C57小鼠出生后视网膜神经上皮层细胞发育中的PCNA表达及其意义.doc

C57小鼠出生后视网膜神经上皮层细胞发育中的PCNA表达及其意义安徽医科大学学报 2000年第3期第35卷 基础医学研究作者：龚健杨蔡人杰单位：安徽医科大学第一附属医院眼科，合肥230032关键词：增殖细胞核抗原；小鼠；视网膜；生长和发育摘要目的研究C57小鼠出生后视网膜的发育和增殖细胞核抗原(PCNA)表达及两者间的关系。方法采用HE染色及免疫组化标记PCNA的方法，对出生后第1天到第21天的C57小鼠视网膜神经层的细胞发育作连续性观察。结果C57小鼠出生后，视网膜神经层仍然有一个发育过程。神经节细胞层在出生时已经形成，外丛状层在出生后第6天才分化出来，而内、外核层细胞形态上接近成熟小鼠，分别在出生后第10 天、19天。PCNA显示在外成神经细胞层分化为内、外核层和外丛状层之前，和节细胞各有一次和增殖相关的阳性表达。3个细胞层在形态学的分化基本完成后，又出现了一次结束时间是由外向内变化的阳性过程（外核层：第11天至15天：内核层：第8天至16天，神经节细胞层： 16天到21天)，这一次阳性表达过程可见到细胞形态向成年形态的转化。结论C57小鼠出生后视网膜神经层的发育，分为细胞分化和细胞成熟两个阶段，分化阶段的细胞分化顺序可能是以细胞的空间位置决定的，成熟阶段的顺序可能是按神经传导的方向发展的，与细胞的功能相关，PCNA的表达和细胞的增殖、分化、成熟在时间、空间上具有相关性。 中图分类号R322.91；R392.11文献标识码A文章编号1001-1492(2000)03-0179-05Expression and signficance of PCNA in retinaldevelopment of postnatal C57 miceGong Jianyang, Cai Renjie(Dept of Ophthalmology, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei230022)Abstract Objective To study the relationship between retinal cellular dynamics of development and the expression of PCNA of postnatal mice. MethodsUsing HE staining and immunohistochemical method, the development of retinal cellular and expression of PCNA was investigated in neuro-epithelial layer of C57 mice from postnatal 1 to 21 day. ResultsAfter mice were borned, there was a continual development of mice neuro-epithelial layer. The ganglion cell layer was present when born.The outer plexiform layer was appeared on postnatal day 6, but morphology of inner and out nuclear layer resembled to adult mice on postnatal day 10 and 19. The outer neuroblastic layer before it divided to inner and outer nuclear layer and outer complexiform layer and gonglion cell layer showed a temporal PCNA positive which was related to proliferation. The three cell layers had another PCNA positive when finished time changed from outer to inner after their morphologic development basically completed( outer nuclear layer:1115 days,inner nuclear layer: 816 days, gonglion cell layer:1621 days). ConclusionThe development of retina of the postnatal C57 mice is divided two phases, cellular differentiation phase and cellular maturity phase. The cell development in cellular differentiation phase is possibly sequenced by cell dimensional position. In cellular maturity phase, this sequence is possibly decided by transmitting direction of nerve impulse, and related to cellular function. Expression of PCNA has related to cellular proliferation,differentiation and maturity at time and space.MeSHproliferating cell nulear antigen；mice；retina/growth and development人类视网膜的发育是在胚胎期完成的，对人胚视网膜发育做到真正的全过程观察比较困难。然而，哺乳动物的眼球发育有相似的规律。Charilie11、Richard等2研究表明，小鼠在出生后的23周内，视网膜仍然有一个显著、有序的发育和分化过程，因此研究实验性小鼠在出生后视网膜的发育，对于了解人类视网膜的发育有着重要的参考意义和帮助。增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）是DNA多聚酶的辅助蛋白3，在G1后期开始增加，S期达到高峰，G2、M期又降低4，其变化与DNA合成一致，是细胞分裂增殖的必要条件。因此,现多用PCNA评价细胞的增殖状态5。本实验目的是观察视网膜发育过程中的PCNA表达与细胞增殖、分化的时间、空间变化和细胞动力学变化间的关系，为进一步理解视网膜发育机制和因视网膜发育异常而导致的疾病的发生机制，提供有价值的形态学资料。1材料和方法11标本来源C57BLCC小鼠，由安徽医科大学实验动物中心购自上海第一医科大学实验动物中心。取出生后第1 天到第21天的C57BLCC小鼠，每天各2只，共42只，84只眼球，处死后立即取出眼球，10(体积分数)中性福尔马林固定。常规石蜡包埋，制作2 m石蜡切片，HE染色。12试剂及方法鼠抗人即用型PCNA（克隆号:PC10）及免疫组化（ABC法）工作液均购自中国福建迈新公司。染色步骤按免疫组化标准ABC法进行，用证实有PCNA阳性的人鼻咽癌和大肠癌切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。13结果判断PCNA阳性：实质细胞核显棕黄色颗粒为阳性。细胞计数：光镜下，以视网膜在视野中横跨最大范围为一个视野，计数5个高倍（400）视野中相应细胞层中特定细胞的数量，取其均数为计数结果。PCNA阳性百分比：同一切片的特定细胞内PCNA阳性的细胞数 / 细胞计数100%。2结果21HE观察在HE染色切片中出生第1天的小鼠视网膜的细胞分为两层：内层为较薄的圆形细胞层，有23层细胞，大小不等，核深染，为已经分化出的节细胞层；外层细胞为正在分化的外成神经细胞层，外层细胞层的厚度为内层的810倍，其细胞形态根据细胞位置的不同，又可分为两种，内侧细胞为椭圆形，核染色深，厚度约占该层的15；外侧为杆状核与胞浆染色淡的成神经细胞。内外细胞层之间为一层无核的内丛状层，其内可见到正在向内迁徙的细胞。此图像相当于人胚胎的第4个月6。神经节细胞层 出生后第3天开始，细胞层变薄，但仍有23层。从第3天开始，层面上的细胞数量开始明显减少，至第8天变为单层，水平排列，细胞体大，核与胞浆淡染。以后数量稍有上升，稳定在成年鼠的水平。见图1。图1神经节细胞数量变化图2 第1天,PCNA示外成神经细胞层外4/5的杆状细胞区为强阳性,圆形细胞层和节细胞层阴性100图3 第6天,外成神经细胞层已尼分化内颗粒层的PCNA阳性长杆状细胞突入阴性的颗粒细胞区.100图4 第8天,节细胞的PCNA阳性胆显(箭头),内颗粒层仍有阳性细胞100图5 第16天,外颗粒层基本为阴性,内颗粒层和节细胞明显PCNA阳性.100图6 第21天,PCNA外颗粒层全部为阴性,内颗粒层阳性减弱(),节细胞仍然呈强阳性()100图7PCNA细胞阳性百分比变化内核层：出生后第6天，在成神经细胞层内1/2处出现最初的外丛状层，其内侧为内核层。第7天起，内核层内侧的圆形、核深染的细胞，开始由内向外逐渐替代成神经细胞，至第1012天，细胞层结构和成年鼠基本一致。外核层：第9天，外核层开始出现圆形，核深染的细胞，同时视锥视杆层开始增厚。第14、15天，圆形细胞明显增多，视锥视杆层亦明显增厚，由原来的外核层厚度的15增至12。至19天，外核层主要为圆形颗粒状的细胞、视锥视杆层的厚度为其1/2，其形态与成年鼠一致。整个过程中，未见到典型的核分裂象。22PCNA第1天，外成神经细胞层的外4/5的杆状细胞区呈强阳性，其内侧的圆形细胞层和节细胞层阴性（图2）。第2天，外成神经细胞层的外4/5区阳性细胞较第1天略少，紧贴色素膜处可见散在大椭圆形的阳性细胞。第3天，外成神经细胞层的原阳性区的外侧，靠近色素膜出现一条不明显的阴性带，使阳性区域呈现带状；第45天，外成神经细胞层的阳性带继续向内移动，其外侧的阴性区域厚度约占外成神经细胞层的1/3，其内侧可见阳性长杆状阳性细胞突入阴性的颗粒细胞区（图3）。第6天，外丛状层出现，内核层的内l/3处可见由长杆状阳性细胞构成的阳性带。第7天，内核层的阳性带无明显变化，节细胞层出现不太明显的阳性。第8天，节细胞的阳性明显，内核层的长杆状细胞阳性带向外移动，其内侧的颗粒细胞出现阳性，在内核层的外侧边缘，可见到少量的大、圆形的水平细胞为阳性。外核层可见散在阳性（图4）。第11天，外核层阳性增加。至第12、13天，外核层全部阳性，节细胞层阳性明显。第15天，外核层阳性细胞减少。第16天，外核层基本为阴性，仅在内外1/3处可见一线状的阳性带。内核层和节细胞明阳性（图5）。第18天，内核层约有一半细胞为阳性，神经节细胞表现全层阳性。第19、20、21天，外核层基本为阴性，内核层的阳性细胞逐大减少，节细胞层的阳性一直持续到第21天无明显变化（图6）。几种细胞PCNA阳性细胞百分比比较见图7。3讨论31各层细胞的演变过程311神经节细胞在小鼠出生的第1天就已经分化出来，出生后第38天开始其数量有一个明显的下降。节细胞从第7天开始呈持续性PCNA阳性，并逐渐加强，从16天到21天呈强阳性，但是细胞数量基本稳定。312外成神经细胞层在出生后己经出现两种细胞，其外侧为PCNA阳性细胞，阳性区呈带状向内移动，外侧阴性区的细胞形态并没有变化，第6天，在阴性区内出现外丛状层。313内核层在形成以后，其细胞形态仍然和原来外成神经细胞层相似，PCNA阴性。在这一层的发育中，观察到了两个相反的发展方向：PCNA显示阳性的细胞从17天，呈由宽到窄的内移带，第8天开始外移稳定在中内13处；而圆形的颗粒细胞从第812天，有一个逐渐向外扩张，替代长杆状细胞的过程，到16天PCNA出现阳性。314外核层在小鼠出生后第6天由于外从状层的出现而产生，形态学提示细胞仍未分化。外核层的PCNA阳性两次出现，第一次是出生后，整个外成神经细胞层外带阳性区内移时。第二次阳性是在第11天至15天，峰值在12、13天，几乎达到了全层的强阳性。至19天，外核层和视锥视杆层形态与成年鼠基本一致。视锥视杆层的增厚在一定程度上反映了外核层细胞的增殖、分化和成熟。32C57小鼠视网膜发育的模式以上观察结果显示，C57小鼠出生后视网膜神经层的发育分为两个阶段:321细胞分化阶段在C57小鼠,这个阶段的时间是从出生前到出生后2周左右。在此阶段内，细胞增殖、分化，并分别进入相应的细胞层次。在出生后外成神经细胞层分化成内、外核层的过程中伴有一次很强的PCNA阳性区带移动，同时伴有细胞层的增厚，提示此阶段的PCNA阳性伴有细胞的增殖过程。这个阶段的三层细胞分化的快慢是不同步的，次序是：神经节细胞层（在出生前即己完成），外核层（出生后第6天），内核层（出生后第8 12天）。此阶段结束后，细胞分层基本结束，从光镜下可分辨出视网膜的三个细胞层和内、外丛状层。322细胞成熟阶段在小鼠，这个过程从出生后2周左右开始，结束时间超过21天。视网膜分层结束后，发育到和成年鼠视网膜的形态仍有差异，这种差异主要表现在细胞的形态学和细胞层的厚度上。而到21天时，这种差异已不明显，说明在这个阶段中，细胞、细胞器和其他超微结构仍然在发育。此期间PCNA在内、外核层出现了不伴有明显的细胞增殖的第2次阳性，时间均接近于细胞和细胞层形态变化的时间。细胞神经节细胞层虽然只有一次阳性，但同样未见到明显的细胞增殖过程，可以认为这次神经节细胞层PCNA阳性的意义等同于内、外核层的第二次PCNA阳性。在人类，这一阶段在胚胎期20周以后。人类视网膜发育过程中，胚胎4个月左右的视网膜光镜下结构发育就基本与成人一致了，但视网膜仍然有超微结构构建等生命活动，在49个月内，其强度呈持续性增长7，8。罗学港等9发现细胞色素氧化酶（CO）在40周以后表达于神经节细胞层和内核层，提示此时神经元细胞的功能发育才基本完成。而内、外核层在49个月，SDH、LDH、G6PD、ATPase、5-核苷酸酶均有一个递增的过程，说明此期细胞仍然有较为活跃的能量、核酸水平的活动10。33PCNA在本次实验中表达的意义值得注意的是，在本次实验中，虽然可以见到大量的PCNA阳性，却没有发现细胞分裂象。PCNA作为细胞增殖的指标，目前已经得到公认。但是，PCNA的表达是在分裂周期的G1晚期S期，而核分裂相出现在M期。这两者所经历的时间之比为81，因此，理论上，在切片中，观察到PCNA阳性和核分裂相的比值也应在81。本次实验中未观察到核分裂相，而PCAN则有数次阳性的峰值，原因如下：胚胎期的G1晚期S期与M期经历的时间比值更小，M期非常短暂，因为样本量的限制，没有观察到核分裂象；PCNA的表达高峰在S期，但是在G1、G2、M期也有表达，而PCNA的半衰期为20 h11，如果细胞完成其细胞周期循环的时间很短，并且为连续性的增殖（如胚胎期、恶性肿瘤），PCNA的高度表达可能出现在细胞S期以外的其他各期；PCNA的表达与细胞分裂增殖并不是绝对的因果关关系。有文献12，13报道PCNA与核分裂象无关。Wlckamasinghe提出：一些细胞在G2 期受阻后会跳过M期重新进入S期进行DNA复制，称为DNA的内复制。生长抑素（Somatostatin，SOM）基因14和PCNA是一对在某种意义上具有对抗性的基因，前者抑制细胞增殖，后者表达正在进入增殖阶段，而节细胞和内核层的第二次PCNA阳性的时间和SOM表达的时间，几乎是同时的。这两种看起来作用相反的基因的同时表达也是细胞正在成熟的一个标记：PCNA使细胞进入S期，即DNA的活动期，而SOM的同期表达，阻止细胞进入M期，使其停留在S期，使DNA处于可复制、扩增的状态，便于mRNA等中间信息传递单位的生成、扩增，为蛋白质生成、细胞成熟作好准备。本实验中，内、外核层的第一次PCNA阳性伴有细胞数量的增加，证实了PCNA的表达和细胞增殖具有相关关系。但是神经节细胞层的阳性和内、外核层的第二次阳性则与增殖没有明显的相关性，而和细胞及细胞层的形态学变化在时间上一致。因此推测小鼠视网膜发育的过程中，PCNA的作用不仅仅是促使细胞进入完整的细胞分裂周期，而还能使DNA大量扩增，以保证蛋白合成和细胞构筑的需要。PCNA作为DNA多聚酶的辅助蛋白，其分子生物学作用也仅仅是参与DNA复制过程，以往认为DNA的复制仅出现于细胞增殖期间，因此用增殖细胞核抗原命名，而现在的研究证明，细胞在正常的与增殖无关的生命活动过程中，有时为了产生大量的蛋白质等物质，也会大量扩增DNA以提供足够的模板。PCNA与DNA扩增之间的关系，目前未见报道，本次实验结果显示的PCNA与细胞成熟之间的相关性提示这两者可能有一定的相关性，但尚需进一步研究。根据本次实验结果，参照国内外的相关研究资料，将C57小鼠出生后视网膜神经层的发育，分为细胞分化和细胞成熟两个阶段，分化阶段的细胞顺序是以细胞的空间位置决定的，成熟阶段的顺序是按神经传导的方向发展的，可能与细胞的功能相关。 PCNA的表达和细胞的增殖、分化、成熟在时间、空间上具有相关性。作者简介：龚健杨，男，31岁，硕士，医师蔡人杰，男，65岁，教授，主任医师，硕士生导师参考文献1，Braekevelt CR, Hollenberg MJ. The development of retina of the albino mouse. Am J Anat，1978;127(3):2813022，Young RW. Cell death during differentiation of the retina in the mouse. Journal of Comparative Neurology, 1984；229(3):3623733，Rodrigo B,Rainer F, Patricia A et al. Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-. Nature, 1987;326(2)：5155174，Lewin B. Driving the cell cycle. M phase kinase, its partners and substrats. Cell,1990;61(5):7437525，Hall PA, Proliferating cell nuclear