噬菌体治疗细菌疾病的研究进展.doc

专业外语课程论文噬菌体治疗细菌性疾病的研究进展摘要 噬菌体在被发现之初已经被尝试用于治疗细菌性疾病，后来由于抗生素的出现使之渐渐淡化出人们的眼球，但是对于现今很多细菌都对抗生素有很强的耐药性甚至出现了具有多重耐药性的超级细菌，使得重新重视起噬菌体治疗细菌性疾病的作用。本文主要综述了噬菌体对于治疗细菌性疾病的早期研究和最新进展。关键词 噬菌体 裂解酶 细菌性疾病细菌性感染是感染性疾病中比较常见的类型，如果缺乏及时有效的治疗，严重的话可以导致很高死亡率1。例如每年由弯曲杆菌、沙门氏菌、O157大肠杆菌和单核细胞增多利斯特菌引起的食源性疾病就给人类带来巨大的经济损失和生命威胁。在19世纪初Herelle发现噬菌体（bacteriophage，phage）2,3后，人们就曾经尝试采用噬菌体治疗细菌感染。但自抗生素的出现后人们就渐渐的淡化噬菌体的研究而大量的进行有关抗生素的研究，进而大量使用抗生素作为治疗细菌感染的有效途径，在前期抗生素的确有非常好的治疗效果，然而随着抗生素使用的泛滥，细菌的耐药性问题日益加剧，新抗生素研发的速度远远低于耐药菌产生的速度。由于新型抗生素的发现越来越困难，噬菌体治疗重新得到人们的重视，并且取得了一些不错的研究成果。1 噬菌体及裂解酶的概况噬菌体( Bacteriophage，简称phage)又叫细菌病毒，是一种可以侵入细菌细胞内，通过酶的用破坏细胞壁，使细菌裂解从而将其杀灭的病毒。噬菌体分为烈性噬菌体和温和性噬菌体，前者可在敏感宿主菌内增殖并使之裂解，亦称为毒性噬菌体（virulent phage）。噬菌体裂解酶( Lysin或Endolysin)是双链DNA 噬菌体所特有的、在病毒复制晚期合成的一类胞壁质水解酶。多数噬菌体具有编码3种细胞壁水解酶的基因，分别为裂解酶、酰胺酶和内肽酶，其中酰胺酶是国内外研究比较多的一种裂解酶。裂解酶的高亲和性与种属特异性的细胞壁糖基有关，而后者常常是细菌存活的必要成分。因此，细菌很难产生对裂解酶的抗性。2 噬菌体的研究历史回顾人们曾尝试用噬菌体治疗痢疾、手术伤口的皮肤感染,采用口服、局部外用、滴眼耳鼻等多种给药途径，治疗效果较好4。Bruynoghe和Maisin于1921年率先用噬菌体制剂治疗皮肤葡萄球菌感染5。1934年美国科学家就报道了噬菌体疗法抗肠球菌感染的成功率可达80%。近期各国研究者进行的动物试验及临床应用结果表明, 噬菌体治疗的效果是值得肯定的并且其效果受使用剂量和用药时间的限制较小。Smith等6用噬菌体治疗感染了大肠埃希氏菌的小鼠模型,结果发现给予1次后，小鼠体内的大肠埃希氏菌数量即下降，小鼠全部存活下来。在随后的研究，Smith发现利用专一性噬菌体可治疗由大肠埃希氏菌引起的猪、牛和羊的腹泻，所有经噬菌体治疗的动物都存活下来。所以噬菌体不失为一种安全性和治疗性都较好的药物。2002年, Bisw as采用耐万古霉素的肠道球菌对老鼠进行感染, 45m in后腹腔内注射一定剂量的噬菌体。保护力达到100%。即使在老鼠处于濒死状态的时候才注射噬菌体, 其保护力仍有50%。而没有进行噬菌体治疗的老鼠48h后几乎全部死亡。Bull等7 也证明, 即使是在小鼠感染后8h才使用噬菌体对其治疗仍不影响治愈率, 但使用抗生素治疗的小鼠成活率却大大降低。同时，大量的人体试验也证明了噬菌体治疗的安全性。2005年，Bruttin等进行的双盲试验证明口服肠杆菌噬菌体T4的受试者没有出现副作用，而且他们体内用于诊断肝脏受损的两种酶也在正常的水平。波兰Hirszfeld研究所在长达30年间用噬菌体治疗各种致命性感染(主要是耐药菌感染)的病人近2000名，治愈率在60% 90%之间，同时也为临床噬菌体治疗的应用提供了最详尽的参考资料8。3 噬菌体治疗细菌性疾病的特点首先，从噬菌体的特性来看，噬菌体可以随宿主菌的增殖而增殖，并在细菌感染的整个过程中发挥作用，而不像抗生素那样随着时间的推移疗效逐渐降低9。其次，在解决耐药性问题上，噬菌体具有高度的宿主特异性，可以杀灭特定的菌型，并可以减轻由于用药所带来的体内菌群失调，同时减少由之所带来的耐药性问题，其原因是噬菌体能靶向到达细菌表面受体，从而弱化耐药突变。另外噬菌体可以单独使用，也可以与其它抗生素联合使用以减少耐药性问题。第三，从应用方面来看，噬菌体的副作用很小。对于那些对抗生素敏感的人来说，噬菌体制剂更是一种理想的治疗途径。准确选择相应的噬菌体也可作为预防用制剂。而且噬菌体制剂获取比较方便，价格比较低廉。但是应用噬菌体进行治疗也很大的局限性10。活噬菌体制剂治疗细菌性感染所面临的最主要障碍是宿主专一性太强，宿主谱太窄的问题。自然分离的噬菌体都具有高度专一的宿主选择性，往往只能感染单一的细菌分离株，而不能感染同一种细菌的其他分离株。这种高度专一的宿主选择性使噬菌体的应用受到极大的限制。通过大量的筛选或者一些其他措施能够在一定程度上提高噬菌体的感染谱，但这些常规的手段费时费力, 而且效果十分有限。4 应用裂解酶治疗的特性噬菌体裂解酶在噬菌体裂解细菌的过程中水解细菌肽聚糖破坏细胞壁以释放子代噬菌体，作为潜在的新型杀菌物质，具有活噬菌体制剂和抗生素无法比拟的优势。例如：噬菌体裂解酶使用与抗生素完全不同的杀菌机制，其受体识别结构域可引导裂解酶与其特异性底物结合，催化结构域则负责水解肽聚糖中的化学键，特异性底物为细菌细胞壁的某些糖类，这些糖结构在细菌进化过程中十分保守，因此细菌对噬菌体裂解酶产生耐药性的几率远远小于抗生素。噬菌体裂解酶不仅可以用于耐药菌感染后的治疗，还可用于细菌感染前的预防而不用担心细菌抗药问题恶化。噬菌体裂解酶优于活噬菌体制剂的一点是，噬菌体需在受体识别蛋白特异性识别并吸附细菌表面受体的前提下侵入细菌进而才能裂解细胞，而噬菌体裂解酶不需要该过程，因此，噬菌体裂解酶的杀菌谱比噬菌体要相对宽泛。例如：以C型链球菌为宿主的噬菌体C1的裂解酶对A、C、E型链球菌均有很强的杀灭作用，而对B、D、F、G、L、N 型链球菌及大肠杆菌等其它细菌没有作用该发现说明噬菌体裂解酶的作用范围比噬菌体的宿主范围要广，但也局限于同属细菌。与抗生素不同，噬菌体裂解酶作为蛋白质在体内使用可能引起免疫反应，但兔子和小鼠实验表明，经多种噬菌体裂解酶免疫后产生的抗体不足以使相应的酶失活，也没有发现过敏反应和严重的副作用，而且，噬菌体裂解酶对细菌发挥作用极其迅速，虽然其在体内半衰期很短，但足以使其杀死细菌11更为重要的是，能编码噬菌体裂解酶的ds-DNA噬菌体在自然界中广泛存在（据估计多达1030）。虽然噬菌体裂解酶的作用范围比噬菌体的宿主范围要广，但也局限于同属细菌，一种噬菌体裂解酶通常仅能裂解其宿主菌株或同一种内的菌株11，也有一小部分噬菌体裂解酶能够裂解宿主菌种以外的一些菌株12。与活噬菌体一样，噬菌体裂解酶的应用同样受限于其特异性，因此如何扩大噬菌体裂解酶的杀菌谱仍然是一个仍待解决的问题。同时，如何保证噬菌体裂解酶的高活性与高产量也是将其应用于治疗必须要解决的问题。噬菌体裂解酶在体外很容易裂解革兰氏阳性菌的肽聚糖，但革兰氏阴性菌的肽聚糖被厚厚的外膜包围，所以仅有为数不多的噬菌体裂解酶能够裂解它们。造成严重临床感染的很多致病菌是革兰氏阴性菌，因此如何对噬菌体裂解酶进行修饰使其穿过外膜裂解肽聚糖是利用裂解酶控制革兰氏阴性菌感染必须要解决的问题。5 基因工程在噬菌体治疗上应用现在基因工程技术日趋成熟，我们可以利用这种技术改造噬菌体以克服专一性过强，宿主范围窄，裂解的活性低等问题。2007年，Garcia13等首先在乳中分离出温和性噬菌体，经过随机缺失，使之转化为烈性噬菌体。然后将噬菌体用于乳制品加工过程中金葡菌的控制，收到了良好的效果。2009年，Mahichi等利用同源重组技术用宽宿主谱噬菌体IP008的g37和g38替代T2噬菌体的相应基因，得到的重组噬菌体获得了与IP008相同的宿主谱，并保持了其裂解活性。这些研究表明，通过遗传改造噬菌体的宿主识别基因可以人为改变噬菌体的宿主谱。6 展望噬菌体制剂控制细菌感染显示出了一定的治疗前景，病原菌广泛的耐药性也迫切需要另辟蹊径征服这种威胁。因此，噬菌体的治疗或者联合抗生素治疗可能会成为一个非常有价值的途径。值得注意的是，为了噬菌体治疗的安全性和可控性，对噬菌体的生物特性、特异性噬菌体与宿主菌的相互作用关系，特别是体内的作用系统，要求更加详细、明确的试验证明。然而，到目前为止噬菌体对细菌的易感性认知大多是基于体外水平的，噬菌体和细菌在体内是如何作用的，细菌在体内又是如何逃避噬菌体的裂解等方面，还需要更多研究。参考文献：【1】 噬菌体治疗细菌性感染的进展 【2】 Sulakvelidzea A, Alavidze Z, Morris J G. 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