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空斑实验及基因组的提取汇报人：马锐1.空斑或蚀斑形成试验（原理） 空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。可进行病毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可进行病毒的鉴定基因组的提取原理。n 真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。n 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来 2.仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液： 10%SDS EDTA (pH 8.0) 0.5mol/L 蛋白酶K（2）DMEM 10%DMEM 2倍DMEM 低熔点琼脂糖（1.5%-2%）（4）酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、70%乙醇、灭菌水。3.空斑操作步骤（以伪狂犬重组病毒为例）n 将转染后收的毒液冻融2次后接6孔板。n 待6孔板细胞长至90%开始实验n 先将毒液稀释成10-110-6几个梯度（用无血清的DMEM）n 接毒前用PBS把细胞洗两遍n 接毒量视毒价而定，接毒后于培养箱孵育1小时n 弃去病毒液，用PBS洗一遍，每孔加入2ml 2倍DMEM和低熔点琼脂糖的混合液（DMEM 1ml+低熔点琼脂糖1ml）n 待混合液室温冷却10分钟后于4度再放置5分钟，放入细胞培养箱培养24-48小时后挑斑接于24孔板。4.操作步骤（提基因组）n 将已经病变收毒的24孔板反复冻融次后每孔依次吸取200 ul上清毒液。n 每孔加入10ul 10%SDS ，10ul 0.5M EDTA，1.3 ul蛋白酶K,50作用1小时或37作用6小时以上。n 加等量的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）振荡混匀，离心12000 rpm，10min。n 取上层溶液至另一管，加入0.1体积的3M NaAC和2体积的乙醇，-80沉淀2小时。n 离心12000 rpm，10min，弃上清，沉淀用500ul 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，10min。n 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。n 每管加20 ul灭菌双蒸水溶解。5.注意事项n 1、低熔点琼脂糖的使用及储存n 2、空斑接毒时要注意毒量，最好不要太多，待两天后挑斑n 3、加入混合液时要迅速n 4、挑斑时尽量挑取单个斑落，于高滴度的孔中挑取n 1、用枪吸酚时注意n 2、酚：氯仿：异戊醇比例要严格n 3、加入混合液混匀要充分n 4、干燥要充分，加水溶解时不要剧烈重悬以免基因组断裂。n 5. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。6.基因组的大量提取（以PRV基因组的提取为例）1.取6到8吹散大瓶病变的细胞（IB或PK），弃去培养基，每瓶用10ml PBS吹散，离心5000 rpm，5min晾干。2.加入10ml Lcm悬浮，冰浴15min3.加入1ml 氟利昂，涡旋5min（压力极大，盖紧）4. 4 2500 rpm，10min取上清加1ml氟利昂，继续涡旋5min5. 4 2500 rpm，10min取上清至一新的50ml离心管中。6.超速离心管中依次缓慢加入45%甘油16ml，5%甘油12ml，上清。7.超速离心，4 25000 rpm，2h。8.弃上清，加10ml TEN重悬沉淀，反复吹打后转移至一新的50ml离心管中。9.加入SDS，使其终浓度为0.5%，作用5min，使病毒粒子裂解。为防止基因组断裂，以下步骤均用断枪头10.分别用酚（10ml）和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），氯仿（10ml）抽提一次，每次轻轻上下颠倒混匀4 10000 rpm，10min。11.吸上清，加入2倍无水