基因工程实验指南.doc

生物技术大实验实验内容一、 质粒DNA的提取二、 质粒DNA的检测三、 DNA重组技术酶切、连接四、 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化五、 重组质粒的筛选实验一、质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。二、实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、主要试剂1 溶液50 mmol/L 葡萄糖5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl(pH 8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH 8.0）0.5 M EDTA：93.05g EDTA.Na2，8g NaOH，充分溶解后调pH值至8.0 （灭菌）。1M Tris-HCl（1000 mL）：121.1g Tris，49 mL浓HCl，充分溶解后调pH值至8.0（灭菌）2 溶液 0.4 mol/L NaOH， 2% SDS，用前等体积混合（新鲜配制）3 溶液 5 mol/L 乙酸钾 60 ml冰乙酸 11.5 ml水 28.5 ml4. TE 缓冲液10 mmol/L Tris.HCl1 mmol/L EDTA(pH 8.0)5. 70%乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）6. RNase将RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mgml的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，保存于20。7. LB+Amp100培养基：LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60时加入。四、仪器耗材恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。五、实验步骤 （一）细菌的培养 将含有pUC19质粒的大肠杆菌，在LB+Amp100培养基平皿上划线，获得单菌落。（37培养过夜）(二) 质粒提取1. 将2 mL含Amp（100ug/mL）的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌（单菌落），37振荡培养过夜。2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min 离心2 min。3. 倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4. 将细菌沉淀悬浮于100 uL溶液中，充分振荡混匀，室温放置5 min。 5. 加200 uL溶液 （新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物，将离心管放冰上5 min 。6. 加入150 uL溶液 （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置5 min 。7. 12000 r/min ，离心15 min ，将上清转至另一离心管中。8. 向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀，10000 r/min，离心10 min，将上清转移到另一离心管中。9. 向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置1520min。12000r/min离心 10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。10. 用500 L 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。11. 加入适量（30 L）的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解，20保存。实验二、质粒DNA的检测一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。二、实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称 CCCDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，（open circular DNA， 简称OCDNA）；线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。 三、主要试剂1. 10 x TAE (10倍体积的TAE储存液) 配 1000mL50 x TAE： Tris 242g 冰乙酸 57.1ml 0.5 mol/L EDTA 100 ml pH 8.0 2. 凝胶加样缓冲液（6x）溴酚蓝 0.25蔗糖 40 3. 琼脂糖（1%）：称1g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入100 mL 1TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其冷至60左右，倒入封好的电泳板上。 4. 溴化乙锭溶液 (EB) 0.5 g /mL。四、仪器耗材电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、移液枪一套、微波炉。五、实验步骤(一) 制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度 线状DNA的有效分离范围Kb0.3 5 600.6 1 200.7 0.810 0.9 0.571.2 0.4 61.5 0.242.0 0.13称取0.1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入10mL 1XTAE缓冲液，至微波炉加热至完全溶化，取出摇匀，则为1的琼脂糖凝胶液。 （二）胶板的制备1. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好。2. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3. 将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。4. 待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。5. 加入电泳缓冲液至电泳槽中。 （三）加样将样品5uL与上样缓冲液1uL混合，用移液枪将该混合样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。同时加入DNA marker和购买的pUC18质粒作为对照。 （四）电泳1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。 2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。（五）染色将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（0.5mg/mL）中，染色以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）。(六) 观察六、注意事项1EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。2. 6 e/ X2 i6 k: Y8 a$ j当EB太多，胶染色过深,DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30分钟后再观察。3电泳时注意导线正负极，防止接反。思考题：1. 如果一个DNA 酶解液在电泳后发现DNA 未被切动，你认为可能是什么原因？2. 琼脂糖凝胶电泳中DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？ |, e( 5 ) ?1 . w+ q附：质粒提取及检测的实验结果与分析1. 质粒沉淀离心后，在管底能见到少量白色物质。2. 真空干燥后，无色，贴于管壁。3. 加ddH2O或TE能迅速溶解。4. 电泳凝胶上呈现一条亮带。5. 如果质粒提取中降解，则会出现上下三条带，分别代表超螺旋、带切口和带切刻的质粒。6. 溶解时不加RNase，则下部会有很亮的一片，为小分子RNA片段。7. 质粒中含太多杂质，则干燥后会呈白色或褐色，不易溶解。8. 电泳时，吸取可溶的部分，勿取沉淀。实验三、DNA重组技术酶切、连接（一）酶切一、实验目的通过酶切获得可进行体外重组的载体和外源DNA。二、实验原理DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用链接酶将其连接，构成新的DNA分子。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列:5- GAATTC-3)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端， 如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5GAATTC3 5 G AATTC33CTTAAG 5 3 CTTAA G5限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37)。对质粒DNA酶切反应而言， 限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg DNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象DNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 三、主要试剂 DNA、EcoR I、质粒（pUC19）、无菌水、70，100酒精、3Mol/L KAc(pH5.2)、 ice、琼脂糖、溴酚蓝、TE 、TAE、EB、DNA marker.四、仪器耗材水浴锅(37)、灭菌锅、离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、移液枪一套、微波炉。五、酶切反应 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。反应体系 1. PUC 4ul (0.5ug/ul) buffer 1ul EcoR1 1ul (15U/ul) H2O 4ul - Total 10ul 反应体系 2. DNA 4ul (1.5ug/ul，0.4ug/ul) bf 1ul EcoR1 1ul H2O 4ul - Total 10ul37，2hr；终止反应 65 10min。六、注意事项1、 限制性内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。2、 10x bf工作浓度为1x，注意混匀。3、 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。4、 ) S: + a/ w5 ( N5 F# * a; b3 y酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。5、 1 _5 b # u+ ?7 $ b6 |5 Q8 V/ O, C: s H7 g: I) d) P如果反应较长时间而酶切体系又很小比如10微升，那么哪怕用PCR小管做反应，体积损失也会很大。采用石蜡油覆盖的方法可避免水分损失甘油浓度提高而引起的星活性。& O; c$ H86、 混合：这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡。（二）电泳检测各取2ul酶解液，电泳检测。EcoRI切割DNA后电泳得到6个片段，长度分别为 21.2， 7.4， 5.8， 5.6， 4.9 和 2.5kb（三）连接一、实验目的 体外连接获得重组分子，用于转化受体细胞。二、实验原理质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段， 然后体外使两者相连接， 再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。但在实际工作中， 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例，可以将载体的自身环化限制在一定程度之下，也可以进一步采取一些特殊的克隆策略，如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化，还可以利用遗传学手段如互补现象等来鉴别重组子和非重组子。外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物， 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度， 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉， 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补 平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配， 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶的klenow大片段部分填平3凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。三、 主要试剂 T4 连接酶、无菌水、PUC/DNA（酶切产物）。四、仪器耗材 微量移液枪，Tip、eppendorf管。五、 连接反应 PUC (酶切产物) 5ul DNA (酶切产物) 5ul T4 ligase 1ul 10x bf 1.5 ulH2O 2.5 ul -Total 15ul六、注意事项进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为Ligase酶很容易降解。一般14-16,O/N. 实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的 获得感受态细胞；制备含有目的片段的克隆。二、实验原理在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R，M)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法使用更广泛。转化率的计算：统计每个培养皿中的菌落数。转化后在抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数稀释倍数转化反应原液总体积/涂板菌液体积转化频率（转化子数/每ug质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量（ug）感受态细胞总数=对照组2菌落数稀释倍数菌液总体积/涂板菌液体积感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数为了提高转化效率， 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH-5菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。3. 试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行， 所用器皿， 如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染， 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以E.coli TOP10菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC质粒共保温，实现转化。由于pUC质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了pUC。三、主要试剂0.1 mol/L CaCl2 （灭菌）、无菌水、冰、LB液体培养基（胰蛋白胨、酵母粉）、氨苄青霉素（Amp）、温控摇床。四、仪器耗材控温摇床(37)、冷冻离心机、水浴锅、冰箱（-20，70）、超净工作台 培养箱(37)、分光光度计、液器、枪头、离心管、三角瓶、6cm平皿、酒精灯 三角玻棒、酒精棉球、火柴五、实验步骤 实验材料：E.coli.（TOP10）、重组质粒第一天： 从大肠杆菌TOP10平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基的试管中，37振荡培养过夜。 第二天：1. 取0.5 mL菌液转接到一个含有50 mL LB液体培养基锥形瓶中，37振荡培养。23 h(此时，OD600 0.4-0.5，细胞数务必 108mL。（此为实验成功的关键)2. 将菌液转移到1.5 mL离心管中，冰上放置10 min。3. 离心10 min（4000r/min），回收细胞。44. 倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。5. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2 0.5 mL悬浮沉淀，立即放在冰上30 min。6. 4 6000 r/min，离心10 min，回收细胞。7. 用冰冷的0.1mol/L CaCl2 0.1 mL悬浮细胞，（务必放在冰上）。8. 分装细胞，每1200 L一份。此细胞为感受态细胞。转化：9. 取100 L新鲜制备的感受态细胞，加入DNA（重组质粒）10 L（50 ng ）混匀冰上放置30 min。10. 将管放到42循环水浴90sec。11. 冰浴2 min。12. 每管加600 L LB液体培养基，37培养1 h（慢摇）。13. 将适当体积（200 L）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。（20uLxgal,4uLIPTG）14. 倒置平皿37培养1216 h，出现菌落。15.计算转化效率六、注意事项 1. 无菌操作。 2. 低温操作。3注意加AMP时的温度，温度不能过高（55-60度），否则加入的抗生素失活，会使克隆