（茶学专业论文）冬青属苦丁茶种质资源的rapd分析.pdf

摘要本文系统地介绍以苦丁茶冬青( 1 l e xk u d i n g c h ac j t s e n g ) 为代表的冬青属苦丁茶种质材料之r a p d 分析。研究结果表明，苦丁茶冬青r a p d 分析的最佳p c r 反应体系为：2 5ul 反应混合物中含模板d n a2 0 n g 4 0 n g 、1 5 m m o l l 2 0 n l i 0 1 lm 9 2 + 、2 0 0l zm o l ld n t p s 、1 5 ut a q 、5 p m o l 引物；最佳反应程序为9 4 预变性4 m i n ；9 4 变性3 0 s e c ，3 6 退火3 0 s e c ，7 2 延伸2 m i n ，4 5 个循环；7 2 后延伸7 m i n ；4 。c 冷却拿出。本研究中所有实验材料之r a p d 分析均在上述最佳p c r 反应体系和反应程序的条件下进行。对冬青属“苦丁茶”的4 个物种即苦丁茶冬青、大叶冬青( j 1 a t i f o l i at h u n b ) 、五棱冬青( f p e n t a g o n as kc h e n , y x f e n ge tcel i a n g ) 、枸骨( lc o t l t u t al i n d l ) 以及一个介于五棱冬青与苦丁茶冬青之间的中间类型共2 2 份种质材料进行p c r 扩增。用5 0 个l o 碱基随机引物进行r a p d 多态性检测，筛选出2 7 个多态性良好的引物。以这2 7 个引物对上述2 2 份种质材料进行p c r 扩增，共扩增出4 9 8 条谱带，其中多态性带为4 8 4 条，占9 7 1 8 ；此外，另对5 7 份苦丁茶冬青种质材料、6 份五棱冬青种质材料以及6 份介于二者之间的中间型种质材料进行了p c r 扩增。从5 0 个1 0 碱基随机引物中筛选出2 2 个多态性良好的引物，共扩增出2 9 8 条谱带，其中多态性带为2 7 4条，占9 1 9 。u p g m a 聚类分析表明，r a p d 分析的结果完全可以作为种级水平和种下划分的分子分类学依据而用于冬青属苦丁茶不同物种间，以及同一物种不同种质材料之间的遗传差异、亲缘关系及分类鉴定的研究。事实上，应用r a p d 技术不仅可以将供试的4 种物种和一类中间型( 6 份材料) 明显地区分开来，而且可以将同一物种( 1 l e x k u d i n g c h a c j t s e n g ) 不同起源地域的种质材料( 或不同的类群) 明显地区分开来。同一起源地域内的种质材料遗传距离较小，而不同起源地域的种质材料其遗传距离较大，特别是起源于海南岛的苦丁茶冬青种质材料与大陆各地域内的苦丁茶冬青种质材料其遗传差异较大，其形态特征亦显著有别于大陆各地域内起源的苦丁茶冬青种质材料，故作者认为可将其划分为苦丁茶冬青的一个生态型；典型的五棱冬青单独归聚为一支；6 份中间类型的种质材料在聚类时单独归聚为与典型五棱冬青种质材料平行的另一支。作者根据形态特征和聚类分析结果认为，可以将中间类型划分为五棱冬青的一个变种，并认为该变种可能是在系统发育过程中由五棱冬青雌花的柱头接受了苦丁茶冬青的花粉并产生天然杂交，由天然杂交的后代演化而成。【关键词】冬青属苦丁茶；苦丁茶冬青；遗传差异；r a p d 分析；分类鉴定s t u d yo nr a p da n a l y s i so ft h eg e r m p l a s mr e s o u r c e so f k u d i n g c h at e a ”i nh o l l ya b s t r a c tt h i st h e s isd e a l sw i t ht h er p da n a l y s i sf o rt h eg e r m p l a s mm a t e r i a l so f“k u d i n g c h at e a ”i nh e l l y 。p u t t i n gt h es t r e s so ni l e xk u d i n g c h ac j t s e n g t h er e s e a r c hr e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p ti m a lp c rs y s t e mf o rt h er a p da n a l y s i so fz e xk u d i n g c h ac j t s e n gw a st h a ta2 5 9 lr e a c t i o nm i x t u r es y s t e mc o n t a i n s ：2 0 n g 8 0 n gt e m p l a t ed n a ，2 0 0 1 z m l l 4 0 0 p m o l ld n t p s ，1 5 m m o l l 2 0 r m o l l m g ”a n d5 p m o la r b i t r a r yp r i m e r ，1 5 ut a qd a n ：a n dt h a tt h eo p t i m a la m p l i f i c a t i o np r o g r a mi s4 5c y c l e so f4m i na t 9 4f o rp r e m e l tj n g ，3 0 s e ca t9 4 f o rm e l t i n g ，3 0 s e ca t 3 6 f o ra n n e a l i n g ，2 m i na t7 2 f o re l o n g a t i o n ：7 m i na t7 2 f o rp o s t e l o n g a t i o na n d t h ea m p lif ie dt u b e sa r et a k e no u to ft h et g r a d i e n tt h e r m a lc y c l e ra t4 t h er a p da n a l y s i so fa l le x p e r i m e n t a lm a t e r i a l su s e di nt h i sp r o j e c tw a sc a r r i e do nu n d e rt h eo p t i m a lp c re x p e r i m e n t a ls y s t e ma n dr e a c t i o np r o g r a mm e n t i o n e da b o v e 2 2g e r m p l a s mm a t e r i a l so fk u d i n g c h at e a ，f r o m4s p e c i e sinh o l1y ，i e 玎e xk u d l n g c h ac j t s e n g ，上 a t i f o l i at h u n b ，上p e n t a g o n as s l 0 n 1 ，yxf d 培e tce 吐_ 马上c o r n u t al i n d l a n dai n t e r m e d i a t et y p e ( i tl i e sb e t w e e n 上k u d i n g c h aa n d ，p e n t a g o n a ) w e r ea n a l y s i sf o rp c ra m p l i f i c a t i o n 5 01 0 一b pr a n d o mp r i m e r sw e r eu s e df o rt h ep o l y m o r p h i s mt e s to fr a p d ，a n d2 7r a n d o mp r i m e r sw it ho p t i m a lp o l y m o r p h i s mw e r es e l e c t e df r o mt h e5 0r a n d o mp r i m e r s t h e2 7r a n d o mp r i m e r sw e r eu s e df o rt h ea m p l i f i c a t i o no n2 2g e r m p l a s mm a t e r i a l sm e n t i o n e da b o v e a n d4 9 8h a n d sw e r eo b t a i n e d 4 8 4b a n d sw e r ep o l y m o r p h i cb a n d s ，w h jc ha m o u n t e dt o9 7 1 8 m o r e o v e r ，a n o t h e r5 7g e r m p l a s mm a t e r i a l so f 上k u d i n g c h 马6g e r m p l a s mm a t e r i a l so f 上p e n t a g o n aa n d6g e r m p l a s mm a t e r i a l so ft h ein t e r m e d i a t et y p ew e r eu s e df o rp c ra m p l i f i c a t i o n 2 2r a n d o mp r i m e r sw i t hj d e a lp o l y m o r p h i s mw e r es e l e c t e df r o m5 01 0 一b pr a n d o mp r i m e r s t h e2 2r a n d o mp r i m e r sw e r eu s e df o r p c ra m p l i f i c a t i o no ft h e6 9g e r m p l a s mm a t e r i a l sa b o v e a n d2 9 8b a n d sw e r eo b t a i n e d o fa l lt h eb a n d s ，2 7 4h a n d sw e r ep o l y m o r p h i cb a n d s w h i c ha m o u n t e dt o9 1 9 u p g m ac l u s t e ra n a l y s t sd e n d r o g r a m ss h o w e dt h a tt h ec o n c l u s i o n so fr a p da n a l y s isc o u l db ec o n s i d e r e da st h eh a s i so fm o l e c u l a rt a x o n o m yo ns p e c i e s1 e v e la n di n f r a s p e e i f i ce l a s s i f i c a t i o n ，w h i c hc a nb eu s e df o rs t u d y i n gt h eg e n e ti cd i f f e r e n c e ，r e l a t i o n s h i pa n dc l a s s i f i c a t i o no f “k u d i n g c h at e a ”i nh 0 11 y ，a m o n gd i f f e r e n ts p e c i e s ，o ra m o n gt h ed i f f e r e n tg e r m p l a s mm a t e r i a l so l t h es a m es p e c i e s 1 nf a c t ，u s i n gr a p dt e c h n i q u e ，n o to n l yt h e4s p e c i e sa n dai n t e r m e d i a t et y p eo f k u d i n g c h at e a ”i nh o l l yc a nb ed i s t i n g u is h e dc l e a r l y ，b u tt h eg e r m p l a s mm a t e r i a l so ft h es & m es p e c i e s ( 上k u d & g c h ac j t s e n g ) ，f r o mt h ed i f f e r e n to r i g i nr e g i o n s 。o rf r o mt h ed if f e r e n tp o p u l a r i o nc a na l s ob ed i s t i n g u i s h e dc l e a r l y t h ed i f f e r e n tg e r m p l a s mm a t e r i a l si nt h es a m eo r i g i nr e g i o nh a ds m a l l e rg e n e t i cd i s t a n c e ，w h il et h eg e r m p l a s mm a t e r i a l sf r o md i f f e r e n to r i g i nr e g i o n sh a dg r e a t e rg e n e t i cd i s t a n c e e s p e c i a l l y ，t h e r ew a sm o r es i g n i f i c a n tg e n e t i cd i f f e r e n c eb e t w e e nt h eg e r m p l a s mm a t e r i a l so flk u d i n g c h af r o mh a i n a ni s l a n da n dt h a tf r o mt h ed i f f e r e n to r i g i nr e g i o n so ft h em a i nl a n d s e e i n gt h a tt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h eg e r m p l a s mm a t e r i a lsares i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tf r o mt h eg e r m p l a s mm a t e r i a l sf r o mt h ed i f f e r e n to r i g i nr e g i o n so ft h em a i nl a n d ，t h ea u t h o rt h i n k st h a tt h ep o p u l a t i o no nh a i n a n i s l a n dc a nb ec t a s s e da s a ne c o t y p e t h et y p i c a lg e r m p l a s mm a t e r i a l so fi p e n t a g o n ac l u s t e r e da sai n d e p e n d e n tc l u s t e r a n dt h e6g e r m p l a s mm a t e r i a l so ft h ei n t e r m e d i a t et y p ec l u s t e r e da sa n o t h e ri n d e p e n d e n tc l u s t e r e d ，w h i c hi ss i m u l t a n e o u st ot h ec l u s t e ro ft h et y p i c a lg e r m p l a s mm a t e r i a lso f 上p e n t a g o n a t h ea u t h o r 。b a s e do r lt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dt h ec l u s t e r i n ga n a l y s i s ，t h i n k st h a tt h ei n t e r m e d i a t et y p ec a nb ec l a s s i f i e da sav a r i e t a s t h ea u t h o ri n f e r r e dt h a tt h i sv a r i e t a sw a sp e r h a p sf r o mt h en a t u r a lc r o s si nt h es y s t e md e v e l o p m e n t 【k e y w o r d s “k u d i n g c h at e a ”( ；e n e t i cd i f f e r e n c ei nh o ll y ：h e xk u d i n g c h ac j t s e n gr a p da n a l y s i s ：c l a s s i f i c a t i o n独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师的指导下迸行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。也不包含为获得湖南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：取，簧多争时间；细弓年占月z 2 日关于论文使用授权的说明本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。不同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：裂，a 劳导师签名：夕钐卵闳氏时间：知乃年月挖曰时间：w 口z 年月2 z 日tj一刖吾1 我国“苦丁茶”资源的物种多样性“苦丁茶”是我国民间用作传统代茶饮料或中草药的一大类植物的统称【1 z o i 。事实上，“苦丁茶”在我国存在严重的( 在某种程度上甚至是混乱的) 异物同名和同物异名现象( 1 3 “j 。根据海南大学苦丁茶研究所目前已收集到的资料、标本以及实地考察的结果，在我国不同区域，被称之为“苦丁茶”，而且被人们作为饮料植物或药用植物使用的原植物至少有2 8 个物种( 包括3 个变种和1 个亚种) ，至少涉及到1 2 个科1 4 个属( 表1 ) 。我国苦丁茶资源丰富的物种多样性为我们开发饮料产品或医药产品提供了良好的资源条件，但与此同时也存在许多问题或困难需要我们去探索和解决。2 冬青属苦丁茶的研发概况表1 所汇集1 2 个科的“苦丁茶”中，目前以冬青科的“苦丁茶”最具影响，其次为木犀科的“苦丁茶”。其他各个科中的“苦丁茶”无论就其饮用价值还是药用价值而言，在国内外的影响较小。本课题以冬青属苦丁茶作为研究对象，重点是苦丁茶冬青( h e xk u d i n g c h ac j t s g ) 以及相关的近缘种质材料。在冬青属植物中，被称为“苦丁茶”并广为使用的原植物主要有枸骨( 1 l e xc o r m i t a l 矗l d l ) 、大叶冬青( 工l a t l f o l i a t h 曲) 、五棱冬青( ，p e n t a g o n as d c o r 戢v x 罂dceu a n g ) 以及苦丁茶冬青( j k u d i n g c h acj t s m g ) 等 1 - 1 5 1 。此外，何云核最近又报道了冬青属的一个新种霍山冬青( h u o s h a n e n s i syhh e ) ，在安徽民间亦称为“苦丁茶”【1 6 l 。特别是在大别山一带，民间常将霍山冬青的叶片称为“苦丁茶”并作为凉茶饮用( 私人通讯) 。在上述冬青属5 种被称为( 或被用作) 苦丁茶的原植物中，枸骨除作为园林植物( 绿篱或盆景) 在我国有极少量人工栽培面积外，目前仅在江苏、浙江、安徽等地局部地区采摘野生的枸骨叶与茶时共焙制作苦丁茶，至今尚未发现人工连片种植枸骨作为饮料植物或药用植物的实例。因枸骨在形态上的极显著特征( 叶片顶端有硬而坚的刺齿3 个，叶片两侧各有尖硬刺齿1 3 个) ，茶学界或农学界对其物种名称( 工c o r n u t al 血妞) 的认定至今没有任何争议或混淆。霍山冬青是2 0 0 2 年才发表的新种，目前对其保健作用、药用功效以及分布地域和作为代茶饮料使用等基本情况尚缺乏详细的报道，只见何云核对其作了形态学描述【1 6 j 。大叶冬青在浙江、江苏、上海、安徽、湖北等地民间被作为“苦丁茶“饮用，近年已有大叶冬青苦丁茶的注册产品上市，而且在浙江新昌、磐安、金华等县市表1 我国民间称之为“苦丁茶”的饮料植物一、冬青科a q u l f o l i a c e l e二、紫草科b o r a g l n a c e a e2 大叶冬青( l a t i f o l i at b u r i o )3 枸骨( m m u )4 五棱苦丁茶r i p e n t a s o n a s kc h e n _ sf e n ge 1 c fl i a r )5 霍山冬青( 1 h u o a h u e n s l s t h h e )；辱葫西嚣璃两磊石二面n a k a i 7 1 5 b 西c o r y l i f o l l l c h w i i g 蛳浙江、湖南、福建、广西江苏、新江、安徽、 i l 南以及秦岭以南其他各省区广西、贵州( 绥阳) 、云南( 西畴) 、湖南( 湘西南)( 安髓河南) 大别山一带了舌j 一丢“确：。面篆一云南、贵州、四川、湖北、洞南三、菊科8 厶湾莴苣( 工栅岍缸蛔胁聃m i 血)四川等c o m p o s h a e9 黄牛木 c m ，叼妇m 曲油i 肿桃o 肌t 瑚云南、广西广东四、金丝桃科h y p e r l c a e a e- - h y p e r i c u nc o c h i n c h i n 蚰e l o u t = c 1 i o o t r i m o n l 3 1 = c p o l y a n o m mk m t h = ：慕= 菡。，s u b s p 陋云一毛叶黄牛木c 心咖k 吲拥曲洲d 4d 弭r “mp r u n i f o r u m 晖i i 哪q 神i n目w 女m ，m 枷l 【l l 口爿h 如咖，州棚y 却黼陆1 1 序梗女贞( l i g s t r u m p e d u n c u l a r tr e h d ；矗1 工日本毛女吏( 五) a p o n l c i u m t h u n b 住“p u b s c e 地k o i d z )：0”当竺簟：l 曲邮。挪“芸；昆明、大理等地“1 4 垄! ! 、竺陋面：一h ：- v 札：妒妇咖一p i e k ) 1 0 0 k f j；i x 西j 磊釜蟊南，湖北、广东( 乐五末犀科1 5 粗壮女贞( 工，曲竺辫( r 噱”助u n 哟主；= 。_ | = 三。蔷赢三；、苫五“。1 6 宜昌女贞( 上 t r o n 鲥l o p h y l l u m h e m s l )：蔷”- 女睾恐妇竺孤、云南、r - i1 8 兴山螬树( 工 a 叫h ；- 蝴0：=1 9 片矢秉( 。瑚h d i 时州船柙_ ，_ 棚s l h ”砷蹦六、删2 0 苦地丁草( c 口岫s 肼t 峨)山东平度市一带饮用p a 蕞科2 1 竺鼽删? “脚“勰瓣三戮搿舢区r o s a c e a e2 2 石椭( p h o t i n i a 5 e r r u l a t al i n d l )一：l 竺耳草科2 3 月月青恤。m 。睁妇o 在贵州石酐等地饮用_九、山茶科2 4 大叶茶( 皋芦茶) c a m e l l i a m n e 时i s全国各地( 以江华苦茶、一卫罂曼竖国) 塑! 删，d 幽( 或- 墼熟! ! 捌堕蝗友叼誉砻售枣) 王、冀橘科”乌饭树( h c 曲，i u mb r a c 加m 卅t h u n b )贵州黎平瓮安农村部分人饮用! 一、马鞭草科2 6 白花灯笼( c 如m 妇，函 ，f 棚口，目ml )广西、四川2 7 粤蛇葡萄m 卵，c a n t o n i e g s i s 口0 0 ke ta m p i1广东、海南、湖南等十二、葡萄科2 8 显齿蛇葡i a m p g r o 岱e d e n t a ：am a n d m a z z ) wt湖南常宁市塔山一带、衡乐县及周边县1 1 j塑坚竺l 兰生曼l 一塑l 一2已开始有基地化的大面积人工栽培。由于大叶冬青与苦丁茶冬青是近缘种，因其形态特征、保健作用及药用功效多有相同或相似( 但1 ：3 感远不及苦丁茶冬青) ，故在最近2 0 多年所发表有关苦丁茶的研究论文中，茶学界或农学界不少学者往往将二者混为一谈，或将大叶冬青认定为苦丁茶冬青，或将苦丁茶冬青认定为大叶冬青。五棱冬青是俸宇星等人于1 9 9 8 年发表的新种，其最显著的特征是主茎或分枝1 - 3 年生部位具五条锐棱角，叶中脉于叶背呈锐骨状凸起。该物种主要分布于广西境内，当地居民有将其嫩芽或老叶作为苦丁茶饮用的习惯( 但口感较差) ，并有其种苗混杂于苦丁茶冬青的种苗中在生产上种植。此外，在湖南f 湘西南) 、贵州( 绥阳) ，以及云南( 西畴) 等地亦有发现和分布。苦丁茶冬青在所有各种苦丁茶中目前是人工栽培面积最大、产品价格最昂贵、在国内外影响最大、被认为是“正宗苦丁茶”的种类。现代植物化学分析研究已经证明，苦丁茶冬青产品中除含有多种维生素、多种氨酸、多种蛋白质、多种微量元素及其他矿物质营养成份等一般普通食品中常见的营养成份之外，还含有一些独特的有效成份，包括n 香树脂醇、b 谷甾醇、乌苏酸( 亦称熊果酸或乌索酸) 及乌苏酸的乙酰化合物、苦丁茶甙元及乙酰苦丁茶甙元，以及蛇麻脂醇、蒲公英赛醇等等f ”5 - 1 4 , 2 孓2 ”。因此，它除了可以作茶叶的代用品，具生津止渴之功效外，还具有多种药用功效与保健作用，能止痛、抑菌、解痉、降压、清热、降火、解毒消炎、强心利尿、抗癌防癌。经动物试验和人们长期饮用的结果证明，苦丁茶冬青能明显降低血液总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白质( l d l ) 的含量，改善血液粘稠度，对高血压、肥胖症、动脉硬化症、冠心病、便秘、咽喉肿痛、慢性咽炎及糖尿病等多种疾病有明显疗效【1 1 3 h 3 - 2 0 。3 苦丁茶冬青的研发概况及其种质资源的遗传多样性如上所述，苦丁茶冬青目前是我国最具影响的“苦丁茶”种类，也是我国所有代茶饮料植物中人工栽培面积最大的饮料作物，仅广西南宁地区就己发展近6 6 6 6 7h a ( 约1 0 万亩) 1 2 1 - 2 4 1 。此外，海南、广东、云南等省均有大面积的人工栽培，湖南、贵州等省有零星种植。令人遗憾的是尽管我国饮用苦丁茶冬青的历史可以追溯到东汉时期，有将近2 0 0 0 年的历史，但由于种种原因，至2 0 世纪末苦丁茶冬青在我国茶学界已几近失传；8 0 年代初期，由湖南农学院陈兴琰教授等人率先发起重新研究，这种珍贵的代茶饮料植物才被重新发掘出来【2 1 。从总体上说，由于苦丁茶被人们重新作为一种重要的饮料植物来认识的历史不太长，许多基础性的工作尚缺乏系统的研究。尽管在有效成份的分离、提取与鉴定、栽培与加工等方证i i 做了不少工作，但至今为止，我国在生产上推广种植的苦丁茶冬青的种苗，尚没有一个经过省级作物品种审定机构进行技术鉴定的定型品种。各生产单位种植的种苗及其植物学性状和农艺性状千差万别，尤其是一些采用实生苗种植的生产单位，大田植株的各种性状更是五花a i 1 ，产量和品质不能做到稳3定和一致。目前，我国各地推广种植的苦丁茶冬青种苗，最初都是从野生或半野生母树采集种子或插穗，通过播种育苗或扦插育苗而逐代繁殖和扩展开来的。我国现存的苦丁茶冬青母树不少，且分布地域较辽阔，呈零星状态散布于广东、广西、海南等省区的一个广大的地域范围内。由于各地自然条件差异较大，加之长期的地理隔离，各地苦丁茶冬青种质资源在长期的系统发育过程中形成了各自独特的形态特征或农艺性状，表现出丰富的遗传多样性。例如在株型方面，有直立、半匍匐、多枝甚至球型等类型；在嫩芽的颜色方面，从淡绿、微红、浅红、红、深红至紫红等一系列变化；在叶片大小而言，最大者，平均叶片长度达3 5 c m 左右，宽达1 3 c m 左右；最小者，叶片长度平均只有6 5 e r a 左右，宽度平均只有2 7 c m ；从叶尖的形状来看，有渐尖、锐尖、钝尖、尖凹和倒心形等多种情况；从叶缘形态来看，有几近全缘、细锯齿和粗锯齿等几种情况；从叶的全形来看，有长椭圆形、阔椭圆形、倒卵形、倒披针形等几种情况；就抗病性而言，有高抗型、低抗型和高感型等几种类型( 等别是在抗炭疽病方面和抗芽枯病方面) ；就代茶产品的口感而言，有苦甘、纯苦、甘甜、参味、苦涩等多种类型。总之，从海南大学苦丁茶研究所目前从华南、西南及华中( 部分地区) 等地所收集的苦丁茶冬青种质资源材料来看，我国苦丁茶冬青种质资源的遗传多样性是非常丰富的，某些居群的遗传差异甚至极为显著。这些具有不同性状的材料是育种工作者今后开展苦丁茶冬青育种工作和其他科研工作宝贵的种质资源。与此同时，在这种丰富的遗传多样性背后，又有许多困难、问题、甚至难题，是今后开展苦丁茶冬青育种工作时必须解决的。例如，这些性状本身的遗传变异规律是什么? 它们之间又有何种联系? 这些性状与种质材料的起源地域又存在何种联系? 等等。这些问题能否解决，关系到对育种材料的选择效率和整个育种进程。因为育种工作者，特别是在从事传统的有性杂交育种工作时，对育种材料的遗传背景的了解是十分重要的。本课题拟采用r a p d 技术从分子分类学角度系统地研究我国苦丁茶冬青种质资源材料及其相关的近缘种质材料的退传差异和亲缘关系，以及这些材料与其起源地域的相关性，并从分子分类学的角度探讨某些类群的分类学地位。4 应用r a p d 技术研究冬青属苦丁茶种质资源的重要意义r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i ed n a ，随机扩增多态性d n a ) 是2 0世纪9 0 年代初由w i l l i a m s 和w e l s h 同时发展起来的一种新的遗传标记技术 z s - 3 ，它是建立在p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应) 基础上，利用人工合成的较短的随机系列寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，对基因组d n a进行扩增而显示出多态性的d n a 图谱f 2 8 “。r a p d 分析具有快速、简便、灵敏度高、实验成本低廉等优点，只需痕迹量的d n a 模板就可以进行分析，它可以为研究者快速高效地提供基因组位点的多态性资料，故这种方法对于大群体的遗4传多样性分析更显出其优越性f 3 “。r a p d 分析的另一个重要优点是其引物的通用性强，可以用一套随机引物来检测各个分类单位的个体。它既不象p c r 那样需要预先知道基因组d n a 的部分序列，也不象r f l p ( r e s t r e c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，限制性片段长度多态性) 那样，需要进行同位素杂交和s o u t h e r n印记。因此，在短短的几十年中，r a p d 技术已被广泛应用于遗传图谱的构建1 35 3 6 】、分子标记的寻找i3 1 删埘一“”1 、遗传多样性的检测【3 p 4 0 , 4 2 , 6 1 】、种间关系的确定【4 6 叫9 5 3 叫和种下划分等分类学问题h 5 1 的研究，以及相关的研究领域中。例如，我国学者彭建营利用r a p d 技术对1 4 个枣( z i z i p h u sj u j u b a ) 品种和个野生种泰山酸枣( z s p i n o s u s ) 的遗传变异进行了研究，根据d n a 扩增结果计算了品种间的遗传距离，并用u p g m a 构建了聚类树状图。分析结果表明，龙爪枣( zj u j u b av 扎t o r t o u s a ) 、葫芦枣( z ，u j u b av a t 1 a j i n i f o r m i s ) 无核枣( z f u j u b av r g a n u c l e a t u s ) 等几个变种内的遗传距离大于变种问的遗传距离，故认为经典的形态分类学中的关于枣的变种划分是不自然的，应并入其原变种；枣种下不宜设变种，对枣种下的众多品种，应根据品种间的遗传关系，直接划分品种群【”1 。又如我国学者林伯年等对杨梅属植物的2 4 个材料进行了r a p d 带型及聚类分析。结果表明，r a p d 技术能够将起源于北美中心的蜡杨梅与起源于中国的3 个种明显区分开来；而起源于中国的3 个种各自聚类，各材料之间都有不同的遗传距离p 2 1 。以上实例可以充分证明，r a p d 分析的结果也可以作为种级水平和种下划分的分类鉴定依据而用于冬青属苦丁茶种间及种内不同种质材料之间的遗传差异、亲缘关系及分类鉴定的研究。在冬青属苦丁茶的分类学研究领域内，有若干尚未定论的问题或有争议的问题，可以应用r a p d 技术得以解决，或者可以用r a p d 技术对某些关于冬青属苦丁茶的经典分类学研究结论予以验证，或应用r a p d 技术从分子分类学的角度提出有说服力的观点。例如：我国苦丁茶冬青的野生种质资源主要有海南、广东大埔岌头、广东英德石灰埔、广东清新石潭、广东肇庆鼎湖山、广西南宁地区( 含大新、马山、龙洲、宾阳、武鸣、大化等县及周边地区) 等几大居群，居群内各种质材料的形态差异较小，居群间的差异则较大。这些居群之间的亲缘关系如何? 是否可将某些具极显著特征的居群划分出一个种下的分类单位? 在苦丁茶冬青与五棱冬青之间存在某些过渡类型或中间类型，其分类学地位又如何确定? 关于苦丁茶冬青的分类学地位问题，至今尚有争论，不同学者对其所作形态学描述往往相互矛盾，或者由于不同学者描述时所依据的标本不同，对某些性状所表达的特征与种质材料的实际情况相差很大。例如主茎与分枝的夹角，花性与开花习性，一年生幼枝、嫩芽表面是否被柔毛等等。这些差异是否影响到种质材料的分类地位? 以上这些问题，均可应用r a p d 技术从分子分类学的角度加以探讨。冬青属代茶植物种类繁多，而且异物同名现象非常普遍。在引种和推广种植5过程中，繁殖体( 种子、幼苗、插穗等) 种名的认定至关重要，往往是决定产业开发能否成功的关键。例如广西马山县等地不少专业户繁育的种苗中，往往将五棱苦丁茶种苗作为苦丁茶冬青种苗推销，或将一些介于五棱苦丁茶与苦丁茶冬青之间的一些中间类型的种质材料通过扦插育苗后在生产上推广种植，或夹在苦丁茶冬青种苗推广种植。幼苗阶段这些种质材料的形态差异很小。进入投产期后才发现种苗不对，此时己造成较大的经济损失。如果在种子或种苗的经营过程中出现与物种认定相关的法律纠纷，欲通过经典的植物分类学手段确定学名，往往需要在标本有花果的情况下才能准确地做出结论，只凭种子、幼苗或插穗一般难以认定一个物种，尤其是要区分近缘物种、变种或变型时就更为困难。r a p d 分子标记技术只需利用种子刚刚萌发的幼根、幼芽或插穗的幼根和刚刚萌发的腋芽作为实验材料即可鉴定到物种，甚至可以指出供试材料的所属的种下分类群或起源地域。这种方法不仅准确可靠，而且省时，不受植株年龄和生长季节的限制。在海南大学苦丁茶研究所已创建的冬青属苦丁茶种质资源库的基础上，建立一套成熟的r a p d 实验技术体系，对该种质资源库内所保存的冬青属各种苦丁茶种质材料进行系统的r a p d 分子标记和聚类分析，可望清楚地揭示冬青属苦丁茶同一物种内不同种质材料之间以及不同物种的冬青属苦丁茶种质材料之间的遗传距离、亲缘关系以及分类地位。这不仅有利于育种工作者充分了解育种材料的遗传背景，以便选配杂交亲本，或预测杂交后代生长优势的强弱，或预测育种材料的抗病力强弱，而且有利于在生长早期筛选或淘汰某些育种材料，从而在分子水平上找到一条提高选择效率和加速育种进程的捷径，同时还可以为解决冬青属苦丁茶分类学研究领域中的一些有争议的问题或尚未定论的问题提供一种有效的研究手段。1 试验材料材料与方法本研究使用的试验材料均取自海南大学苦丁茶研究所的种质资源圃，其中用于p c r 反应体系与实验条件优化研究的试验材料为一份代号为c 一7 0 的苦丁茶冬青的嫩芽。其他用于r a p d 分析的两项试验材料亦为嫩芽，其资源代号、物种名称、原产地等具体情况分别如表2 和表3 所示。表2 用于r a p d 分析的2 2 份冬青属苦丁茶种质材料t a b l e22 2g e r m p l a s m m a t e r i a l so f “k u d i n g c h at e a ”i nh o l l yu s e df o rr a p da n a l y s i s序号材料编号物种原产地序号村料编号物种原产地s u m b e rc o d e so fs p e c i e so r i g i nn u m b e r 。o d 。o is l _ m i c so r i g i nm a t e r i a lm a t o l1 1 1w k - i “嘲砘弘k海南白沙4w k - 6l k u d i n g e h a广东清新2w k - 2l k l m i n g c h a广东英德5w k 一7l k u d i n g c h a广东清新3w k - 3l k u d i n g c h a广东英德6w k 1 0i k u d i n g e h a广东大埔7w k - i ll k u d i n g c h a广东大埔8w l l5 ?广西马山9c - 1 5 2 *?广西犬化1 0c - 1 5 3 *?广西大化1 1c i5 6 *?广西大化1 2w l - i1 p e n t a g o n a广西大新1 3w l - 41 p e n t a g o n a广西丈新1 4w l - 5l p e n t a g o n a湖南湘西1 5w l - 6 如删嵋 硼口湖南湘西】6d - 1l l a t l f o l i a浙江淳安7d - 3l l a a f o l i a浙江缙云1 8d _ 4l i a r 晌a浙江永康1 9d - 91 1 a a f o l i a浙江磐安2 0g l厶埔“t a海南海口2 1g - 3a c o r n u t n湖南祁东2 2g - 41 。o r n u t a湖北宜昌女：表示形态上介于五棱冬青与苦丁冬青之间的中问型种质材料表3 用于r a p d 分析的6 9 份苦丁茶冬青种质材料及近缘种质材料t a b l e 36 9g e r m p l a s mm a t e r i a l so f 胝k u d i n g c h ac j t s e n g a n dc l o s er e l a t i o n a lg e r m p l a s mm a t e r i a l su s e df o rr a p da n a l y s i s序号材料编号物种原产地序号材料编号物种原产地c o d e so fc o d e so fn “m b ”m e r i a ls p e c i e s0 r i g i nn “m ”m a l 。r i a is p e c i e s0 r i g i n1g - 0 8l k u d i n g c h a广东大埔2 - 1 0l k u d i n g c h aj j 衣大埔3_ 1 1l k u d i n g c h a广东大埔dw 一1 2l k u d i n g c h a广东大埔5c - 8 4l k u d i n g c h a广东大埔6c - 8 5l k u d i n g c h a广东大埔序号材料墒号物种原产地序号材料端号物种康产地c o d e so fc o d e so fn u i b ”- a t e r i l _ * i g i “n u ”m a t e r i a l驴k0 r i e i n7c 一8 6l h 幽神_广东大埔8c - 8 8l h 舶g c 4广东大埔9c - 8 9上h 幽静b广东大埔1 0c - 9 1 | h m n 群hr 蓉大埯i lw - 0 3l h d i n g c h a广东英德1 2g - 0 4l k u d l n g c h a广东英德1 3c 一7 01 3 m d l n g c h a广东英德1 4c - 7 1l i o _ d l n g c h a广东英德1 5c - 7 2l l m d i n g c h a广东英德1 6c - 7 3l k u d l n g c h a广东英德1 7c - “l k u d i n g d m广东英德1 8c 一7 5l l o _ d i n g c h a广东英德1 9c 一7 6l k u d n g e h a广东英德2 0c 7 7l l m d l n s e h a广东英麓2 1w - 0 5l m d n g c h a广东清新2 21 1 - 0 6l a - d i n g c l m广东清新2 3c - 7 8m 幽l 弘h广东清新2 4c 一7 9 h 幽i 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