 6 1 艾滋病病毒 8 7 1 等 和免疫球蛋白等蛋白质物质的 检测 如胰岛素 8 引 免疫球蛋白i g e s 9 i g g 9 0 9 1 1 等 核酸适体在传感器表面的 固定极大发展了压电适体生物传感器 压电适体传感器是基于以质量效应为主的 非标记型传感器 结合石英晶体高灵敏的压电效应和核酸适体高特异性结合性能 的一种生物传感器 可响应晶体表面质量负载以及体系 溶液 的密度 粘度 电导 介电常数等多数参数的变化 响应灵敏 l i s s 等 9 2 采用压电技术实现了i g e 适配体对i g e 的实时检测 由于适配体 的小尺寸和非蛋白本质 他们在基质表面能组装成一层致密的 高定向的分子层 比较受体分子与核酸适体和传统的抗体与相应蛋白的结合作用 结果表明基于核 酸适体的生物传感器比基于抗体的生物传感器稳定性和重现性更好 线性范围更 宽 且容易再生 具有较好的应用前景 另外 p a v l o v 等 9 3 还报道了一种基于纳米粒子和凝血酶核酸适体作为生物识 别分子来检测凝血酶的q c m 适体生物传感器 首先在晶体表面自组装凝血酶适 体 结合凝血酶有两个结合位点的事实 加入凝血酶和标记了纳米金的a p t a m e r 此时以纳米金为 晶种 加入h a u c l 4 和n a d h 还原型辅酶i i 二钠 来进行 信号再放大 这种设计进一步增加了q c m 适体传感器的灵敏度 此外还有基于核酸适体的表面增强拉曼 9 4 和原子力显微镜传感器 5 8 等 在 此不做一一介绍 1 4 本研究论文的构想 在广泛查阅相关文献的基础上 结合实验室原有的工作基础 本论文针对目 硕l 学位论文 前小分子和细胞检测方法中存在的一些问题 结合e l i s a 方法 比色法 压电传 感器和核酸适体的一些优点 发展了一些新型的生物传感器 具体从以下几方面 开展工作 1 抗体与抗原之间特异性反应的免疫检测法可用于对目标物的检测 以植物激 素脱落酸为研究对象 用牛血清蛋白对小分子的植物激素半抗原进行标记 通过e l i s a 间接竞争免疫方法 实现对脱落酸小分子的测定 2 核酸适体 a p t a m e r 是人工合成的的核酸序列 能以高的亲合力同