Y染色体微缺失与男性不育相关.doc

Y染色体微缺失与男性不育相关【关键词】 不育 关键词: 不育，男（雄）性;Y染色体;染色体缺失;基因 摘 要:目的 探讨Y染色体微缺失与原因不明性无精症、少精症所致男性不育的相关性. 方法 特发性少精症18例、特发性严重少精症12例、特发性无精症5例及正常已生育健康男性10例作为研究对象和正常对照.应用多重PCR技术，对精液基因组DNA进行Y染色体上连续的18个序列标记位点检测. 结果 少精症18例中发现Y染色体微缺失2例，严重少精症12例中发现Y染色体微缺失3例.无精症5例和正常已生育男性10例均末发现Y染色体微缺失.缺失形式3种. 结论 Y染色体微缺失与精子发生障碍相关. Relationship between Y chromosome microdeletion and male infertility LIU FangCHEN Bi-LiangSU Ming-QuangWANG De-Tang 1 Department of Obstetrics&Gynecology， 2 Center of Molecular Biology，Xijing Hospital，Fourth Mili-tary Medical University，Xian710033，China Keywords:infertility，male;Y chromosome;chromosome deletion;genes Abstract:AIM To evaluate the microdeletion of Y chromo-some in infertile men with idiopathic azoospermia and oligozoospermia.METHODS 18patients with idiopathic a-zoospermia，12with severe idiopathic oligozoospermia and5with idiopathic oligozoospermia were selected for analysis.10normal fertile males were used as the control.Multiple poly-merase chain reaction was performed to detect microdeletin of Y chromosome in genomic DNA of semen，and a series of18sequencetagged sites（STSs）mapped within Y chromosome were selected.RESULTS Y chromosome microdeletion was observed in2of the18males with oligozoospermia，and in3of the12males with severe oligozoospermia.No such dele-tion was observed in5azoospermic males and10normal fer-tile men.The3patterns of microdeletion were identified.CONCLUSION Y chromosome microdeletion might be closely related to spermatogenic failure. 0 引言 全世界约15%的夫妇不育，男性不育占50%左右，其中60%以上精子发生减少的原因不清，认为有遗传变异存在1 .近来发现Y染色体微缺失，主要是AZF基因缺失与之有关.我们采用多重PCR技术，对45例研究对象精液基因组DNA进行Y染色体微缺失检测，旨在从分子水平对男性不育病因作一些探索. 1 对象和方法 1.1 对象 2001-03/2001-11西京医院妇产科不孕不育专科门诊患者35例.其中特发性少精症18例，特发性严重少精症12例，特发性无精症5例.平均年龄33（2639）岁，婚后不育年限1.58（平均3.5）a.所有患者性功能正常，无生殖系统器质性病变及炎症、阻塞等.10例正常对照精液标本为西京医院妇产科实验室储存，平均年龄27.5（2235）岁.所有研究对象在检测前抽静脉血检查染色体核型（G显带技术）、抗精子抗体（ELISA）及血清激素水平（卵泡刺激素、黄体激素、睾酮，放射免疫测定法），异常者均不列入研究对象. 1.2 方法 精子密度判断根据1992年WHO标准制定，采用北京伟力经贸公司WLKY-9000伟力彩色精子质量检测系统进行检测.研究对象禁性生活3d后，取精液检查，连续2次异常予以确诊.无精症:精液中未见精子;严重少精症:精子密度小于5109 ?L-1 ;少精症:精子密度（520）109 ?L-1 .精液基因组DNA提取采取氛氯仿抽提法.精液标本离心弃上清，生理盐水洗涤后，加入细胞稀释悬浮液、10g?L-1 SDS，3mol?L-1 氯化钠、双蒸水和酚氯仿（VVV25241），离心取上层，加无水乙醇离心，75mL?L-1 乙醇洗涤，双蒸水溶解DNA.紫外分光光度计及20g?L-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度及含量.提取的DNA置-20保存.缺失筛查采用美国Promega公司生产的Y染色体缺失检测系统（Y chromosome Deletion Detection System，Versisn1.1Part#TM234），其包含有Y染色体上与精子生成基因最相关的18个已知序列标记位点引物对.同时扩增18个非多态序列标记位点短DNA片段（分别位于AZFa AZFb AZFc AZFd区域，Fig1）.扩增产物长度为83370bp，琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色观察.试剂盒提供对照梯度标准物.检测系统分A，B，C，D4组反应液，每组内均有一对照引物扩增X连锁的SMCX位点，以作为扩增反应效果和DNA完整性对照.另外设正常男性DNA阳性对照及空白阴性对照.如果测试样品不能扩增出Y染色体特定区域，则意味着测试样品Y染色体有该区域微缺失.初筛异常标本经23次PCR重复检测证实.PCR总反应体积25L，循环条件:942min，941min，5730s，721min，35个循环，最后72延伸5min，4保温.扩增产物在20g?L-1 琼脂糖凝胶，1TBE缓冲液及5V?cm-1 电流条件下电泳.经UV-150紫外线透射分析仪照射后，复日科技FR-2000紫外与分析可见装置扫描成像. 2 结果 35例异常精液标本除5例无精子症外，余30例少精症中28例伴有精子活率低下，精子活率范围3.0%46.6%，平均25.3%.10例对照男性其精子数量及活率正常.所有精液标本采用氛氯仿抽提法提出了精液基因组DNA，经多重PCR扩增，电泳显示特异性SMCX带（83bp），示多重PCR扩增反应有效，提取的DNA具有完整性.35例患者精液基因组DNA经多重PCR扩增检测后发现5例有Y染色体微缺失，缺失率14.3%，其中2例为少精症，3例为严重少精症.5例无精症患者和10例对照男性未发现Y染色体微缺失.缺失表现形式3种:1例AZFc（DAZ+SY157）+AZFb（SY130+SY128）缺失;1例AZFc（DAZ+SY157）+AZFd（SY152）缺失;余3例均为AZFc缺失（Fig1，Tab1）.5例缺失患者均有AZFc缺失，无AZFa缺失，亦无AZFb和AZFd单独缺失.AZFc缺失片段各不相同，但包含有共同缺失片段DAZ（SY254，SY255，Fig1，2）. 图1 略 表1 Y染色体微缺失患者缺失部位、片段及精子密度、活率略 3 讨论 我们发现35例不明原因性无、少精症患者中有5例显示Y染色体微缺失，10例正常对照无一例发现微缺失，提示Y染色体微缺失与男性精子发生相关.Y染色体微缺失发生率报道不一2，3 .Foresta等4 分析不育男性4800例Y染色体基因微缺失，发现无精症男性缺失率最高，其次是严重少精症和少精症.我们的结果只发现严重少精症缺失率高于少精症，5例无精症患者无一例发现微缺失，与无精症患者样本量少可能有关.我们研究表明，缺失最多的部位亦为AZFc区中的DAZ基因，且所有DAZ基因缺失患者均有共同缺失片段:DAZ基因簇中的SY255和SY254，提示此两基因参与精子的发生. 图2 略 关于Y染色体微缺失的机制说法不一，主要认为:Y染色体在精子发生过程中，由于胚细胞快速分裂，与卵子发生过程相比具有更多突变机会;Y染色体不能象常染色体一样进行DNA修复;所有Y染色体基因都是单倍体，故一个基因缺失就能发生效应3 .但也有学者持相反观点:认为Y染色体微缺失形成是一种随机事件，不依赖于Y染色体出现的背景，可能是其它遗传或环境因素所致，Y染色体微缺失是导致男性无、少精症的重要原因. 参考文献: 1Krausz C，McElreavey K.Y chromosome and male infertility J.Front Biosci，1999;15（4）:l-8. 2Maurer B，Gromoll J，Simoni M，Nieschlag E.Prevalence of Y chromosome microdeletions in infertile men who consulted a ter-tiary care medical centre:The Munsteer experience J.An-drologia，2001;33（1）:27-33. 3Hiroshi Kato，Shinji Komori，Yuko Nakata.Screening for dele-tions in interval D1622of the Y chromosome in azoospermic and oligozoospermic Japanese men J.Hum Genet，2001;46（3）:110-114. 4Foresta C，Moro E，Ferlin A.Y chromos