发酵车间染菌问题的研究.doc

发酵车间染菌问题的研究陈亮 （浙江医药股份有限公司新昌制药厂）摘要：针对微生物发酵车间生产中的染茵问题，分析其检查方法及主要原因，并结合生产实际提出相应的防止措施。一旦发生染茵，及时采取补救措施，把发酵染茵造成的损失降到最小。关键词：染茵；检查方法；原因分析；防止补救措施Discussion of Infection Occurred in fermenting roomChen Liang(Zhejiang Medicine Co.Ltd.Xinchang Pharmaceutical Factory)Abstract：With respect to the problem ofinfection occurred in microbial fermenting room, the method of examination and the primary causes were analyzed in this article. The protection method combined with the practice of production was pressented. Thus, the remedial method can be taken an the loss can be limited to as low as possible degree when infection takes place.Keywords： infection ；method of examination； causeanalysis； remedialm 困扰微生物发酵的一个问题，就是染菌的问题，发酵过程通常是微生物纯种培养过程，培养过程中只允许特定的微生物生长，如果发酵过程中除目的菌外还有其他微生物存在，就视为染菌，染菌严重影响目的菌的生长，导致发酵失败。今天大面积染菌的问题已经基本解决了，零星罐染菌的现象，仍时有发生，造成染菌的原因很多，尤其是无菌程度高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。本文结合企业实际生产情况，综合6年来积累的车间生产实践经验，谈谈染菌原因的分析、检查方法、染菌后的补救措施和防止措施，重点谈谈防止措施，供同行参考。1. 染菌的检查方法 检查杂菌的方法要求准确可靠和快速，在发酵过程中对杂菌污染的及早发现，及时处理，是免除染菌造成严重损失的重要问题。因此，要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染，目前常用方法主要有以下几种：11显微镜检查法通常用革兰氏染色法，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。若发现与发酵菌不同形态的微小球菌、不动长杆菌、游动杆菌等，说明己感染杂菌。12平板划线培养检查法培养基为营养琼脂，将其配好后121湿热灭菌2530min，然后冷却到4550倒入培养皿，冷却后置于37恒温箱内无菌培养24h，挑出无菌落出现的平板备用。将要检查的样品划线接种，置于37恒温箱内培养24h后观察。如发现有霉菌，黄色、白色等非无色透明有粘连性的菌落出现，说明己染菌。噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并 保持摄氏40度，加生产菌作为指示菌和待检样品混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经1220h培养，观察有无噬菌斑。培养基（PH7.0）葡萄糖（%）牛肉膏（%）蛋白胨（%）氯化钠（%）琼脂（%）上层0.51.01.00.51.0下层0.51.01.00.52.01.3肉汤培养检查法 将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置摄氏37度培养24h，进行观察，并取样镜检。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨0.8%，1%酚红溶液0.4%，PH7.2。用以上的检查方法检查未发现污染，还不能肯定未被污染。 除以上方法外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、PH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。2染菌原因的分析 在发酵染菌之后，必须分析染菌原因，总结发酵染菌的经验教训，把发酵染菌消灭在发生之前，防患于未然，是积极制服发酵染菌的最重要措施。造成发酵染菌的原因很多:2.1根据染菌的时间分析 早期染菌，很可能是由于种子带杂菌，操作不当，培养基或设备灭菌不彻底所致；中后期染菌，多数是 由于空气系统带人、设备渗漏、中间补料或取样操作不当等原因引 起 的 。2.2根据染菌的类型分析 染有耐热性芽孢杆菌：多数是由于培养基灭菌不彻底或设备存在死角所致。染有小球菌 、酵母菌等不耐热菌：主要是空气过滤系统不严，阀门渗漏，蒸汽冷凝水进入等原因。染有霉菌：多数是由于灭菌不彻底或无菌操作不严所致。2.3根据染菌的范围分析大批发酵罐均发生染菌，若发生在早期，很可能是由于种子带杂菌所引起。若发生在中后期，且污染的是同一种菌，很可能是空气系统除菌不严，过滤效率低，空气带菌所致；或者中间补料系统、油管路系统发生问题所造成的。通常同一产品的几个发酵罐其补料系统往往是共用的，倘若补料灭菌不彻底或管路渗漏，就有可能造成这些罐同时发生染菌现象。另外，采用培养基连续灭菌系统时，那些用连续灭菌进料的发酵罐都出现染菌能是连消系统灭菌不彻底所造成的。个别发酵罐连续发生染菌：多数是由于设备问题造成的。如阀门的渗漏，罐体的破损或法兰垫片老化等所引起。设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象，即第一二批的染菌时间比第一批提早，第三批又比第二批提早。个别发酵罐偶尔染菌的原因最为难查，各种染菌途径都可能引起。如接种、合瓶、刮剁面制备菌悬液等操作过程无葡控制不好，培养基、设备、管道灭菌不彻底等，均可使单个罐批发酵失败。3.杂菌污染途径及预防3.1种子带菌及防止 种子带菌的原因主要有以下几方面：（1）培养基及用具灭菌不彻底菌种培养基及用具灭菌均在灭菌锅中进行，造成灭菌不彻底主要是灭菌时锅内空气排放不完全，造成假压，使灭菌时温度还达不到要求。（2）菌种在移种过程中受污染 菌种的移接工作是在无菌室中，按无菌操作进行。当菌种移接操作不当，或无菌室管理不严，就可能引起污染。因此，要严格无菌室管理制度和严格按无菌操作接种，合理设计无菌室。（3）菌种在培养过程或保藏过程中受污染 菌种在培养过程和保藏过程中，由于外界空气进入，也使杂菌进入而受污染。为了防止污染，试管的棉花塞应有一定的紧密度，不宜太松，且有一定长度，培养和保藏温度不宜变化太大。每一级种子培养物均应经过严格检查，确认未受污染才能使用。3.2无菌空气带菌及防止 无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计，过滤介质的选用和装填，过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。3.3培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防止 培养基和设备灭菌不彻底的原因，主要与以下几个方面有关（1）原料形状 一般稀薄的培养基容易灭菌彻底，而淀粉质原料，特别是有颗粒时，容易由于灭菌不彻底，造成染菌。淀粉质培养基灭菌以采用实罐灭菌为好，在升温时先搅拌混合均匀，并加一定量的淀粉酶边加边液化。（2）实罐灭菌时未充分排除罐内空气 实罐灭菌时，罐内空气未完全排除，造成“假压”，使罐顶空间局部温度达不到灭菌要求，导致灭菌不彻底而污染。为此，在实罐灭菌升温时，应打开排气阀门及有关联接管的边阀、压力表接管边阀，使蒸汽通过达到彻底灭菌。（3）培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染。培养基连续灭菌应严格控制灭菌温度，最好采用自动控制装置。（4）设备、管道存在“死角” 由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不能到达彻底灭菌的要求。这些不能彻底灭菌的部位称为“死角”，“死角”可以是设备、管道的某一部位，也可以是培养基或其他物料的某一部分。管道多指法兰连接处等。3.4设备渗漏引起染菌及防止 发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，往往造成渗漏。例如：设备的表面或焊缝处有砂眼，由于腐蚀逐渐加深，最终导致穿孔；冷却管受搅拌器作用，长期磨损，焊缝处受冷热和振动产生裂缝而渗漏。为了避免设备、管道、阀门渗漏，应选用优质的材料，并经常进行检查。冷却蛇管的微 小渗漏不易被发现，可以压入碱性水，在罐内可疑地方，用浸湿酚酞指示剂的白布擦，如有渗漏时白布显红色。3.5操作问题 上面已指出，在菌种培养过程中，如操作不当会引起染菌。在发酵过程如操作不当也引起染菌，如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染；等等。防止操作失误引起染菌，要加强对技术工人的技术培训和责任教育，提高工人素质，加强管理措施。笔者在生产过程中摸索出预防为丰、突出关键操作、重在工艺和环境管理的解决方法来防止染菌的发生。(1)预防为丰：从保藏菌种到一级罐种子，操作环节多，参与操作的人员也多，一旦染菌，不易查找染菌原因。要想从根本上消除染菌，只有采取预防为主的办法，树立全员无菌意识，根据无菌要求、设备特征和微牛物特性，制订科学的岗位SOP，并严格落实，不能省略操作环节。(2)严格控制关键操作：一级种子制备过程中的各环节的操作人员技术是否过硬，对防止种子罐染菌具有非常重要的意义，尤其是摇瓶种子（斜面种子）制作过程中无菌操作技术人员和一级种子培养基灭菌中操作技术人员，需要具备相当的理论基础和丰富的实践经验。摇瓶种子（斜面种子)制备需要解决的关键技术问题：菌种制备过程中首先要保证配制的培养基没有较大颗粒，培养基灭菌时要保证蒸气流动，并做到压力计和温度计的准确一致性，防止假压形成。为防止灭菌后培养基二次染菌，应尽量做到培养基即灭菌即使用。无菌操作时保证无菌室用前彻底灭菌，所用器具不带菌。操作时无菌物品在上风处，带菌(或可能带菌)物品在下风处；操作人员少说话，避免咳嗽、打喷嚏及其他大幅度动作。一级种子接种(零磅接种)时需要解决的关键技术问题：接种前关闭一级种子罐I爰门窗，使用消毒液(如过氧乙酸)喷雾灭菌；打开接种帽前要用75的酒精擦拭接种帽。接种时倒种速度要快，并保证种子瓶和接种口处于火焰保护之下；接种过稗中排风阀门应关闭，同时向罐内少量通入无菌风，维持正压。(3)加强工艺管理、固定操作人员：种子制备过程中关键环节的环境洁净度不够以及操作人员更换频繁、配合不熟练和责任心不强等是造成一级种子罐染菌率偏高的主要原冈。虽然有岗位SOP，但每个人的操作手法存在细微差别，这是在长期工作中自然形成的，不易察觉和改变，而某些不规范的操作很容易导致染菌，再加上操作人员不是固定搭配，操作项目也不固定，往往使这种隐患暴露不出来，染菌后也分析不出真正原因。冈此，应加强操作的专业化，即在摇瓶种子(斜面种子)制各、一级种子无菌培养基制备和接种三个环节中应吲定操作人员利操作内容，实行一条龙操作管理。(4)加强环境管理(无菌室管理)：无菌室属局部100级洁净区，其管理除按照GMP有关洁净区的要求进行外，还应做到两方面：一是每次无菌室使用后用紫外线照射30rain，并用01的新沽尔灭氧乙酸等消毒液对环境及物品消毒；二是每隔一定时间对无菌室进行甲醛+高锰酸钾熏蒸。摇瓶间(斜面培养问)管理：摇瓶问(斜面培养间)是摇瓶种子母瓶(母斜面)、子瓶(子斜面)培养的所，在培养过程中瓶塞上往往会附着尘埃，而在接种、合瓶、刮斜面制备菌悬液等无菌操作过程中拔瓶塞时，灰尘很容易落进瓶内，造成种子带菌。要想实现摇瓶种子（斜面)无杂菌，保持摇瓶间(斜而培养间)的清洁是非常关键的。应当把摇瓶问(斜面培养问)当作亚无菌区进行管擦拭摇瓶间的地面及墙面；在充分消除对培养种子影响的情况下定期用消毒液Ono 1的新洁尔灭、5来苏尔等对摇瓶问进行消毒；定期用紫外线照射消毒。一级种子罐睡环境管理：目前常用压差接种法和零磅接种法进行一级种子罐接种。当采用零磅法接种时，由于罐压瞬时为零，外界空气就有可能从设备的泄漏处(如轴封等)及接种口进入罐内造成染菌。因此，保持一级罐接种区的洁净度也是减少染菌的有效方法。应当做到：一级种子罐最好有单独的区域同其他生产区隔离；保持一级种子罐区的环境卫生，一级种子罐区门窗日常应处于密闭状态，每次接种前30 min用消毒液喷雾消毒；环境定期用(810mL甲醛和45 g高锰酸钾熏蒸消毒1216h。减少活菌体排放，发酵废液及洗罐水等处理后排放，减少噬菌和杂菌生长的机会。（4）树立无菌观念、杜绝操作失误从菌种的各级培养扩大，接种、移种以及原料配比，消毒、培养过程取样、补料到发酵结束，整个过程中各岗位操作人员要切实树立无菌观念，严格遵守无菌操作规定和生产操作规程，从各个环节上保证杂菌不进入发酵系统。彻底杜绝操作失误和技术管理不善引起的染菌。如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。同时加强车间和周边环境的清洁卫生工作，杜绝杂菌的来源和繁殖机会，这对防止杂菌污染也极为重要。4染菌（包括染噬菌体）的处理及补救措施4.1污染杂菌的处理 发酵罐污染杂菌后，依据染菌时间、所染杂菌的危害性及时进行处理，同时对所涉及的设备也要及时的处理。（1）斜面、摇瓶染菌的处理 斜面、摇瓶染菌如是斜面菌种即已染菌，则将此批斜面菌种处理掉，重新选用优良的斜面菌种进行摇瓶接种。若是少部分摇瓶菌种染菌，则将染菌的摇瓶菌种处理掉，未染菌的摇瓶菌种可继续用于种子罐培养；若是大批摇瓶染菌，则需查找原因，重新接种。（2）种子罐染菌的处理 种子罐染菌后都不能往下道工序移种，要及时用高压蒸汽直接灭菌后放下水（3）发酵罐染菌的处理 发酵前期出现严重染菌若发酵液中营养成分仍较高，先实罐灭菌，待温度降到发酵温度后重新接种发酵；若发酵液营养成分较低，补加培养液，进行实罐灭菌，重新接种；若发酵液营养成分很低，无法补救，则实罐灭菌后倒罐。发酵中后期染菌发酵中后期轻度染菌，适当调整发酵温度、搅拌速度、通气量、DH等。加强发酵操作管理，适当提前放罐。发酵中后期严重染菌，若发酵液粘度达到一定要求，并且残余碳、氮源已经不多，则应立即放罐，以免进一步恶化，造成更大损失，并对空罐进行彻底的清洗，灭菌；但有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多，如果提早放罐，这些物质会影响后处理提取，使产品提不出来，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。若发酵液粘度很低，产素率不高，则应倒罐，将发酵液于121灭菌30min后放掉。染菌后的设备处理 染菌后的罐体用甲醛等化学物质处理，再用蒸汽灭菌（包括各种附件设备）。在再次投料之前，要彻底清洗罐体、附件，同时进行严格程度检查，以防渗漏。4.2污染噬菌体的处理 一般噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀，泡沫增多，早期镜检发现菌体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶，最后仅残留菌丝断片，平皿培养出现典型的噬菌斑，溶氧浓度回升提前，营养成分很少消耗，产物合成停止等现象。发酵过程中污染噬菌体后，一般做如下处理 ：一是发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉，严防发酵液任意流失；二是