（微生物学专业论文）米曲霉单宁酶产酶条件及其应用的研究.pdf

广西大掌司仕掌位论文米曲霉单宁酮 产翻 条件覆其压佣的研究 米曲霉单宁酶产酶条件及其应用的研究 摘要 单宁酶能水解单宁的酯键和缩酚酸键 生成没食子酸和葡萄糖 也能 水解茶饮料冷却时产生沉淀 茶乳酪 中的化合物 广泛应用于茶饮 料 啤酒 饲料 化妆品 皮革工业等行业 目前 生产单宁酶的成本还 太高 这一方面是因为所选育的菌种产酶量不高 另一方面则可能是因为 产酶的诱导条件并非最佳 因此 开展高效诱导菌株产单宁酶工艺的研究 以降低生产成本 对加快单宁酶在工业上的应用有比较现实的意义 本课题对米曲霉单宁酶产酶条件进行了研究 结果表明 除诱导剂1 单宁 外 诱导剂2 也能诱导米曲霉产单宁酶 本研究采用国内尚未见 报道的新思路来诱导米曲霉产单宁酶 首先用营养较丰富的产菌培养基培 养生长旺盛的菌丝体 然后再用含有诱导剂 诱导剂2 的诱导培养基诱导 菌丝体产酶 所得的单宁酶活力比直接用含诱导剂的产菌培养基诱导产酶 的高1 5 倍左右 用该方法产单宁酶的的最适诱导条件为 诱导培养基含 1 5 诱导剂2 起始p h5 0 3 0 培养7 2h 采用优化的产酶条件所得到 的单宁酶活力达16 7 4u m e 发酵液 比使用单宁做为诱导剂所得的单宁酶 活力高约1 5 倍 对米曲霉所产单宁酶的酶学性质进行了初步研究 结果表明 该酶的 朱曲霉单宁u 产茸 条件反 r a l z j i 的研完 酶促反应最适温度为4 2 c 最适p h 值为6 5 同时 该酶在5 0 c 以下 p h 3 o 7 5 范围内均比较稳定 以壳聚糖作为载体 戊二醛为交联剂 采用交联的方法将单宁酶固定 结果表明 酶活力固定率为7 3 8 6 固定化酶的最适酶促反应温度为5 0 比游离单宁酶提高8 c 最适反应p h 值为6 0 比游离的向酸性漂移 了0 5 个单位 对热和p h 的稳定性有所提高 对底物的亲和力下降 以没 食子酸丙酉旨作为底物时 固定化单宁酶的半衰期为2 2 6 8 h 关键词 单宁酶产酶条件酶学性质固定化茶乳酪 广西大掌硕士掌位论文朱曲霉单宁嗣 产酶条件及 五l 用的研究 s t u d i e s0 np r o d u c t i o nc o n d i t i o n san d a p u c a n o no f 删n a s ef r o m a s p e r g i l l u so r y z a e a b s t r a c t t a n n a s ec a nc l e a v et h ee s t e rb o n d sa n dd e p s i d eb o n d so ft a n n i na c i d p r o d u c i n gg a l l i ca c i da n dg l u c o s e a n dt h ee s t e rl i n k a g e so ft h ec o m p o u n di n c o l dt e a t a n n a s ei sw i d e l yu s e di nt e ab e v e r a g e b e e rp r o c e s s f e e d s t u f f c o s m e t i c l e a t h e ri n d u s t r ya n ds oo n c u r r e n t l y t h ec o s to fp r o d u c i n gt a n n a s ei s v e r yh i g h d u et o t h el o wy i e l do ft a n n a s ef r o mt h ec u r r e n tm i c r o o r g a n i s m s t r a i n sa n dt h en o n o p t i m a lc o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n gt a n n a s e t or e d u c et h e p r o d u c t i o nc o s ta n dm a k ei tt ob eu t i l i z e dr a p i d l yi ni n d u s t r y i ti sm e a n i n g f u lt o s t u d y t h e t e c h n i q u e s o nh o wt oi n d u c e h i g hy i e l d o ft a n n a s ef r o m m i c r o o r g a n i s m t h ec o n d i t i o n sf o rt a n n a s ep r o d u c t i o nf r o ma s p e r y i l l u so r y z a ew a ss t u d i e d i ts h o w st h a tr e v u l s a n t2c a na l s oi n d u c em y c e l i u mt op r o d u c et a n n a s e b e s i d e s r e v u l s a n t1 t a n n i ca c i d i nt h i ss t u d y w eu s ean e wi d e aw h i c hh a sn o tb e e n r e p o r t e di no u rc o u n t r yt oi n d u c ea s p e r y i l l u so r y z a et op r o d u c et a n n a s e t h a ti s e u g o n i cm y c e l i u mw a sf i r s tg a i n e do nn u t r i t i o n r i c hm e d i u m t h e ne u g o n i c g 西大学硕士掌位论文米曲霉单宁 产萄i 条件a 其应用的研究 m y c e l i u mw a si n d u c e dt op r o d u c et a n n a s eo ni n d u c e m e n tm e d i u mc o n t a i n i n g r e v u l s a n t2 t h ea c t i v i t yo ft a n n a s ea c q u i r e da tt h i sc o n d i t i o ni s2 5t i m e sh i g h e r t h a nt h a ta c q u i r e do nt h en u t r i t i o n r i c hm e d i u mc o n t a i n i n gr e v u l s a n t2 t h e o p t i m a li n d u c e m e n tc o n d i t i o no ft h i sm e t h o di st h a ti n d u c e m e n tc u l t u r em e d i u m c o n t a i n s1 5 r e v u l s a n t2 i n i t i a lp hi s5 0 c u l t u r ef o r7 2 hu n d e r3 0 c t h e a c t i v i t yo ft a n n a s ea c q u i r e da tt h eo p t i m a li n d u c e m e n tc o n d i t i o nr e a c hu pt o 1 6 7 4up e rm i l l i l i t r eo ff e r m e n t a t i o nl i q u i d w h i c hi s 2 5t i m e sh i g h e rt h a nt h a t a c q u i r e da tt h ec o n d i t i o nc o n t a i n i n gt a n n i ca c i da sr e v u l s a n t p r e l i m i n a r ys t u d yw a sd o n eo nt h ep r o p e r t yo ft h et a n n a s ep r o d u c e df r o m a s p e r y i l l u so r y z a e t h er e s u l t ss h o wt h a t t h eo p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s 4 2 c t h eo p t i m a lp hi s6 5 a n dt h et a n n a s ei ss t a b l ei nt h ep hr a n g eo f3 0 7 5 a n du n d e r5 0 t a n n a s ew a si m m o b i l i z e db yc r o s s l i n k i n gm e t h o du s i n gc h i t o s a na s c a r r i e ra n dg l u t a r a l d e h y d ea sc r o s s l i n k e r a f t e rm e a s u r i n g t h er a t eo fe n z y m e a c t i v i t y r e c l a i mi sa b o u t7 3 8 6 t h e o p t i m a l r e a c t i o n t e m p e r a t u r e o f i m m o b i l i z e dt a n n a s ei s5 0 c 8 ch i g h e rt h a nt h a to fd i s s o c i a t i v et a n n a s e t h e o p t i m a lr e a c t i o np hi s6 0 c o m p a r et od i s s o c i a t i v eo n e s i ti n c l i n e d a c i d i t yh a s f l o a t e d0 5u n i t s a n di m p r o v i n gt h et h e r m o s t a b i l i t ya n dt h ep h s t a b i l i t y t h e a f f i n i t yt os u b s t r a t ei sk a t a b a t i c u s i n gg a l l i ca c i da ss u b s t r a t e t h eh a l f l i f eo f i m m o b i l i z e dt a n n a s ei s2 2 6 8 h a t 西大掌硕士掌位论文米曲霉单宁i 产 粤条件a 其甚l 用的研究 k e yw o r d s t a n n a s e p r o d u c t i o ne n z y m ec o n d i t i o n e n z y m a t i cp r o p e r t y i m m o b i l i z a t i o n t e ac r e a m v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是在导师指导下完成的 研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容 除己注明部分外 论文中不包含其他人已经发表过的研究成果 也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容 对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体 均已在论文中明确说明并致谢 论文作者签名 祭媚渺 学位论文使用授权说明 沙7 年6 月 日 本人完全了解广西大学关于收集 保存 使用学位论文的规定 即 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版 并提供目录检索与阅览服务 学校可以采用影印 缩印 数字化或其它复制手段保存论文 在不以赢利为目的的前提下 学校可以公布论文的部分或全部内容 请选择发布时间 囱即时发布口解密后发布 保密论文需注明 并在解密后遵守此规定 论文作者签名 籴钢渺导师签名许钐 厶一7 年6 月2 舌日 米曲霉单宁翻 产酶条件及其扈u 啊的研究 第一章前言 单宁酶但c 3 1 1 2 0 全称单宁酰基水解酶 t a n n i na c y lh y d r o l a s e 是一种胞内酶 能水解单宁酸的酯键和缩酚酸键产生没食子酸 葡萄糖及其他化合物 1 近年来 随着 茶饮料工业的迅猛发展 单宁酶得到了深入地研究 美国食品与药物管理局己确定单宁 酶为安全产品0 1 日本也批准了单宁酶的应用 单宁酶在自然界中分布十分广范 较早有关单宁酶的报道可以追溯到本世纪二十年 代 f r e u d e n b e r g 嘲在进行黑曲酶的培养时 发现在其菌丝中含有单宁酶 以后又发现各 类微生物 包括真菌 酵母 细菌也能产生单宁酶 1 单宁酶还存在于一些植物材料 例如茶叶提取物中 据研究发现 单宁酶不仅分布广 而且在工业生产中用途广泛 日益受到人们的关注 单宁酶的用途主要有 1 在茶饮料的生产中 单宁酶作为酶促专溶茶乳酪的专一 酶类 用于降解茶中富含的单宁 可以避免单宁引起的茶乳酪 抑制饮料苦味 混浊 形成清爽舒快的口感 1 2 在皮革的生产中 单宁酶可用于匀化单宁 使生皮蹂化更加 均匀 从而制成高级皮革 4 1 3 在食品加工业中 单宁酶可用于处理橡实 1 使其 可以食用 此外 还可以用于除去天然食品 饲料中因单宁引起的苦涩味 4 单宁 酶还可用于化妆品工业中 许多化妆品都添加了植物提取物 而这些含单宁的植物提取 液会使化妆品出现混浊或结块等现象 如果先用单宁酶处理这些植物添加剂 就可避免 出现这些情况 5 单宁酶不仅可促使单宁降解 还可催化没食子酸丙酯化 1 9 8 8 年 g a a t h o na r i e l 钉等利用反向胶束系统截留单宁酶 由于反向胶束系统适用于疏水化合 物的酶促合成和转换 单宁酶可在适宜的微环境中将单宁中酯键转移给丙醇合成没食子 酸丙酯 p g 6 单宁酶还可用于没食子酸的生产 没食子酸是一种用途广泛的精细化 工原料 医药上常用于制备甲氯苄嘧啶 为磺胺增效剂 联苯双酯 治肝病 克冠 草 治冠心病 等药物 没食子酸还有合成染料 化学分析试剂等用途 随着国民 经济的不断发展 人们生活水平的不断提高 单宁酶势必将获得前所未有的广泛应用 1 1 单宁酶的性质 广西大掌硕士掌位论文 米曲霉单宁硝i 产萌 条件a 其重佣的研究 1 1 1 单宁酶的物理化学性质 纯单宁酶外观为白色或淡黑色粉末 可溶于水形成无色澄清的溶液 不溶于乙醇 在0 d 2 8 0 处有一最大吸收峰 当浓度为1 0 比色皿为l c m xc m 规格时 单宁酶的吸光系数 a 为1 1 8 0 d 2 6 0 的吸光度与0 d 2 8 0 的吸光度之比为0 5 1 1 a d a c h i0 等 1 1 9 6 8 分别用沉 降法和电泳法测定黄曲霉单宁酶的相对分子质量 分别为1 9 4 0 0 0 和1 9 2 0 0 0 并测出分 子中氮含量占1 2 9 用二硝基氟苯 d n p 测定单宁酶的n 末端 发现有两个d n p 氨基 酸产物 分别为d n p a l a 和d n p a r g 说明该酶含有两种亚基 s a d a a k il i b u c h i 等 1 9 6 8 和c h a es o o k y u 等 1 9 8 3 分别采用凝胶过滤法测出他们各自选育的曲霉菌株所产单宁 酶的相对分子质量都是2 0 0 0 0 0 0 k e n j ia o k i 等 1 1 9 7 6 研究发现来源于酵母的单宁酶 的相对分子量为2 5 0 0 0 0 b e v e r i n i m 等 1 9 9 0 从米曲霉中提取制备出商品化单宁酶粉 末 研究发现其可分离为2 个同工酶 单宁酶1 可降解含有酯键的多聚没食子酸衍生物 单宁酶2 可与二聚没食子酸亲和 并且专一地水解多聚没食予酸衍生物 b a r t h o m e u fc 等o 1 9 9 4 测出黑曲霉l c f8 菌株所产单宁酶的相对分子质量为1 8 6 0 0 0 等电点为4 3 c h a es o o k y u 等采用b a r t h o m e u fc s j 方法 对各自提纯的单宁酶进行s d s 一聚丙烯酰胺凝 胶电泳分析后发现 单宁酶分子是由两种亚基组成 但该结果与k e n j ia o k i 等 1 9 7 6 对 酵母单宁酶结构分析的结果不同 后者用同样的方法却只得到一条电泳条带 f a r i a sg m 等 1 9 9 4 对c r y p h o n e c t r i ap a r a s i t i c a 所产的单宁酶进行研究 发现该单宁酶是一 个四聚体 每个单体的相对分子量均为5 8 0 0 0 h a t a m o t o0 等 1 1 9 9 6 研究发现米曲 霉所产的单宁酶是由两个分子量分别为3 0 0 0 0 和3 3 0 0 0 的亚基通过二硫键交联而成 而 天然米曲霉单宁酶则是一个由4 对大小亚基所组成的异质八聚体 分子量约为3 0 0 0 0 0 n i e h a u sj u 等 3 1 9 9 7 从植物p e d u n c u l a t eo a k 橡树 叶子中提取出单宁酶 经凝胶 过滤法测出其分子量分别为1 5 0 0 0 0 和3 0 0 0 0 0 采用s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳测出其单 一多肽带的分子量为7 5 0 0 0 由此得出该天然单宁酶是由相同亚基的二聚体或四聚体组 成 郭鲁宏等 1 1 9 9 9 对黑曲霉所产的单宁酶进行研究 结果发现其相对分子量为 5 8 0 0 0 等电点为4 1 这与上述的某些研究结果相一致 王征等 1 2 0 0 1 对从黑曲霉 中提取的单宁酶用s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得该酶也是由2 种亚基组成 其相对分 子量分别是7 5 9 0 0 和6 0 3 0 0 单宁酶是一种糖蛋白 不同来源的单宁酶糖含量有所差异 y a m a d ah 等乜8 1 1 9 6 8 2 米曲霉单宁捌f 产酶条件反其矗 用的研究 研究黄曲霉单宁酶的糖基占总相对分子质量的2 5 糖基为甘露糖 b a r t h o m e u fc 等 嘲 1 9 9 4 从黑曲霉中提取的单宁酶 其糖基含量可达4 3 而酵母单宁酶的糖基含量更 高 达6 2 并另外含有2 2 的氨基已糖 王征等啪1 2 0 0 1 研究的黑曲霉单宁酶的糖基 含量只有1 2 3 p a r t h a s a r a t h yn 等 1 1 9 7 6 研究发现其选育的黑曲霉单宁酶的糖基 为葡萄糖和甘露糖 肽链通过丝氨酸和苏氨酸与糖基相连接 目前 有关糖基与酶的功 能之间关系的研究尚未见报道 1 1 2 单宁酶的酶学性质 不同来源的单宁酶酶学性质有一定的差异 从表卜l 可看出 温度对来源不同的菌 种单宁酶活力的影响不同 最适温度较高为5 0 6 0 一般在3 0 一4 0 之间 热稳定性最 高为6 0 同样的 p h 对来源不同的菌种单宁酶酶活力的影响也是不一样的 来源于真 菌和植物的单宁酶的最适p h 落在酸性区域 一般为4 0 6 0 2 间 细菌单宁酶的最适p h 一般偏中性区域 真菌单宁酶的p h 稳定性范围一般是3 0 7 0 2 问 y a m a d ah 啪1 1 9 6 8 等报道的黄曲霉单宁酶的酶活力稳定p h 范围最窄 为5 o 一5 5 2 间 总的说来 多数菌株单宁酶的酶活力p h 稳定性都在3 o 一8 0 2 间 最适p h 值为 4 0 6 0 热稳定范围在6 0 一7 0 c 以下 最适温度为3 0 一6 0 表1 1 单宁酶的酶学性质 t a b l e l 1t h ee n z y m o l o g yp r o p e r t yo ft a n n a s c y a m a d ah 等 1 9 6 8 a s p e r g i l l u s 5 o 5 55 o 5 5 6 0 c5 0 c 6 0 s h a r m as h w e t a 等 4 5 6 05 5 3 5 7 56 o 3 0 4 0 3 0 4 0 5 0 4 o 6 55 o 6 0 3 0 3 0 4 0 一 5 5 3 5 8 06 0 5 0 3 0 3 5 3 8 7 8 4 3 5 o 5 5 3 5 4 0 1 0 3 0 3 0 6 0 罾 5 0 5 6 0 3 一 o4 a m m 1 i s e s s u u r 戈 u t u u n 乱血n r h n r u n 昭m m豇驴 酞 一2 酊 c s 0 珏 r 1 n a r 1 r 1 y h 誓e n u e n e n r p u p d p p e h y 距s e s s p c r r a p a a c 噼 等 嘴 等 漕 等 量 m季 腻萼 一喜 一喜 m舢川季 灿 互n豇n o 量n蛔n 锄瓣 8 妻 n 蔓 骱 一 一 o n 髓 n 郭 广西大掌硕士掌位论文 米曲霉单宁j 产酶条件覆其应用的研究 来源于不同菌株的单宁酶动力学性质也稍有区别 y a m a d ah 等嘲 1 9 6 8 就底物浓 度对黄曲霉单宁酶的影响进行研究 以单宁酸为底物 测出l i i l 为0 5 x 1 0 m o l l 以葡 萄糖 i 没食子酸为底物的i 1 l l 为1 4 1 0 1m o l l 以没食予酸甲酯为底物的i m 为8 6 1 0 m o l l r a j a k u m a rg s 等 1 9 8 3 测得来源于黄青霉的单宁酶以单宁酸为底物时 其k m 为0 4 8 1 0 m o l l f a r i a sg m 等嘲 1 9 9 4 测得c y p h o n e c t r i ap a r a s i t i c a 所产 的单宁酶以单宁酸为底物时 其l 1 1 1 为0 9 5 1 0 1m o l l 以栗木单宁为底物时 其i i i l 为 5 0 7 x1 0 一m o l l 而以没食子酸为底物时 l i n 最高 为1 1 o 1 3 1 1 0 1m o l l 故没食 子酸是单宁酶底物中最具竞争性抑制的底物之一 因此 他们得出结论 单宁酶对特定 的单宁底物的相对酶活力可能与该底物中酯键和缩酚酸键的数量有关 s h a r m as h w e t a 等啪1 1 9 9 9 测得黑曲霉所产的单宁酶的i 1 i i 为0 2 x1 0 1m o l l 有关各种金属离子和e d t a 对单宁酶酶活力影响的报道 其结论有比较大的不同 k e n j ia o k i 等 1 9 7 6 研究表明z n c i c u s o c o c i 和n i s o 等不同的金属离子对单宁酶 酶活力无影响 而e d t a 对酶活力的影响也不明显 相反 s a d a a k il i b u c h i 等 1 9 6 8 研究表明任何金属盐对单宁酶均无激活作用 z n c l 和c u c i 则会抑制酶活力或使酶失活 此外 e d t a 溶液也会使单宁酶完全失活 同样的 r a j a k u m a rg s 等 1 9 8 3 研究表明 c u z n f e m g 等不同的金属离子对单宁酶酶活力都有显著的抑制效应 郭鲁宏等 嘲 1 9 9 9 研究发现 除t m n 升和f e 2 能抑制单宁酶酶活力之外 其它金属离子则对酶活力 均无明显作用 1 1 3单宁酶的分子生物学性质 目前 有关单宁酶分子生物学研究的报道不是很多 1 9 9 6 年 h a t a m o t oo s a m u 等 1 克隆出单宁酶的完整基因序列 经研究发现 单宁酶基因中不含内含子 可编码一个含 有5 8 8 个氨基酸残基 分子量约为6 4 0 0 0 的蛋白质 包括一个含有1 8 个氨基酸残基的信 4 l 西大掌硕士掌位论文米曲霉单宁 产u e t 反其应用的研究 号肽 同时 他们还发现单宁酶是由两个分子量分别为3 0 0 0 0 和3 3 0 0 0 的亚基通过二 硫键交联形成 而这两个大小亚基则是由单宁酶基因的前后两部分分别编码而成的 经 过转录 翻译后修饰 最终形成单宁酶 随着进一步的研究表明 具有活性的米曲霉天 然单宁酶是由一个由4 对大小亚基组成的异质八聚体 分子量约为3 0 0 0 0 0 其表达模型 如图卜l 基守辫蔫禹 一v 一 一一 一 一 7 倍母艘l 绷辨 一褂 酒飘驻整塑塑爱豳豳豳翻豳匿 f 墒 j 信号胜打z 菏稿孺蕊瓣添瓣瓣黧弱翁殇藤瓣瀚厂 c 墙 l x r n 衡臼暮t 梵氟曩和 氍羹藩硪 嗣隧鍪嚣渤鏊翟塑墅黧麴鍪藏 k c 一厂 i 鄹l n j 簟纂 h 臻毯窭熏曩毯鍪鍪篓鍪鋈筮糊芒埔 e 墙 l h 墙 舯帅 黧纂 图1 1 单宁酶的基因表达 f i g1 1e x p r e s s i o no ft a n n a s eg e n e 此外 d o is e n i j i 等 4 1 9 7 3 研究发现 指导单宁酶生物合成的m r n a 极不稳定 放 线茵酮 a c t i n o n e 等可迅速阻止其的合成 1 1 4 单宁酶的催化机理 s a d d a k ii i b u c h i 等 3 1 9 7 2 详细研究了米曲霉的催化途径 底物的专一性和抑制 作用 发现单宁酶可催化单宁水解生成没食子酸和葡萄糖 中间产物为1 2 3 4 6 黄醅 酰单宁和2 3 4 6 一四醅酰单宁以及两种没食子酸葡萄糖 其反应途径如图卜2 5 广西夫掌硕士掌位论文 米曲霉 单宁酮 产茸f 条件及其应片 垮研究 e o k i c 1 1 0 i 1 1 c o o c 卜卜 e 一0 i i i t j o r 2 e o r i i c 1 1 0 i r 广r p o r t l c 一0 1 1 j 2 c o r c 0 i o i l c l l o t 一 o 吣 一 一l 0 l c i l 一0 i c t l o 阶 0 0o i l 峙哪 0 9 0 i i旷c 弋广 图1 2 单宁酶水解单宁的反应途径 i 单宁 i i 1 2 3 4 6 黄酰单宁 i i i 2 3 4 6 一四酰单宁 i v 没食子酸葡萄糖 f i g1 2r e a c t i o na p p r o a c ho ft a n n i nb yt a n n a s c i t a n n i n i i 1 2 3 4 6 s u l p h o n y lt a n n i n 1 i i 2 3 4 6 t e t r a c y ld a n n i n i v g a l l i ca c i d g l u c o s e 单宁酶只能水解没食子酸酯类化合物 e s 复合物是否形成决定单宁酶对底物是否具 有催化作用 单宁酶e s 复合物形成具有3 个特点 1 底物必须是没食子酸与醇形成的酯 类 但对醇没有要求 2 底物中酚羟基的数量 排列方式将影响底物与酶的结合作用 3 复合物中酚羟基形成的酯键可被水解 而其他酯键或羧基由于没有直接与酶结合 故不能发生水解反应 但2 6 一二羟基苯甲酸例外 它能产生非竞争性抑制作用 综上所 述 由于酶与底物的结合位点不同 单宁酶并不能水解所有的没食子酸 1 2 单宁酶的来源 单宁酶是一种诱导酶 它是由微生物在单宁或没食子酸的诱导下才能产生 它主要 来自于各种微生物 尤其是真菌类的曲霉属和青霉属 特别是曲霉属里的黑曲霉 a s p e r g i l l u sn i g e r 米曲霉 a s p e r g i l l u so r y z a e 和黄曲霉 a s p e r g i l l u sf l a v u s 嘲1 另外 在细菌 酵母 植物中也有产单宁酶的报道 各种产单宁酶菌种及来源如表1 2 6 广西大掌硕士掌位论文米曲霉单宁确 产酶条件反其应用的研究 a s p e r g i l l u so r y z a e 米曲霉 a s p e r g i l l u sn i g e r 黑曲霉 a s p e r g i l l u sa w a m o r i 泡盛曲霉 a s p e r g i l l u sc a r b o n a r i u s 炭黑曲霉 a s p e r g i i l o sf l s e h e r 费希尔曲霉 a s p e r g i l l u sf l a v u s 黄曲霉 a s p e r g i l l u sj a p a n i c u s 日本曲霉 a s p e r g i l l u ss p e c i e s 曲霉属 f u s a r i u mc h r y s o g e n u m 腐皮镶孢 p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m 产黄青霉 p e n i c i l l i t s p e c i e s 青霉属 r h i z o p u so r y z a e 米根霉 t r i c h o d e r m av i r i d e 绿色木霉 c a n d i d as p 假丝酵母属 a s e o c h y t a 壳二孢属 c u c u m e r i s a p i s i a b o h e m i c a a b o l t s h a u s e r i 和丸v i c i a e b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 地衣形芽孢杆菌 b a c i l l u sp u m l l u s 短小芽孢杆菌 c i t r o b a c t e rf r e u n d ii 弗氏柠檬酸细菌 b a e m o p h i l u s 嗜血菌属 a c t i n o m y c e t e m c o m i t a n s 和h s e g n i s l a c t 曲a c i l l u s 乳酸菌属 p l a n t a r u m l p a r a p l a n t a r u m 和l p e n t o s u s s t r e p t o c o c c u s 链球菌属 g a l l o l y t i c u s c r y p h o n e c t r i ap a r a s i t i c a p e d u n c u l a t eo a k 橡木 q u e r c u s 栎属 r o b u r r h u s 漆树属 t y p h i n a 和t e l l i m ag r a n d i f l o r a l i b u c h is 等 1 9 6 8 d o is 1 9 7 3 b e v e r i n i m 等 1 9 9 0 h a t a m o t o0 等 1 9 9 6 l a n er 等 1 9 9 7 a b d e l n a b ym a 等 1 9 9 9 d i s h i r ac 等 1 9 6 4 b a r t h o m e u fc 等 1 9 9 4 l e k h ap k 等 1 9 9 4 b a r t h o m e u fc 等 1 9 9 6 王征等 1 9 9 8 郭鲁宏等 1 9 9 8 龚加顺等 1 9 9 9 s h a r m as h w e t a 等 1 9 9 9 刘如石等 2 0 0 1 a g u il a rc n 等 2 0 0 1 m a li n is e t h 等 2 0 0 0 l a m b r a k im 等 1 9 9 6 b h a k t ib a j p a i 等 1 9 9 6 y a m a d ah 等 1 9 6 8 b r a d o os 等 1 9 9 7 g u p t ar 等 1 9 9 7 c h a es o o k y u 等 1 9 8 3 b h a k t ib a j p a i 等 1 9 9 6 r a j a k u m a rg s 等 1 9 8 3 n i s h i r ah 等 1 9 6 5 k a r b 等 1 9 9 9 b h a k t ib a j p a i 等 1 9 9 6 k e n j ia o k i 等 1 9 7 6 r e s h e t n i k o v a l a 等 1 9 8 4 m o n d a lk c 等 2 0 0 0 a l a i nm 等 1 9 8 3 a j a yk u m a rr 等 1 9 9 9 n e m o t ok 等 1 9 9 5 o s a w ar o 等 2 0 0 0 o s a w ar 等 1 9 9 5 f a r i a sg m 等 1 9 9 4 f a r i a sg m 等 1 9 9 2 n i c h a u sj u 等 1 9 9 7 g r o s sg g 等 1 9 9 4 1 2 1 单宁酶的发酵生产 单宁酶的生产可采用固体发酵和液体深层发酵两种方法 固体发酵中 虽然设备要 求比较简单 所以易于推广 但其缺点就是容易污染杂菌 而液体深层发酵比较容易控 7 米曲霉簟宁酶产耐 条件及其应用的研究 制 不易污染杂菌 而且生产效率高 所以目前单宁酶的研究和生产多采用液体深层发 酵的方法 大量的研究证明 在培养基中添加单宁或者含没食子酸单宁的原料就可以诱导微生 物产生单宁酶 l i b u c h i 等嘲 1 9 6 7 以a s p o r y z a e 为出发菌株 以单宁酶为诱导物 探讨 了菌株产单宁酶的最适培养条件 k e n j ia o k i 等o 1 9 7 3 以酵母属的c a n d i d as p k i 为 出发菌株 以单宁为诱导物 探讨了培养的最适条件 发现添加了3 的单宁所得的单 宁酶积累量最多 s a p n ab r a d o o 等啪1 1 9 9 6 对产单宁酶的日本曲霉进行摇瓶发酵培养条 件优化 将酶活力提高了1 3 龚加顺等 1 9 9 8 利用离子注入技术诱导得到一株单宁 酶高产的9 7 0 1 菌株 其摇瓶培养的酶活力高达1 3 0 1 1 u m l 比出发菌株9 4 0 1 的酶活力高 了2 8 9 倍 且产酶性能稳定 重复性好 竖年 他们用同样的技术获得了一株单宁酶高 产菌株 对其进行产酶条件优化后 获得了5 3 5 8 m o l s 的高产酶活力 王征等嘲 1 9 9 8 对黑曲霉n o 1 菌株的产酶发酵条件进行优化研究 获得3 1 6 u m l 的较高酶活力 同年 郭鲁宏等 从天然来源中分离得到有较高酶活力的黑曲霉n o 1 7 对其进行产酶条件和 参数优化实验后 其可将单宁生物转化成浓度为1 4 1 9 l 的没食子酸 a j a yk u m a rr 等 从制革厂污水中分离到一株弗氏柠檬酸细菌 其所产的单宁酶酶活力可达1 8 7 u m l a g u i l a rc n 等 2 0 0 0 采用b o x b e h n k e n 因素设计法 对泡盛曲霉产单宁酶发酵中 的3 个重要参数 单宁浓度 转速和p h 值进行优化研究 结果获得了7 1 3 9 l 的菌丝浓度 7 7 1 u g 的单宁酶活力和1 9 9 l 的没食子酸浓度 刘如石等m 1 2 0 0 1 对黑曲霉n o 3 菌株产 酶发酵条件进行优化研究 最高酶活力可达1 4 4 2 5 u l o o m l 发酵液 酶比活力为1 7 7 1 从这些研究来看 上述菌种产单宁酶的活力都不是很高 因此 如何从各方面提高单宁 酶的活力将是一个研究方向 1 2 2 单宁酶的提取与纯化 随着蛋白质提纯技术的进步 单宁酶的提纯技术也在不断的提高 在单宁酶的分离 纯化过程中 破壁取酶是主要的难题 特别是曲霉的单宁酶 曲霉属的单宁酶是一种 胞内酶 为了充分提取单宁酶 首先面临的问题就是如何有效地破壁 使酶最大限度地 释放出来 传统的用超声波 石英研磨 渗透法破壁时 得率较低 b a r t h o m e u fc 等 嘲 1 9 9 4 首次利用冻融法 再加入凝结素伴刀豆球蛋白进行破壁 所得单宁酶活力比传 统方法有所提高 但活力损失仍很严重 竖年 他们利用酶法破壁 将产几丁质酶的链 霉菌菌丝体与产单宁酶的菌种保温培养一段时间后 使得5 3 的胞内酶得以释放 在此 之前 也曾有文献报道过使用几丁质酶 n 一葡聚糖酶或b 一葡聚糖酶破壁 虽然酶法破 8 广西大掌司e 士掌位论文米曲霉单宁哥 产茸f 条件反其矗 用的研究 壁可提高单宁酶的得率 但也给后续的提纯工作添加了困难 对于产胞外单宁酶的菌株 分离提取就简单多了 g u p t ar 等报导了一种提取胞外单宁酶的快速方法 先将p h 调到 单宁酶的等电点 加入单宁和p e g 一6 0 0 0 沉淀单宁酶蛋白 从而提取单宁酶 单宁酶的纯化常常采用层析法 如离子交换柱 疏水层析 分子筛层析等方法 另 外还可以使用超滤截留法 目前 为了适应单宁酶商品化的要求 提纯技术已从复杂且 成本高的实验室技术向简单的工业化生产过渡 其中 b a r t h o m e u fc 等嘲 1 9 9 4 报道 的反向胶束系统可以有效地提高单宁酶的回收量 大大缩短了纯化过程 与其它提纯方 法相比 反向胶束系统更适合于工业化生产 1 3 单宁酶酶活力的测定方法 虽然单宁酶酶活力测定方法对研究单宁酶非常重要 但是酶活力的测定方法始终 没有统一 从而造成了不同来源的酶活力无法相互比较 目前单宁酶的测定法大致归 类为滴定法 分光光度法 比色法及高效液相色谱法等 1 3 1 滴定法 由于单宁在单宁酶的作用下 可分解生产游离的没食子酸 所以可以用n a o h 滴定 以底物单宁的减少量来测得酶活力 但是测定体系中的缓冲液对 o h 的缓冲能力以及单 宁本身的褐色会干扰滴定终点的确定 另外 单宁会随着溶液的p h 值的升高而逐渐水解 从而影响测定结果的稳定性和准确性 4 1 1 9 6 7 i 3 2 紫外分光光度法 s a d a a k i 等 建立了单宁酶酶活力的经典测定方法 其基本原理是根据紫外光区 3 1 0 n t o 处 底物单宁反应前后的光密度会发生变化 从而求得单宁酶的酶活力 此法简 单快捷 误差在1 一3 之间 但对底物单宁纯度要求非常高 王征等 1 9 9 5 在s a d a a k il i b u c h i 建立的紫外分光光度法基础上 以没食子酸丙 酯 p g 代替单宁为底物 在2 7 0 h m 处测定p g 反应前后光密度的变化 从而计算单宁酶的 酶活力 该测定方法简便灵敏 重复性好 1 3 3 视读法 o s a w er 等 1 9 9 3 依据单宁可水解生成游离的没食子酸 没食子酸在空气中暴露 被氧化 颜色由绿色变成褐色 通过比色可测定单宁酶的酶活力的原理 建立了细菌单 宁酶的酶活力测定方法 9 米曲霉单宁翻i 产嗣 条件反其应用的研究 1 3 4 高效液相色谱法 b a r t h o m e u fc 等 1 9 9 4 采用高效液相色谱法连续测定酶促反应过程中没食子酸 的变化量 直接求出酶反应的初速度 该方法准确可靠 但操作繁琐 对实验仪器要求 很高 1 4 单宁酶固定化研究 单宁酶一般情况下 对热 强酸 强碱 有机溶剂等不是很稳定 而且游离单宁 酶只能使用一次 不能反复使用 同时也使得产物的分离纯化较为复杂嗍 将单宁酶固 定后 可以克服上述的不足 提高酶的使用效率 降低生产成本 还可以进行长时间的 装柱或分批式反应 9 1 因此 研究单宁酶的固定化具有重要的经济价值 酶的固定化方法很多 主要分为吸附法 包埋法 结合法 交联法和热处理法等 w e e t a l lh 等刚 1 9 7 4 利用多孔玻璃为载体 对单宁酶进行了固定化研究 发现固定化 酶的p h 稳定范围向碱性漂移 热稳定范围比游离酶更宽 1 9 7 6 年的英国专利也报道单宁 酶用硅土固定 在p h 5 5 4 0 c 条件下处理 冷后浑 效果很好 s a n d e r s o n 等哑1 认为 采用所有通常的方法 并供给有效的原材料 就能将单宁酶固定起来 现在纽约开发公 司已批量生产单宁酶 在我国也有关于单宁酶固定化的研究 如中国农科院茶叶研究所 把单宁酶固定用于多酚类的纯化 离子注入是8 0 年代兴起的一种材料表面处理技术旧1 一些技术人员将离子束用于微生物的诱变育种工作 取得了相当的成果 中科院等离子 体所先后对n 一淀粉酶菌种和利复霉素生产菌进行离子束改良 经诱变筛选利复素菌株 的发酵水平提高了4 0 化学效价达6 3 0 0 个单位嘲 4 8 刚 随着固定化技术的日趋成熟 固定化单宁酶越来越广泛的应用于多个工业行业 1 5 单宁酶的工业应用 单宁酶可用于茶饮料 制革 饲料 食品 化工与制药 化妆品工业等 结合本课 题研究的内容 现着重介绍单宁酶在茶饮料生产方面的应用 2 0 世纪7 0 年代 茶饮料在日本和美国首先出现 并以强劲的发展势头抢占世界饮料 市场 我国的茶饮料在8 0 年代中后期才起步 主要产品为茶汽水和茶可乐 经过2 0 多年 的快速发展 茶饮料生产技术已取得长足的进步 但是 在茶饮料生产过程中 主要存 在有三大技术难点 浑浊沉淀的产生 汤色的褐变删和香气的恶化 其中 浑浊沉淀的 1 0 米曲霉 簟宁萌 产酶条件及其应用的研究 产生是最关键的问题所在嘲1 在茶饮料生产过程中 由于茶汤中多酚类 咖啡碱 蛋白质等通过分子间氢键与疏 水作用形成络合物 可在低温时沉淀 形成 冷后浑 沉淀的出现 严重影响了茶饮 料的感官品质和可溶物总量 因此需要采用物理 化学删或酶法来解决 单宁酶作为酶 促专溶酶 能断裂儿茶酚与没食子酸之间的酯键 使苦涩味的酯型儿茶素水解 释放出 的没食子酸阴离子又能与茶黄素 茶红素竞争咖啡碱 形成分子量较小的水溶性短链物 质 从而降低茶汤的浑浊度 删 僻一驴 投鲁乎曩藏曩凡摹蠢l 一睁囊j 蓑囊曩 乎 随着单宁酶在茶饮料工业中的应用越