高等真核生物细胞中监测自噬试验方法的解释与使用指南.doc

高等真核生物细胞中监测自噬试验方法的解释与使用指南摘要目前有关细胞自噬的研究持续性地增加，不断的吸引许多新的科学家进入这一领域。因此，在不同的生物机体中建立一套标准的监测巨自噬的准则规定，就具有重要意义。最近的很多文献已经描述了已被使用于这一目的的检测范围。有许多有用并且简便的方法可用于监测酵母巨自噬，但在其他模型系统中相对较少；此外，用于测试高等真核生物的巨自噬，存在很多混淆的但看似可接受的方法。需要强调的一个关键问题在于：在测量监测的自噬体数目与测量那些流过自噬途径的自噬体数目之间，存在一定的差异；这样一来，巨自噬堆积，将导致自噬体的聚集作用，需要从完全功能性自嗜的分化作用，其包括输送和降解，以及溶酶体（在大多数高等真核生物中）或液泡（在植物和真菌中）。本文中，我们提出一套指南，用于对这些方法的选择和解释，可供那些试图检测巨自噬及其相关进程的研究人员使用，此外，那些需要对这些研究过程的文章提供实际与合理的批评意见的审稿者也可以使用。本套指南并不意味着是一种公式化的规则，因为适当的检测方法部分地取决于那些所需要解决的问题和正在使用的系统。此外，我们强调，没有任何的检测方法能保证在各种情况下都是最恰当的，我们强烈推荐使用多种检测方式来验证一种自噬反应。关键词自噬泡 自噬体 通量 溶酶体 吞噬泡 压力 液泡在第一次自噬与健康和疾病的Keystone研讨会上，一位坐在听众席的研究员在听了若干细节上不充分的与记录自噬相关的报告后，提出了这样一个问题“证明自噬的最关键的准则是什么？”这是一个理性的问题，特别是考虑到我们每个人对这一问题都有可能有自己的见解。不幸的是，对于那些认为自己可能找到了准则的研究人员来说，这些准则似乎是移动着的目标，他们悲哀的发现评论家们有着不同的观点。相反，作为一个评论家，他们反复的提出相同的反对理由，疑惑为什么研究人员没有达到证实自噬过程存在的基本要求。另外，潜在调控自噬的药物越来越多的应用到临床诊断中，而且用于治疗目的的可调控自噬的新药屏障已经建立起来。显而易见的，基于一套可被接受的准则要求下，确认这些药物是否能够真的影响自噬过程十分重要。因此，我们在此提出一套基本的指南，应用这套指南，研究人员可以计划和阐释他们的实验，临床医生可以决定采用那种方法是最合适的，作者和评论员可以支持或批判某一研究成果。在为调控自噬选择最合适的方法构建指南的过程中，有几个基本的要点需要谨记。十分重要的一点是对于监测自噬所处的状态没有绝对的准则适用于所有的情况。这是因为有些检验方式是不适宜的，自身存在缺陷的，或者在特定的细胞，组织或器官内根本不起作用。另外，这些指南也许会作为新的方法论而演变发展，取代现有的检测方法。虽然如此，建立一个可被接受的在多种实验系统下均能可靠调控自噬的方法指南十分有用。需要注意的是，在这套指南里，“autophagy”通常代表巨自噬；其他自噬相关过程会在使用时特殊表明。一个基本的要点是自噬是一个动态的多步骤过程，可以在许多步骤中积极的和消极的调控。从这点来看，自噬的途径和其他代谢途径不存在差别。例如，自噬体的积累（通过电子显微镜图像分析，GFP-LC3荧光亮点分析，或者LC3脂化的western印记分析）可以反映出由于自噬活性的增加引起的自噬体形成的加快或者自噬体消亡的减慢（见图1）。后者是通过抑制自噬体成熟成为自噬泡实现的，抑制是由于自噬体分别脱离了与胞内体或溶酶体的融合，或者是融合后的低效降解而产生的。为了进行综述，自噬过程划分为隔离吞噬泡，自噬体，amphisome（自噬体和胞内体融合的中间囊泡，也可认为是酸性晚期自噬体）和自噬泡（自噬体或amphisomes与溶酶体融合产生的，可以认为是自噬溶酶体）。在这篇评论文章中“phagophore”（吞噬泡）没有暗示自噬体膜的来源的意义。吞噬泡之一术语最初被创造出来是为了指示最初的隔离结构与其他细胞器在形态学上明显不同。其他研究表明自噬体隔离膜的特殊来源最明显的是内质网。实际上，最近的研究工作表明自噬体的形成需要内质网及其他普遍存在的膜结构流经分泌途径。自噬过程中膜的来源的完整理解仍需深入的研究，因此，在本篇文章中提到的吞噬泡仅仅代表一种特殊的结构。对自噬细胞死亡，或者更确切的说与自噬相关联的细胞死亡（因为鲜有例子表明自噬是导致细胞程序性死亡的机制）的相关研究表明，在另一个重要的情况下，就有必要区分是否出现由于抑制与诱导自噬引起的表型缺陷。在某些情况下，这种类型的死亡是由于自噬通量减少，由于抑制自噬体与溶酶体的融合或降解溶酶体功能的缺失。因此，使用自噬的标记分子，如LC3-II，需要补充对自噬通量的全面了解，以保证对结果有一个正确的解释。在这里，人们需要衡量一般自噬过程中蛋白质的分解率，或在一个给定的点阻止自噬通量，在这一被阻塞的时间点记录细胞器，细胞器的标记，底物（cargo）标志分子，或整个底物的时间依赖性积累。按照同样的思路，可以按照时间依赖性减少选择适当的标记。从理论上讲，这可以通过在途径中的特殊步骤中阻断自噬隔离来实现（例如：阻断新吞噬泡的进一步诱导或成核过程），测量在阻断位点之后的标记分子间少量。问题的关键是通过测量“稳定状态”的水平和自噬细胞成分的降解率来区分自噬的形成和积累。两个过程都曾被用来估计“自体吞噬”，但除非实验可以把自噬体数目的变化与直接或间接测量得到的自噬通量（例如，清算底物作为一种直接测量方法，或LC3-II的变化作为一个间接测量测量方法）相关联起来，否则他们可能很难解释清楚。在这里提醒一下要确保术语“稳态”的正确使用。不要认为一个自噬系统处于稳定状态,就意味着自噬体的水平不随时间改变，系统中的通量是不变的。相反,在本文中我们使用的术语稳态是指测量值在本质上是静态。 自噬通量是指自噬的完整过程，包括底物向溶酶体的传送（通过后者与自噬体或amphisomes的融合）及其后续分解和回收利用。因此，增加磷脂酰乙醇胺修饰的LC3（即LC3-II）的含量，或者甚至自噬体的外表不是自噬通量本质上的测量手段，但是依然可以反映自噬的诱导和/或自噬体的抑制或amphisome的清算。此外，一个细胞的降解能力可能随着细胞类型，年龄，转化和/或疾病而变化，可能会决定诱导自噬的结果。最后，重要的是要注意，尽管LC3-II的形成与自噬的诱导相关，但是我们目前不知道，LC3-II的形成和自噬其余过程间的实际机制关系。因此，有必要区分自噬或LC3-II积累，自噬通量之间的关系。 最后，我们强烈建议作者们在表述实验结果时避免使用“%自噬”的表达方式，例如“细胞显示同比增长25的自噬”。相反，指出显示点状GFP-LC3的细胞百分比，或者一个长寿命蛋白质的降解率特定增加或减少，因为这些是能被量化的实际测量方法。 总的来说，我们提出以下准则来在高等真核生物中衡量自噬的各个方面。A 通过稳态的方法调控吞噬泡和自噬体的形成把指南分成稳态和通量两个方面的关键原因是前者虽然能表征自噬的诱导，但是不能确定自噬的整个过程是否完成。这一点十分重要，因为不完整的自噬过程将导致自噬体的积累，从而引起生理上的机能失调。相反，完整的自噬过程将产生细胞保护效应。1.电子显微镜 自噬现象首先是通过电子显微镜发现的。细胞质中心区域的降解通过吞噬泡（一种特殊的光滑，无核糖体的双层膜）隔离开，吞噬泡成熟后成为前溶酶体自噬体是自噬的标志。因此，在分析自噬过程中多种结构的连续性变化时(吞噬泡、自噬体、amphisome和自噬泡)，使用电子显微镜是一种即有效又重要的定性和定量分析方法。从吞噬泡经过自噬体的成熟是一个动态和连续过程，因而把这些结构分类成为形态学上不相关联的类别是存在问题的。幸运的是，在大多数生理和病理情况下，检测早期和晚期的自噬结构产生足够重要的数据来反映整个细胞中的自噬/溶酶体所处的状态。注意 尽管电子显微镜是用于监测自噬的最广泛的方法之一，但是它同时也是最存在疑问的和易于误解结果的方法之一。由于人工加工样品的巨大潜力，谨慎选择适宜的无偏差的量化方法和形态特征/体视学分析十分重要。例如，计数自噬体的剖面是一种较好的办法，然后只计数细胞的一个区域内是否存在自噬体，但是首选的方法用形态测量学/立体测量学的方法确定自噬体体积占细胞质体积的百分比。在量化过程中，确保取样的随机均等性什么重要，这意味着薄层区域内每一个细胞具有相同的概率被计数。可靠的自噬体鉴别方法是有效分析的前提。另外一个难点是，在哺乳动物自噬体的成熟过程中包括一个从双层膜结构过渡到单层膜结构的过程（如amphisomes和自噬泡）。因此，双层膜在确定与自噬相关的结构中不是必要的超微结构证据，而且聘请专家来分析结果十分重要，以避免误解显微照片。即使是在专家中，对真正的自噬体的特征仍有很大分歧。例如，饥饿诱导产生的自噬体应包含细胞质（即细胞质和可能的细胞器），但自噬相关结构涉及特定类型的自噬，如选择性过氧化物酶，或线粒体的退化（分别为过氧化物酶体自噬或线粒体自噬）或有针对性的病原微生物的降解（xenophagy），可能相对缺乏细胞质。此外，一些致病性微生物在感染过程中表达破坏膜结构的因子，破坏自噬体正常的双层膜结构。我们甚至不清楚是该将特定细胞器降解时产生的隔离结构和xenophagy也定义为自噬体，还是应该将其另外分别定义为过氧化物酶体自噬和xenophagosome，尽管它们的膜结构和形成机制与饥饿诱导产生的自噬体相同。确定吞噬小体中原材料来源于自我吞食还是异源吞噬也十分困难；适当的时候，特殊的分析方法可以对吞噬原材料的来源进行评估。无论如何，证明被膜隔离起来的区域里的物质完全被降解十分必要。这是通过证明膜隔离结构（线粒体或粗面内质网潴泡）从完整到相继瓦解直到完全消失的现象完成的。在降解过程中仍保持不离散的事实说明吞噬小体在三维结构上被膜包被。利用传统的免疫细胞化学方法证明在融合后的细胞自噬体内存在溶酶体酶也是可行的。最后，由于内质网的池状结构，包围线粒体或其他细胞器的双层膜结构经常能在剖面观察到，这实际上与内质网潴泡结构出入横剖平面有关。膜上存在的核糖体有助于我们区分出自噬体的无核糖体双层膜结构。在潜在不确定的情况下，需要使用免疫金标签电子显微镜，使用底物蛋白（细胞质来源的；在这种情况下底物不能是大量存在的细胞质蛋白否则背景会很亮，细胞器标记很适用）和LC3的抗体来证实自噬的结构特性。这种方法的成功依赖于抗体的质量，电子显微镜的准备工作和样品的固定化程序。应用免疫电镜时，作者要控制标签是独特的，确保信号在背景下清晰可见。此外,我们建议提供统计信息，因为有必要显示一个选择的多个部分。再次,我们建议为定量数据首选适当的容量分析方法，而不仅仅是对选择的区段进行计数。我们必须牢记，即使是容量的形态测量学/立体测量学分析只显示稳态水平，其本身不能为自噬通量提供信息。另一方面，定量分析表明自噬体的体积在很多情况下与蛋白质的降解率有关。关于电子显微镜的一点附加说明，在一定程度上和共聚焦荧光显微镜一样，分析一个细胞的某一单一部分可能会产生误导并且可能引起自噬结构的识别困难。一个潜在的折中方法是利用荧光显微镜定量整个细胞中的自噬体，然后用电子显微镜来定性确认，显示荧光中亮点的变化反映自噬结构数量上的增加。共聚焦显微镜和荧光显微镜与层层分解分析软件（或者更多的工作，电子显微镜）可以用于产生同一细胞多重/连续的部位来降低这一顾虑，但是这一般不是必要的，因为分析多个细胞的单一部位更方便并且能够提供更多的信息。另外一个值得关注的方法将光学显微镜和电子显微镜联系起来，CLEM，有助于确定荧光标记的结构是自噬体结构。最后，即使是一种间接测量方法，根据自噬体数量与电镜下的自噬泡数量的比值，可以以此来改变其它程序中确认自噬的方法。在这种情况下，经常比较样品和同一细胞类型的控制组，自噬体和自噬泡的比率在一个细胞中的变化依赖于背景的样式，依赖于他们余下的活性。区别自噬体和末溶酶体/第二溶酶体（前者活跃的参与到降解中，而后者在腔内物质的降解过程中已经到达末期）也十分重要，因为当自噬被诱导时溶酶体的数量往往增加。2. Atg8/LC3 western印迹和泛素蛋白结合系统 Atg8/LC3是一种类似泛素蛋白的蛋白，可以与磷脂酰乙醇胺结合。在酵母中，结合形式为Atg8-磷脂酰乙醇胺。在哺乳动物中Atg8的同源物质组成了一个蛋白家族，其中微管相关蛋白1的轻链3（LC3）与我们的讨论关联最密切（在其它体系中，这个蛋白也被称作“Atg8”，但是为了简化，我们称它为LC3，以便其和酵母中的蛋白相区分）。LC3最初是以未加工的形式合成的，前LC3，经过解朊作用切除C端的氨基酸转化成为LC3-I，最终修饰成与磷脂酰乙醇胺结合的形式LC3-II（图2）。Atg8-磷脂酰乙醇胺/LC3-II是唯一一种可靠的与自噬体相关联的蛋白标记，但是也可以在吞噬泡中得到定位。在酵母中，当自噬被诱导时，Atg8的含量至少会增加十倍。然而在哺乳动物细胞中，LC3的总含量没有必然的变化，LC3-I向LC3-II的转化可能加快，或者是LC3-II通过溶酶体自溶而快速降解引起LC3-II含量相对于LC3-I含量的降低。更进一步说，即使LC3的总含量增加了，其增加的比率也要小于酵母中增加的比率。Western印迹可以十分简便的应用于LC3含量（图2）变化的检测过程。需要注意的是，LC3-II的Western印迹还没有在果蝇中得到成功。注意 在使用LC3-II的自噬过程中有两个重要的注意事项。第一点，LC3-II含量的变化是依赖于组织和细胞环境而变化的。实际上，在某些情况下，运用电子显微镜检测自噬体积累时没有发现LC3-II含量的增加。相反，正常水平的LC3-II不能作为自噬的充分证据。例如，在胚胎干细胞中纯合缺失beclin 1基因虽然会导致自噬的缺陷，但是不会阻碍LC3-II的形成，然而atg5基因的缺失会导致LC3-II的完全消失（见图2B和参考文献32中的补充数据）。因此，重要的是要记住，并不是所有的自噬相关蛋白都需要像Atg8/LC3一样的过程，包括脂化。检测手段和LC3-I与LC3-II相对含量的变化莫测暴露出了技术性问题。例如，LC3-I在脑组织中含量丰富，LC3-I键的强度可能会使LC3-II的检测结果模糊不清，除非所用的聚丙烯酰胺交联密度得到过优化。相反，在某一细胞系中LC3-I的含量比LC3-II的含量少得多。此外，组织中可能会含有异步和异质的细胞群体，这可能会给利用Western印迹的方法分析LC3带来挑战。第二点，在用Western印迹的方法分析LC3时要谨慎，适宜的标准化控制是必要的。例如，在用某一特定的LC3抗体检测时，LC3-I相对低活性，同时LC3-I没有LC3-II稳定。LC3-I对冻融和在SDS样品缓冲液中降解也更敏感，所以新鲜的样品必须煮沸并要求尽快检测，同时避免样品受到反复的冻融。关于用Western印迹的方法分析LC3的注意要点已经被囊括在最近的一篇评论文章中，另外一个重要的建议是研究人员在检测LC3-II的相对含量时应该和肌动蛋白的含量相关联，而不是LC3-I的含量。另外，Triton X-100可能不能有效的溶解LC3-II。相反，在1%的SDS中加热能够确保完全溶解，这对于正确解释Western印迹的结果十分重要。而且测量LC3-I的效用取决于被分析的细胞。例如，与外围组织的细胞相比，中枢神经组织细胞中的LC3-I含量丰富并且稳定，在这些细胞中LC3-II与LC3-I的相对比率和LC3-II的含量可以用于监测自噬体的形成。最后，LC3在哺乳动物细胞中存在三种亚型，LC3A, LC3B和LC3C，在不同的组织内有不等的分布，用不同的抗血清或抗体区分这些亚型可能很有必要。在这里提醒一点，LC3B-II含量的增加，而不是LC3A-II,与自噬囊泡数量的增加有关，这一结果可由电子显微镜或与反应自噬诱导压力的鼠GFP-LC3转染实验检测得到。这一结果支持了LC3的亚型显示不同功能的观点，我们建议在western印迹和免疫荧光实验中使用抗LC3B，而不是抗LC3A。补充一点关于监测共价结合的Atg12-Atg的关注，其已在一些研究中用来衡量自噬。在一些哺乳动物细胞中所有的Atg5蛋白和Atg12蛋白均以共价结合的形式存在并且表达水平不变，至少是在短期饥饿处理时不变。因而，监测共价结合的Atg12-Atg5来反映自噬的诱导在本质上可能是一个无效的方法。然而值得注意的是，在某些细胞系中检测到了游离的Atg5，意味着Atg5的含量可能依赖于细胞系本身。另外一个可能值得考虑的变量是共价结合的Atg12-Atg5的含量可能会由于长时间处于饥饿状态而增加，这一现象由肝细胞和成纤维细胞中观察得到。最后，我想指出一个普遍存在的问题，即在检测过程中可能引入多种的压力，例如：由于细胞溶解而产生的机械压力，加热或冷却样品产生的温度压力，显微镜滑动产生的氧化压力，这些都可能引起一些认为变化。提出这一点不是为了有意限制使用任何特殊的方法，而是为了指出没有完美的检测方法。因而，证实在检测过程中正向调控（雷帕霉素处理）和负向调控（抑制剂处理）的方法按照预期的想法进行十分重要。3.荧光显微镜 LC3B（从本文的此处后用LC3代替），或者N端标记了荧光蛋白（如GFP, GFP-LC3）的蛋白质，已经被应用于间接免疫荧光或直接荧光显微镜的方法监测自噬，衡量的方法是测定LC3或GFP-LC3亮点的增加量。GFP-LC3/Atg8的检测在用转基因生物，如：线虫、粘菌、果蝇、拟南芥和鼠中进行的体内研究也十分有用。也可以在免疫细胞化学或免疫组织化学的实验中使用抗LC3的抗体，具有检测内源性蛋白，省却转染和转基因的程序的优点，以及避免可能因过度表达而引起的潜在人工因素。检测内源性蛋白显然依赖于在感兴趣的系统中检测的能力。如果内源性蛋白的含量达不到检测的水平，那么必须确保使用内源性蛋白质的构建。在这种情况下，考虑使用比瞬时转染稳定的转化十分重要。稳定的转化因为蛋白表达低所以可以减少背景，同时也具有消除暴露于转染试剂的优点。更进一步说，利用转化更多的细胞可以便宜的分析，因为几乎100%的细胞将会表达被标记的LC3。另一方面，稳定的转染子有一个缺点，即整合位点不能完全被预测，表达水平也不是很合适。更进一步说，瞬时转染具有检测被转染蛋白对自噬的即时效应的优点。另外，用双重转染（用GFP-LC3和感兴趣的蛋白）来直观的标记可以表达待检测蛋白的细胞，这种方法可能和稳定的转化子间存在更多地问题。总之，在使用稳定转染和瞬时转染之间没有适用的简单规则。当使用稳定转染时，筛选具有最佳信噪比的克隆是值得的，在使用瞬时转染时，优化GFP-LC3 DNA的浓度以获得最佳的信噪比是值得的。优化和适宜的控制，有助于克服检测中的内在易变性效应。GFP-LC3的另外一个作用是在与自噬相关联的过程中，如细胞器的降解和病原微生物的隔离，监测其与目标分子的共定位。在线虫中观测自噬时，最好选用GFP-LC3 (GFP:LGG-1；图四)的整合变体而不是染色体外构建，因为后者在不同的动物中的表达水平易变。另外，使用整合变体后仍可以利用western印迹的方法分析脂化。最后，我们指出基于GFP的显微镜的纳米分辨能力的提高，将进一步加强这项技术所带来的价值和可能性的可用性增加。在巨自噬（细胞质的非特异性隔离）和自噬相关过程（如：细胞质到液泡的标记途径，细胞器特异性降解和自噬清除入侵的微生物）均需要酵母Atg18的参与。近期的一项研究表明当自噬被诱导时，人类中与Atg18同源的物质（WIPI-1)在LC3阳性的膜结构处积累，同时Atg18含量的增加与LC3-II含量的增加相关。Atg18的内源性含量也可以通过间接的荧光显微镜和免疫电镜的方法检测，转染后GFP-Atg18的存在位置相似。因此，在检测中Atg18含量和分布可以替代LC3。至于其它的Atg蛋白，Atg9也显示出与GFP-LC3部分共定位的特性。监测Atg9的定位还没有广泛的应用于高等真核生物中，但是和在酵母中观察到的现象一样，这种蛋白在Atg1/Ulk1踏车中表现相同的类型依赖性，这表明这种蛋白质可以作为Atg1功能的指示标志。最后，Atg8/LC3是在高等真核生物中与自噬体保持相关的唯一的蛋白，其余的蛋白，特别是Atg5, Atg12和Atg16，通过荧光和免疫荧光检测显示其与吞噬泡相关。注意 虽然GFP-LC3的荧光分析是一个很实用的方法,但是通过测量GFP-LC3(或LC3免疫)的方法定量分析自噬比用western印迹的方法测定LC3-II更加繁琐。最理想的情况是包括检测和两组结果的比较。另外，如果GFP-LC3已经被定量了，那么最好检测每个细胞中反映GFP-LC3的亮点数量，而不是简单的记录所有细胞中显示的亮点总数。后一点十分关键，因为即使是在营养丰富的条件下仍会显示一些基本含量的GFP-LC3亮点，除非那些细胞缺少自噬相关基因（即使缺失相关基因，在特殊的条件下仍有可能得到GFP-LC3的亮点）（图3B）。这里还存在人工的和可靠的亮点计数的实际问题，特别是当每个细胞中的数量都较大时（这可能比依赖于程序软件的计数更加准确，因为确定只有适宜的亮点才被计数十分重要）。同时，当自噬体-溶酶体的融合被阻断时，较大的自噬体能够检测得到，这可能是自噬体-自噬体融合的结果。在许多细胞类型中，也许可以为每个细胞中的亮点数建立一个截至值，来区分低自噬和高自噬。这可以通过使细胞接触自噬诱导剂和阻断剂的实验检验。因此，细胞群体中含有自噬体的细胞比例比扰动条件下的截至数目占对照组细胞数目的比例更大，这一点可以提供自噬改变的定量证据。然后就可以根据细胞数和百分比来显示自噬体数目。这种方法在背景的亮点数目很低时是唯一可行的方法，并且在这种条件下，对大量细胞的计数尤为重要（根据不同的系统和实验，可能要求50或更多的细胞，最好至少复查三次）。为了让其他试图重复这些实验的研究人员进行比较，作者指定亮点基线用来定义“正常”或“低”自噬十分关键。此外，应该采用无偏程序（在包含所有细胞的一定间隔处使用随机起点）进行细胞计数，由于检测结果是高度变化的，所以基线和环境改变的信息必须进行统计。一个在大量细胞中进行无偏GFP-LC3亮点计数的可能方法是多光谱成像流式细胞仪。这种方法通过形态和免疫荧光图案相结合的方法允许描述群体内的单个细胞的特性，从而提供统计上有意义的数据。另外一个需要引起注意的地方是在使用荧光显微镜时确定大小是成问题的，除非仔细的提出一套标准化规定。更进一步说，不同大小的GFP-LC3亮点与自噬水平的关系还不是很清楚。一种可能确定亮点背景水平的控制方法是检测未加GFP（绿色荧光蛋白）标记的荧光强度。在使用GFP-LC3时一点特别的需要注意的是，这种嵌合体可以与聚合关联在一起，尤其是在高水平易聚合蛋白存在的情况下，这可能会导致对结果的误解。值得注意的是，GFP-LC3可以与泛素蛋白聚合体相关联；然而，当GFP-LC3表达水平很低时这一现象不会发生。这些聚合体在其他系统中也有被描述，经常被称为聚合样诱导结构或ALIS，树突细胞ALIS，p62 bodies/sequestosomes和包裹体。在体内和体外抑制自噬的活性导致这些聚合体的积累，暗示着自噬介导聚合体的清除。在体外，泛素蛋白聚合体的形成需要接头蛋白p62。在这种情况下，p62蛋白与泛素蛋白和LC3之间的相互作用被认为能够介导聚合体向自噬系统的传导。许多细胞内压力可以诱导聚合体的形成，包括转染试剂。例如：MEFs的脂质体转染，COS7的磷酸钙转染，神经元细胞基本水平很高的GFP-LC3亮点水平和LC3-II含量的提高。在这里考虑一件十分有趣的事情，在许多转染过程中用到的氯喹可以刺激自噬体的形成，但是它会抑制整个自噬过程；许多转染试剂是通过细胞的内吞作用发挥作用的，一些基于脂质和聚乙烯亚胺的试剂处在防止溶酶体酸化的缓冲液中时效力更强。一种解决方法是在稳定表达GFP-LC3的细胞中检测GFP-LC3的亮点数量；由于GFP-LC3和LC3-II含量的增加往往是瞬时的，所以另外一种方法是用GFP转染的细胞，这些细胞受到模拟时间匹配的转染作为背景对照物（负调控）。一个脂化缺陷LC3的突变体，其中第120位甘氨酸突变为丙氨酸，针对这些不依赖于自噬（可能通过其与P62的相互作用，见上文）的聚集体，并导致这种突变可以作为另外一个有价值的对照物。泛素蛋白聚合体的形成和消失代表了一个细胞循环的过程。当自噬过程被抑制或者当传导到聚合体的蛋白形成能力超过自噬的降解能力时，聚合体开始形成。原则上讲GFP-LC3阳性聚合体的形成是自噬过程的一部分。然而，泛素化的GFP-LC3阳性蛋白的形成不能够直接反映自噬的诱导（或者自噬体的形成），或者是流经这个系统。实际上，泛素化蛋白聚合体可以在自噬缺陷的细胞内产生。因此我们应该记住，GFP-LC3亮点可能代表在细胞质中一个混合的泛素化蛋白聚合体，自噬体和其他传统意义上的吞噬泡和自噬体中的泛素化蛋白聚合体承载着细胞质中的其它底物。再者，最近的一项研究表明，用皂素和其它类的洗涤剂处理可人工的刺激GFP-LC3亮点的形成。在肝细胞和稳定转染GFP-LC3的HEK-293细胞中没有检测到GFP-LC3的情况下，皂素处理的方法已经被用于降低荧光背景；然而，根据这些发现的结果，在这类实验中需要添加对照实验。一般说来，最好包含一些额外的测量自噬的检测方法，而不仅仅是依靠监测GFP-LC3。此外，我们建议研究人员在一开始就通过证实在用药理学或基于RNA干扰的自噬抑制剂处理过的细胞内不存在GFP-LC3亮点来验证他们的检测方法是否正确。例如，3-甲基腺嘌呤(3-MA)广泛应用于抑制饥饿或雷帕霉素诱导的自噬过程。另外一个普遍存在的局限性是GFP-LC3的检测需要适合转染或转基因（如感染）的系统。因而在一个基本的的非转基因细胞内使用GFP-LC3具有很大的挑战性。再次强调，必须包含有证实转染过程本身不会人工诱导产生GFP-LC3亮点或导致LC3聚合的对照物。更进一步说，转染的构建程度要较低，转染的细胞要经过一下检测（1）什么时候达到适合检测的表达水平，（2）在检测的时限里，基础的GFP-LC3亮点保持适当的低水平。此外，在自噬被抑制的条件下证明被诱导的GFP-LC3亮点含量在数量上有所减少十分有用。对于一些基本的细胞，通过重组慢病毒、腺病毒或者逆转录病毒的感染方法将GFP-LC3运送到前体细胞中，随后分化成为感兴趣的细胞类型，是已分化细胞类型转染的有力替代者。另外一个需要考虑的是，转染过程或者病毒感染过程，激活某些细胞中的压力途径，并可能诱导自噬的产生，再次强调了适当的对照物的重要性，如表达GFP的对照病毒。当提到转染时，改变依赖于背景环境的过程是必须的（详见关于氯喹的注意事项）。此外，改变培养基的成分然后在转染后等待24到48小时有助于减少转染试剂引起的GFP-LC3亮点的背景水平。当在瞬时转染中使用mCherry-GFP-p62双标签时（详见下文中的Tandem RFP-GFP荧光显微镜），在转染后最好等待48小时以减少聚合体的形成和潜在的自噬抑制效应。最后，尽管LC3-II主要是与膜相连的，但是这并不意味着像想象中的那样与自噬体相连；这种蛋白经常在自噬体的前体吞噬泡上找到。此外，LC3连接到PE的位点还没有找到，即使在不能形成自噬体的自噬突变体中Atg8PE/LC3-II的水平也可以增加。一种可以用来检测LC3-II与膜结合的方法是在Triton X-114中进行差异性提取，这可以应用于哺乳动物细胞中。另外一种方法是检测LC3与Atg5的共定位（或者其它Atg蛋白）；Atg12Atg5结合体不能与自噬体保持关联，所以共定位结构可能对应于吞噬泡。重要的是，我们再次强调GFP-LC3亮点的数量和LC3-II含量的稳态相似，仅仅反映自噬相关结构（如自噬体）某一瞬间的数量，而不是自噬通量。至于说Atg18或者GFP-Atg18的检测，至今仍未证明Atg18亮点是否能在人类细胞之外的系统中检测出来，而且亮点形成的数量依赖于细胞所处的环境。另外，Atg18还没有在完整的（成熟的）自噬体中检测到，所以Atg18可能只装点吞噬泡。此外，Atg18亮点的形成可能只对监测自噬有用，对自噬通量没有帮助。4. TOR和Atg1激酶活性 TOR复合物I (TORC1)在蛋白激酶B的下游以一种不依赖于转录的方式负向调控自噬过程。在大多数系统下，TOR的抑制将导致自噬被诱导。TORC1的活性可以通过其靶蛋白的磷酸化程度和下游效应，如p70S6激酶或者S6蛋白，而检测出来。对p70S6激酶而言，检测TOR的直接作用位点并且雷帕霉素敏感的389位苏氨酸的磷酸化程度十分重要；C末端磷酸化位点并不总是与TOR的活化作用相关。因此，在体外定量分析p70S6激酶的活性比较好，但是这需要更多的努力。TORC1活性的下降可以导致自噬的诱导，然而这并不是直接的衡量方法。相反，在体外当自噬被诱导时，Atg1对外源性底物的激酶活性上升。在酵母中和其它可能的生物中，有可能利用检测Atg1激酶活性的方法来验证自噬被诱导。注意 还有一些不依赖于TOR的机制诱导自噬过程。因此，证实待分析的途径依赖于TOR的抑制十分必要。目前，由于真正的底物还没有被描述所以把Atg1激酶活性当作工具来检测自噬受到很大限制；现在的检测方法依赖于人工底物髓磷脂碱性蛋白的体外磷酸化修饰。如果能够鉴定出一个Atg1的生理底物，就可能像分析TOR一样在体内追踪它的磷酸化。5. 转录调控 自噬的诱导在一定情况下伴随着某些自噬基因mRNA水平的增加，如Atg8/LC389和Atg12基因。因此，利用northern印迹或qRT-PCR的方法检测LC3 mRNA的含量也许能过提供与诱导自噬有关的相关数据。这些改变是否足以诱导自噬还不是很清楚，因而这并不是直接的检测方法。值得注意的是，Atg2, Atg4, Atg5 和Atg7等Atg基因转录水平的巨大改变就发生在果蝇唾液腺细胞死亡之前（伴随着自噬水平的增加），而Atg8a和Atg8b没有明显的变化。然而，在幼虫发育的最后阶段伴随着自噬的诱导，在脂肪体内可观察到果蝇Atg8a和Atg8b基因的转录上调，果蝇l(2)mbn细胞在饥饿条件下表现出果蝇Atg8b基因转录水平的增加。注意 当自噬被诱导时，大多数Atg基因的mRNA含量不会发生明显的改变。即使是LC3 mRNA的增加也是适度的，并且还依赖于细胞的类型和来源的生物。此外，最好是追踪蛋白质水平，因为蛋白质才是与自噬的起始和完成相关的最终有效因子，尽管Atg蛋白的含量不是大幅度的改变而且增加的程度依赖于细胞类型和组织来源。最后，自噬蛋白含量的改变并不是自噬诱导的充分证据，必须伴随着这里描述的其它检测方法才可以。B 通过通量的方法监测自噬 自噬不仅仅包括Atg8/LC3的合成和脂化，以及自噬体的形成，更重要的是通量，或者说是整个系统中的流体，包括溶酶体和液泡。因此，自噬的底物需要被监测已确定它们到达过这个细胞器，并且在适当的时候降解。1. 自噬性蛋白质的降解 蛋白质降解分析代表了一种测量自噬通量的行之有效的方法，并且能够很好的量化。一般的策略是用放射性的氨基酸（如14C-亮氨酸或 14C-缬氨酸）标记蛋白，最好是相对较长的一段时间，以达到代表自噬底物最好的长寿命蛋白质得到充分标记的目的，随后经过一个长的冷冻过程以确保检测开始时被标记的短寿命蛋白质已经被降解了。下一步，测量来自未受损的细胞中或被灌注的器官中标记蛋白的酸溶液的放射性依赖于时间的释放。然而测量的降解中的一部分与自噬无关，所以必须在3-MA或者是氨基酸抑制自噬的浓度下进行平行测量；然后从总测量值里减去这一部分。互补的办法是使用阻断其它降解途径的化合物，如蛋白酶抑制剂，由于不同降解系统间的干扰可能产生意想不到的结果。例如阻断蛋白酶功能可以刺激自噬。因此，在特殊细胞类型和背景中进行检测时，了解所使用的抑制剂是否会改变自噬十分关键。此外，在一些特定的条件下3-MA可能产生一些不依赖于自噬的效果，所以验证3-MA敏感的降解是否对一般的溶酶体抑制剂（如氯化铵）也敏感是明智的。另外一个可以考虑的检测方法依赖于甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）融合蛋白的有限水解。先前的一项研究表明全长44kDa的BHMT在存在亮肽素的肝细胞溶酶体内被切割生成32kDa的片段。32kDa片段的积累依赖于时间并且可以通过用自噬抑制剂处理而阻断。这个标记分子的一个修饰形式，GST-BHMT，可以和野生型蛋白质的行为相似的在其它细胞系中表达。其它的底物可以考虑使用相似类型的检测方法。例如，新霉素磷酸转移酶II-GFP(NeoR-GFP)融合蛋白是自噬的靶标。将具有表达NeoR-GFP质粒的淋巴母细胞繁殖一段时间后在3-MA中继续繁殖，通过流式细胞仪检测发现这会引起NeoR-GFP蛋白的积累。注意 检测长寿命蛋白质的降解需要预先放射性标记那些细胞（随后把酸溶液从放射性酸不溶性物质中分离出来），尽管这种标记在培养的细胞中很容易操作，但是这样的脉冲追踪实验不适用于动物中，虽然它们可以在灌流的器官中实现。在细胞中，也可以通过色谱的方法来检测未标记氨基酸的释放，因而免除了预标记的必要。在任何情况下，一个潜在的问题是被释放的氨基酸可能继续参与代谢。例如，支链氨基酸在肝细胞中是很好的水解指示标志，但是在肌细胞中它们被进一步氧化。更进一步的说，氨基酸可以重新组合成蛋白质；因此，类似的实验可以在存在放线菌酮的条件下进行，但是这又会引起额外的需要关注的地方（详见下文中的自噬区间的周转周期）。在标记的氨基酸的情况下，在示踪氨基酸过剩的地方追加未标记的氨基酸（注意不要使用抑制自噬的氨基酸），或者采用单次通过灌注器官或超灌注细胞的方法。灌注器官系统也允许水解效果的可逆性检测和在同一个实验的准备阶段使用特异性自噬抑制剂，这是适当评估的关键性控制手段。如果自噬蛋白的降解水平很低（有可能发生在培养基供应充足的细胞中），那么在与非自噬相关的降解水平高的背景下测量自噬蛋白的水解可能会十分困难。还应当指出，通常做法中所说的在“降解条件”下培养细胞指的是在含盐的缓冲液中培养，指示的是自噬的潜在能力（可达到的最大活性），而不是一般体内培养或是在营养丰富的条件培养下的自噬能力。最后，某一降解途径的抑制通常伴随着另外一条途径的增加，因为细胞试图补偿降解能力的下降。这种补偿在试图抑制巨自噬的条件下，可能会干扰对照物的测量；然而，由于后者是主要的降解途径，所以在这类实验中其它类型的降解的贡献往往是可以忽略的。2. LC3-II的周转周期 在存在和不存在降解溶酶体的条件下，自噬通量可以通过利用western印迹（图2）的方法推断LC3-II的周转周期来测量。阻止溶酶体降解的方法有，使用蛋白酶抑制剂（亮肽素和E64d），改变溶酶体pH的巴弗洛霉素A1等药物，或者是使用阻断自噬体和溶酶体融合的试剂。监测自噬的方法的最近一项补充依赖于在某些类型的细胞中观察到了LC3-II的一个亚群以胞质的形式存在（LC3-IIs）。胞质中LC3-IIs的含量和LC3-I占LC3-IIs的比例与自噬的改变相关联，相比基于LC3-II的总含量的比例而言提供了一个更加准确的测量通量的方法。这种方法的有效性已经通过比较在鼠肝细胞和肝癌细胞中的自噬蛋白水解通量而得到证实。这种方法的一个优点是不需要自噬抑制剂或溶酶体抑制剂来阻断LC3-II的降解。注意 在测量LC3-IIs/LC3-I时的一点重要说明即这种方法是否也适用于其它类型的细胞中还不清楚，而且在许多标准化的细胞类型中，如HeLa, HEK293和PC12，没有观察到溶解形态的LC3-II。此外，同样的顾虑适用于用western印迹的方法检测LC3-I。需要注意的是LC3-IIs/LC3-I的比例必须使用细胞质组分进行分析，而不是总的匀浆混合物。此外，在上文中关于使用LC3进行定量分析自噬的说明同样适用于使用这种标记分子追踪通量的情况。放射性脉冲追踪的使用提供了可替代溶酶体蛋白酶抑制剂的析方法，尽管这些抑制剂仍然要被用于确认降解是依赖于溶酶体的。此外，使用药物时浓度要适宜，时间跨度要在抑制融合或降解中有效，但是又不引起细胞死亡。因此，在使用酶抑制剂成问题的地方和脉冲标记需要短期培养的条件可能诱导自噬的地方，这技术也许不可能在所有类型的细胞中或整个机体的组织中都成熟应用。如果其它的底物可以同时被监测，那么追踪LC3-II的周转周期可能就不是绝对必要的了。例如，LC3-II和去除了一个自噬底物（例如被研究人员用于神经退行性疾病研究的polyQ-expanded蛋白，或者是一个细胞器）的溶酶体（理想的认为是自噬特异性的）的结合体含量的增加，并没有为自噬通量的独立评估提供一个好的蛋白酶底物。3. GFP-Atg8/LC3溶酶体运输和蛋白水解 GFP-LC3B(GFP-LC3)也被用于追踪通量。首先，当GFP-Atg8或者GFP-LC3被运输到溶酶体后，嵌合体中的Atg8/LC3部分对降解敏感，而GFP蛋白（尽管不是绿色荧光）相对来说抗水解。因此，用western印迹的方法显示游离的GFP可以用来检测自噬体内膜的裂解和底物的降解（图5）。GFP-LC3向溶酶体的移动也可以通过荧光显微镜检测出来，尽管GFP荧光信号对酸性pH比对其它荧光团更敏感。在这两种情况下，由于GFP-LC3不断被合成，所以用GFP荧光来追踪通量都存在一定的问题。这一问题的可能解决方法是使用一个光催化的荧光蛋白，使得这种检测方法在本质上和脉冲/追踪分析方法一样。另外一种追踪通量的替代方法是通过向表达GFP-LC3的细胞中添加溶酶体蛋白酶抑制剂来使用GFP-LC3荧光，检测亮点数量上的变化。在这种情况下，溶酶体抑制剂的存在会使得GFP-LC3阳性结构的数目增加，如果对GFP-LC3亮点的总数或者显示大量亮点的细胞的百分比没有影响，那么可能暗示着自噬通量的缺陷。蛋白酶抑制剂（阻止GFP的降解）或者是像氯化铵和氯喹一样能修饰溶酶体pH值的化合物，抑或是像巴弗洛霉素A1的药物，和阻断自噬体与溶酶体融合的化合物（如长春碱）的结合体可能能够最有效的阻止依赖于溶酶体的GFP-LC3亮点的减少。然而由于GFP的稳定性受溶酶体pH的影响，我们建议在使用蛋白酶抑制剂时是否将超溶酶体（lysosomotropic）化合物和融合抑制剂均加入进来。最后，最近发明了一种利用有荧光活性细胞的分选来定量分析LC3-II的周转周期的新方法。注意 GFP-LC3的加工检测的主要限制的是，它似乎依赖于细胞类型和培养条件。显然，GFP对哺乳动物细胞溶酶体的水解酶要比酵母液泡中的降解环境更加敏感。此外，溶酶体相对于液泡来说的低pH值可能对检测游离的GFP有影响。因此，使用这种方法时必须伴随使用包括对照物的免疫印迹，来确定非溶酶体GFP的稳定性，如GFP-LC3-I。沿着这些思路，关于使用eGFP荧光蛋白显微镜的一个警告是，这种荧光团最适强度荧光的pH是中性的，所以其信号可能会在pH值降低时迅速减少。因此，最好选用其它的一些荧光团，如红色荧光蛋白（RFP）或mCherry，它们在酸性条件下仍保持一定的荧光强度。除了RFP和mCherry之外另外一种供选择的方法是使用YFP的Venus variant，它比mRFP更明亮，对pH没有GFP敏感。当用到GFP-LC3的结构时，考虑eGFP的最适pH很重要，因为最初的GFP-LC3标记分子要使用eGFP的变体，这可能导致amphisomes或自噬体形成信号的降低。当使用光催化的结构PA-GFP需要注意，光子激活这一过程时可能会诱导DNA的损伤，反过来引起自噬的诱导。最后，GFP相对来说抗变性，需要煮沸5分钟以防止折叠的蛋白质在的SDS-PAGE凝胶电泳期间被截留在浓缩胶中。4.p62 western印迹 除了LC3，在特定的条件下也可以把p62/SQSTM1作为标记分子使用。P62蛋白的作用是联系LC3和泛素化底物。p62被包含到完整的自噬体中，在自噬泡阶段被降解（图6A）。最近的一项研究表明p62含量的增加与自噬的抑制相关，指出这种蛋白稳定状态下的含量反映了自噬过程的状态。有趣的是，最近的一个报告显示p62参与到包涵体的形成过程，并且p62的缺失引起自噬不足从而减轻肝的损伤。相反，p62的缺失对神经元退化的影响很小，暗示了与包涵体相关病状的细胞类型特异性性质。注意 p62存在一个问题即目前还不知道这个蛋白是不是自噬的一般标记，尽管它与LC3以及泛素化底物连接紧密。另外，它最易应用于评估下调调节，而不是自噬的诱导（例如只有当自噬过程被阻断时p62的含量才上升；图6B）。例如，在自噬被诱导三十分钟后p62的含量没有明显的不同，而LC3-II的改变这时已经能被检测出来。更进一步说，检测内源性p62的含量十分必要，因为这种蛋白质的过表达将引起蛋白质包裹体的形成。实际上，即使是内源性的p62在蛋白聚合体存在和自噬降解被抑制时也会变的不溶于Triton X-100；因此利用这种蛋白而产生的结果往往是依赖于背景环境的。此外，p62还参与到蛋白酶降解过程中，当蛋白酶被抑制时它的含量也可能增加。最后，在特定条件下，p62可能引起转录上调，这使得解释结果更加的复杂。总之，虽然p62的分析有助于评估自噬的减值，但是我们不建议单独使用p62来监测通量。5.自噬隔离的检测 自噬的活性也可以通过自噬底物的隔离，（电镀）注射如3H蜜三糖的惰性细胞质标记分子，或者内源性细胞质蛋白如乳酸脱氢酶的方法来检测，在后一种情况下用蛋白酶抑制剂（如亮肽素）处理可以阻止蛋白质标记分子在溶酶体内的降解。这种分析十分简易的检测底物从细胞中的可溶性（细胞质）部分向不可溶性（沉淀）部分（包括自噬的部分）的转移，不需要复杂精细的亚细胞分离（一种可能与离心功能相同的渗滤法，尽管验证过滤膜不会破坏去核上清部分物质的完整性十分有必要）。底物分子可以通过酶催化分析或western印迹的方法进行定量。原则上讲，细胞内的任何成分均可以作为底物标记分子，但是具有低沉淀特性的细胞质酶类是最好的选择。与膜相关联的标记分子不是十分适用，像LC3蛋白这样本身是隔离体一部分的标记分子，相对于纯化的底物标记分子，如乳酸脱氢酶，与自噬通量的关系更加复杂。然而，由于根据细胞所处的环境不同的途径均可以降解同一种蛋白，所以证实在巨自噬用3-MA阻断后或者是Atg蛋白基因被敲除后，标记分子蛋白的降解速率不再明显改变十分重要。隔离体分析可以被用来在自噬途径上的某一步测量通量。例如，微管抑制剂长春花碱可以阻断自噬体和溶酶体融合，溶酶体内隔离体降解探针14C乳酸标记的只能是细胞中用抑制剂处理过的前溶酶体单元，这些已经被用于为监测整个的自噬途径(autophagic lactolysis)获得背景控制条件下的数据。需要提醒一点，有些抑制剂会通过未知的机制（见自噬的抑制和诱导）促进促进隔离体的产生。这种方法的变型适用于哺乳动物细胞中，包括活细胞成像技术。自噬的诱导通过底物（如线粒体）运动到GFP-LC3共定位