产质粒介导AmpC酶肠杆菌科细菌对常用抗生素的体外活性分析.doc

产质粒介导AmpC酶肠杆菌科细菌对常用抗生素的体外活性分析【摘要】目的通过对肠杆菌科细菌质粒介导AmpC酶和超广谱内酰胺酶（ESBLs）的检测及其耐药性分析，探讨其主要耐药机理，指导临床合理用药。方法采用氯唑西林增效试验测定质粒介导AmpC酶，双纸片确诊试验测定ESBLs，并采用最小抑菌浓度法(MIC法)检测12种常用抗生素对这些菌株的体外抗菌活性。结果320株受检菌中共检出产质粒介导AmpC 酶菌145株，产ESBLs菌160株，阳性率分别为45.3%、50.0%。产质粒介导AmpC酶组对氨曲南、头孢曲松、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦均存在不同程度的耐药（45.2%68.5%），其耐药率明显高于非产AmpC酶组，两者相比有显著性差异（P均0.05）。结论肠杆菌科细菌中产质粒介导AmpC酶的检出率较高，并且该类菌多呈多重耐药。临床可采用碳青霉烯类抗生素作为产质粒介导AmpC酶菌感染的经验治疗，也可根据药敏结果选用头孢派酮/舒巴坦、四代头孢菌素或阿米卡星等抗生素治疗。 【关键词】 AmpC酶；氯唑西林增效试验；耐药性分析 当前由于各种β内酰胺酶的产生导致革兰阴性杆菌对β内酰胺酶类抗生素普遍耐药。其中，产质粒介导AmpC酶和超广谱β内酰胺酶（ESBLs）在持续使用头霉素类、β内酰胺酶类、酶抑制剂类复合制剂等抗生素的压力下日益常见，因此及时、准确地检测这些耐药酶并进行耐药性分析，对临床抗感染治疗中正确选择抗菌药物具有重要意义。目前有关产质粒介导AmpC酶与ESBLs细菌耐药性的报道较多1，但大多采用纸片法进行药敏试验。为此我们将余丹阳等2的AmpC酶检测方法稍加改进后，对从临床标本中分离的320株肠杆菌科细菌质粒介导AmpC酶进行检测，同时运用双纸片确诊试验检测ESBLs，然后用最小抑菌浓度法（MIC法）检测12种常用抗生素对这些菌株的体外抗菌活性，以求探讨AmpC酶与耐药性之间的关系。现报告如下。材料与方法1.试验菌株收集2004年12月2006年4月本院分离的头孢西丁（FOX）耐药的肠杆菌科细菌320株，其中100株为大肠埃希菌，105株为阴沟肠杆菌，45株为产气肠杆菌,10株为河生肠杆菌,20株为肺炎克雷伯菌，18株为产酸克雷伯菌,12株为催产克雷伯菌,10株为其它肠杆菌科细菌。全部细菌均经法国生物梅里埃公司VITEK2全自动微生物分析仪及其配套GNB鉴定卡确认。以不产酶的大肠埃希菌ATCC 25922作为AmpC酶阴性对照，以已知产质粒介导AmpC酶的阴沟肠杆菌作为AmpC酶阳性对照。2.抗生素药敏试验药敏纸片头孢西丁（FOX）、头孢他定（CAZ）、头孢他定+克拉维酸（CD02）、头孢噻肟（CTX）、头孢噻肟+克拉维酸（CD03）、头孢曲松（CRO）和氨曲南（ATM）均为英国OXOID公司产品。药敏卡为法国生物梅里埃公司产品，批号为060204。药敏试验采用最小抑菌浓度法（MIC法），按美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）2004版标准判断结果。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 28753和大肠埃希氏菌ATCC 25922。ESBLs的检测严格按照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）2004版标准进行。3.双纸片氯唑西林增效试验用灭菌蒸馏水将氯唑西林制成10 mg/ml的溶液，用微量加样器取20 μl氯唑西林溶液加于标准CAZ、CTX、CRO和ATM药敏纸片中心，制成含200 μg氯唑西林的复合药敏纸片，于超净台中晾干后置-20冰箱保存备用。纸片药敏试验的操作按NCCLS推荐的纸片扩散法进行。氯唑西林复合药敏纸片与其相应的标准药敏纸片应贴在同一块涂布好受检菌的MH平皿上，以保证两种纸片对同一受检菌的抑菌环直径具有可比性。如果氯唑西林复合药敏纸片的抑菌环直径超过相应标准药敏纸片的抑菌环直径5 mm或5 mm以上，判断为阳性；反之，判断为阴性。4.统计学处理采用统计学软件Epi Infor 2000对试验数据进行分析，率的比较采用χ2检验。结 果1.肠杆菌科细菌产质粒介导AmpC酶及ESBLs检出情况 320株受检菌中检出产质粒介导AmpC酶菌为145株（45.3%），检出产ESBLs菌160株（50.0%），同时产质粒介导AmpC酶及ESBLs菌为60株（18.7%）。结果见表1。表1 320株肠杆菌科细菌产质粒介导AmpC酶及ESBLs酶的检出率菌株（略）2.肠杆菌科细菌对常用抗生素的药敏试验结果将产质粒介导AmpC酶组药敏结果与非产AmpC酶组比较，ATM、CRO、PIP及TZP两组间耐药率存在非常显著性差异(P0.01)，具体结果见表2。表2 产质粒介导AmpC酶菌和非产AmpC酶菌的耐药率比较药名 产质粒介导AmpC酶组(略)注：AMP、SAM、AK、ATM、CIP、CRO、KZ、FEP、IMP、PIP、TZP、SCF分别为氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿米卡星、氨曲南、环丙沙星、头孢曲松、头孢唑啉、头孢吡肟、亚胺培南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢派酮/舒巴坦的英文简写。P值为产质粒介导AmpC酶组和非产AmpC酶组的耐药率比较。 3.肠杆菌科细菌的多重耐药情况320株受检菌中5重以上耐药者占40.8%，其中产质粒介导AmpC酶组5重以上耐药者占62.8%， 非产AmpC酶组5重以上耐药者占35.8%，两者相比有显著性差异(P0.05)。讨 论AmpC酶属于Bush功能分类中类酶及Amber分子分类中的C类酶，该酶能水解一、二、三代头孢菌素及单酰胺类抗生素，且不被临床上现有的β内酰胺酶抑制剂类抗生素抑制，故产质粒介导AmpC酶菌株引起的感染较产ESBLs菌株更加难治。目前较为公认的检测产质粒介导AmpC酶的方法是头孢西丁三维试验，但其操作繁琐而难以在临床实验室常规开展。本文采用双纸片氯唑西林增效法检测AmpC酶，具有操作简便，结果准确等优点。本文结果显示肠杆菌属细菌质粒介导AmpC酶检出率最高，达52.9%，其次是克雷伯菌属细菌和大肠埃希氏菌（分别为37.5%和35.0%），这与文献报道3基本一致。在320株受检菌中，产质粒介导AmpC酶菌为145株(45.3%)，产ESBLs菌为160株（50.0%），同时产质粒介导AmpC酶和ESBLs菌为60株（18.7%）。从表2结果可知产质粒介导AmpC酶组的MIC50、MIC90及耐药率大多高于非产AmpC酶组，这在一定程度上表明了产质粒介导AmpC酶是造成肠杆菌科细菌耐药的主要原因之一。产质粒介导AmpC酶组对于氨曲南，头孢曲松、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦均存在不同程度的耐药，其耐药率从45.2%68.5%不等，明显高于非产AmpC酶组，两者相比有显著性差异（P均0.05）。产质粒介导AmpC酶组对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦，环丙沙星，头孢唑啉、头孢吡肟耐药率均较高（41.3%94.2%）；对阿米卡星、亚胺培南、舒普深的耐药率均较低（0%34.6%），与非产AmpC酶组相比无显著性差异，这与文献报道基本一致4。与此同时部分菌株还表现出多重耐药性，主要是以耐氨苄西林，氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉为主，这可能与β内酰胺类抗生素在临床的大量应用有关。320株肠杆菌科细菌中5重以上耐药者占40.8%，其中产质粒介导AmpC酶组多重耐药率大大高于非产AmpC酶组，两者相比有显著性差异（P0.05）。两组菌对头孢吡肟的耐药率均较高，这与两组中存在大量的产ESBLs菌株有关。由此可见，当产质粒介导AmpC酶又产ESBLs时，则四代头孢菌素不宜选用，但对于单产AmpC酶菌而言，四代头孢菌素如头孢吡肟仍然可以治疗产质粒介导AmpC酶菌引起的感染。亚胺培南是目前抗革兰阴性杆菌最好的抗菌药物，本文所有受检株对其无一耐药。另外舒巴坦和他唑巴坦对AmpC酶有一定的抑制作用，与抗生素联用时，可增强抗生素的杀菌作用。因此提示临床可用碳青霉烯类抗生素作为产质粒介导Ampc酶菌感染的经验治疗，也可根据药敏结果选用头孢派酮/舒巴坦、四代头孢菌素或阿米卡星等抗生素治疗。由于产质粒介导AmpC酶组与非产AmpC酶组在耐药性方面存在明显差别，所以对于严重感染病人进行质粒介导AmpC酶的检测及耐药性分析，可为临床合理使用抗生素提供试验依据，同时对于了解耐药机制，延缓细菌耐药性的产生，控制耐药菌株流行均具有十分重要的意义。【参考文献】 1刘素玲,彭少华,程文娟，等.头孢西丁耐药肠杆菌科高产AmpC酶的细菌研究J.山东医药,2005,45(23):871-873.2佘丹阳,刘又宁,崔岩，等.双纸片氯