分子生物学综合.doc

名词：极性突变：在一个操纵子中，与操纵基因毗连的结构基因发生终止突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响其后结构基因多肽的翻译外，还影响其后的结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。端粒：在染色体末端具有一种特殊的结构，它对维持染色体的稳定性起着十分重要的作用，这种结构被称为端粒。摇摆假说：反密码子和密码子在一定范围内的可选择配对现象。同功受体：负载同一种氨基酸，但识别不同密码子的tRNA。顺式作用元件：基因序列中可在原位发挥作用并影响与其在物理上相连的基因表达的保守结构（DNA和RNA）。分子伴侣：是一组以非共价连接方式参与多肽链的折叠、组装，但又不参与该肽链分子功能的蛋白质。包括热击蛋白和环境胁迫蛋白。同工受体tRNA：能解读同义密码子的不同tRNA被定义为同工受体tRNA。第二章：顺反子理论：基因（顺反子）是染色体上的一个区段，在一个顺反子内有若干个交换单位，最小的交换单位被称为交换子。在一个顺反子中有若干个突变单位，最小的突变单位被称为突变子。在一个顺反子的结构内，如果发生突变就会导致功能的丧失，所以顺反子只是一个具有特定功能的、完整的、不可分割的最小遗传单位。全同等位基因：在同一基因座位中，同一突变位点向不同方向发生突变所形成的等位基因。非全同等位基因：在同一基因座位中，不同突变位点发生突变所形成的等位基因。影响双螺旋结构稳定性的因素氢键；磷酸酯键；Na盐生理条件下，可有效屏蔽带较强负电荷的两条核苷酸链上磷酸基团间的静电斥力；碱基堆积力：疏水作用力和范德华作用力；碱基对之间的挤压，抵御可以使DNA分子的内能增加，氢键作用力被减弱。DNA分子的复性影响因素：Na+浓度；温度；长度；浓度；核苷酸的排列或核苷酸序列的复杂性DNA的三级结构:当施加外力后，将线状DNA的两端固定或连接成环状分子，这种不能被释放的张力只能通过使分子内部形成反向扭曲的方式而被抵消，从而使螺旋体的结构保持稳定，这种扭曲称为超螺旋。正超螺旋：向右旋分子施加右旋外力，DNA出现向左旋的超螺旋结构。 负超螺旋：向右旋分子施加左旋外力，DNA出现向右旋的超螺旋结构。 L（DNA双链分子的交叉数）=T（DNA分子的初级螺旋数）+W（DNA形成的超螺旋数）溴化乙啶（EB） DNA染料（紫外线激发，红光）负超螺旋变为正超螺旋超螺旋数初级螺旋数=超螺旋密度不同生物超螺旋密度几乎相同均为-0.05，是生活细胞维持部分DNA区域结构改变和整体稳定所必需的力学特征。拓扑异构酶 原核生物酶 真核生物切缝酶切点C下游的第4个碱基处消除1个负螺旋 单链 p48拓扑异构酶 原核生物螺旋酶或旋转酶亚基磷酸二酯酶活性亚基ATP酶活性引入2个负螺旋 双链 p49间隔基因 真核生物的结构基因是由若干外显子和内含子序列相间隔排列组成的间隔基因。外显子是指DNA上与成熟mRNA对应的核苷酸区段，或结构基因在DNA中的氨基酸编码区，或间隔基因中的非间隔区。内含子是指结构基因中可转录但在mRNA成熟之前又被剪切的核苷酸区段，即DNA与成熟mRNA中的非对应区，或结构基因在DNA中的氨基酸非编码区，或间隔基因中的间隔区。间隔基因存在的普遍性:1 绝大多数结构基因是间隔基因，tDNA 和rDNA也是间隔基因。2 间隔基因不仅是真核生物基因的主要结构形式，原核生物中也有间隔基因 的存在。3 在某些低等真核生物的线粒体以及叶绿体基因中也发现了断裂现象，这种DNA和相应信使RNA结构上的差异在真核生物中是普遍的。间隔基因的相同性：1.间隔基因的外显子在基因中的排列顺序和它在成熟mRNA产物中的排列顺序是相同的。2.某种间隔基因在所有组织中都具有相同的内含子成分。3.核基因的内含子通常在所有的可读框中都含有，因此一般都没有编码功能。4.大多数内含子上发生的突变不影响蛋白质的结构，但也有例外。间隔基因形成的假说：内含子先存论 内含子后生论 间隔基因在进化中的意义：1 有利于生物遗传的相对稳定2 增加变异概率，有利于生物的进化3 扩大生物体的遗传信息储量4 利用内含子进行代谢调节转座倒位/易位特定的基因片段断点随机的任意DNA片段可能破坏某结构基因UV/诱变剂无效UV/诱变剂可提高频率高频率的回复突变形成易变基因不能产生回复突变转座需要转座酶，IR序列Rec A，Rec B，Rec D等与复制有关的过程DNA链的断裂与错接的过程第三章：DNA复制的模式新起始方式或复制叉式每次复制的起始均从一个固定复制起点开始，转录激活作用使双链DNA开链，启动前导链的连续复制并在两个方向形成复制叉，后随链按不连续方式合成冈崎片段。滚环方式或共价延伸方式A.174病毒DNA通过吸附和穿透进入寄 主细胞后，单链DNA经复制成为双链复制型（RF），B.随后RF按一种滚环复制方式产生约60个左右的RF，C.最后RF中的负链（-）又以滚环方式复制出多拷贝的正链（+）单环病毒分子。与新起始方式的明显区别：a.滚环复制的起点是在RF型DNA分子的正链上形成一个缺口。b.随着模板链的滚动，新生正链不断在3末端延伸，因此也称这种方式为共价延伸方式c.当其完全游离出亲本单环负链后自身又作为模板链按不连续方式合成冈崎片段。d.滚环复制前导链的启动不需要引物，也不需要转录激活，直接在3-OH端切口上启动复制。置换式或D环方式真核生物线粒体两个复制原点DNA复制体的结构与复制的回环模型：DNA的复制是由多种酶类共同参与的一个复杂的酶促反应过程，包括DNA聚合酶，DNA聚合酶，引物的引发酶，DNA解旋酶，单链结合蛋白，连接酶等在内的如此众多的酶分子均集中在复制叉处组成一个复合体协同互作，共同完成DNA分子的复制过程，这种复合体也称为复制体。回环模型：在复制叉处仅有一个大型的DNA复制体，后随链的一个冈崎片段DNA以倒退的方式从DNA聚合酶中将模板释放出来，新的冈崎片段的DNA单链与前导链一样，以相同的方式完成转座。避免5端短缩的共联体假说：线状DNA分子两端有丰足末端，从而保证了合成的两条子代DNA分子在5末端的单链缺口处互补，形成共联体。线形DNA分子的两端具有同源性很高的167bp的正向重复序列（丰足末端），其中有一个RNase切点真核生物避免5端短缩的机制真核生物染色体末端的特异结构-端粒端粒：在染色体末端具有一种特殊的结构，它对维持染色体的稳定性起着十分重要的作用。端粒的结构DNA端粒由简单的串联重复序列组成人和其他脊椎动物：AGGGTT纤毛原生动物四膜虫：GGGGTT和GGGGTTTT面包酵母：G13T和G15A共同特点：富含G；长度达几百到几kb；人类DNA端粒长几kb到几十kb。端粒DNA序列有取向性：染色体末端，富含G的单链为53延伸。染色体末端与特定蛋白形成复合物。染色体DNA末端形成一个环状结构环是由端粒的3单链末端取代双链DNA中的同源区形成的，这个过程由TRF2催化。 真核生物的端粒酶与避免5端缩短的机制端粒酶(Telomerase)：是催化端粒合成的酶。它是由一条RNA和多种蛋白质构成的核糖核蛋白复合体。端粒酶中的蛋白部分具有逆转录酶活性，能以其自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA。避免5短缩的机制：端粒酶与染色体末端的3单链区域结合，端粒酶中的RNA与DNA配对，并以其序列为模板，以DNA3-OH为引物，完成一个重复单位的延伸后，端粒酶向3端移动，启动下一次复制。循环复始，当数十次重复的cDNA端粒末端形成后，3自行回折在G-G之间以Hoogsteen配对方式连接，与5端结合。第四章：转录：在RNA聚合酶的作用下，以双链DNA中的一条单链作为模板，按A-U和G-C配对的原则合成RNA的过程。RNA的加工：（1）加工的概念新合成的前体RNA分子所经历的结构和化学方面的修饰与成熟的过程。5末端的加帽3末端的多聚腺苷化（加尾）内含子剪接编辑修饰内部腺嘌呤甲基化 tRNA 转运氨基酸rRNA 合成蛋白质mRNA 蛋白质合成模板hnRNA 真核生物的前体mRNA长短不一，序列的复杂程度很高，称为核内不均一RNA。snRNA 小核RNA参与hnRNA的剪接scRNA 小胞浆RNA信号识别体的组成成分anRNA 反义RNA对基因的表达起调节作用Ribozyme RNA 核酶有酶活性的RNAmRNA 核糖核酸蛋白体hnRNPtRNA 外切酶tRNA核苷酸转移酶在分子的3末端加上三核苷酸。rRNA 由RNA聚合酶合成的45S前体rRNA在合成过程中与加工体或核内小分子核糖核酸蛋白缔合，加工在此处发生。hnRNA与蛋白质结合成核糖核蛋白颗粒（hnRNP）。 加工的目的RNA加工是遗传信息的重新编辑的过程。RNA既是遗传信息载体，又是重要的功能分子（核酶）RNA多样性 加工的普遍性加工的过程RNA的5端戴帽加帽反应步骤：由磷酸酶催化脱去嘌呤核苷酸的一个磷酸。鸟嘌呤转移酶催化加上一个倒转的一磷酸鸟苷酸，55磷酸二酯键由（鸟嘌呤-7）甲基转移酶催化，在G7位甲基化，产生0型帽子（Cap-0，m7GpppXpYp）型帽子：第1位核苷酸的2位也甲基化，形成m7GPPPXmpYp普遍存在型帽子：第1、2位核苷酸的2位均甲基化，成为m7GPPPXmpYmp，发生很少。真核生物帽子结构的复杂程度与生物进化程度关系密切。意义：a.成熟mRNA运出核孔所必需的结构，为翻译起始酶eIF4e识别mRNA的5端提供重要的信号b.防止RNA5端降解，增加mRNA的稳定性，以便和核糖体结合，加帽反应可用来调节蛋白质合成c.与某些RNA病毒的正链RNA合成有关。d.5端的完整结构将有利于第一个内含子的剪切。 RNA3端的多聚腺苷化真核生物成熟mRNA的3端带有200-250个腺苷酸残基，称为多腺苷酸尾巴。转录后在RNA末端腺苷酸转移酶的催化下，以ATP为底物添加到mRNA的3端。加尾识别序列：3端拖尾序列中存在6个核苷酸的高度保守序列AAUAAA，或多腺苷酸化位点。多腺苷化的加工因子必需与RNA聚合酶的羧基端域（CTD）结合，才能识别多腺苷酸化信号。加尾识别序列的保守性和重要性多腺苷酸化意义：a.参与新生RNA从DNA/RNA/RNA聚合酶三联体复合物中的释放b.与转录偶联既能促进转录终止，也能防止mRNA早熟c.参与前体的3端内含子的除去d.稳定mRNA e.影响翻译效率 RNA的剪接将真核生物间隔基因内部的内含子剪除，同时将外显子连接起来形成成熟的RNA分子的过程。顺式剪接5剪接位点或供体位点3剪接位点或受体位点剪接机制即采用序列互补和分子折叠的方式将被内含子隔开的供点和受点连接在一起。内含子分类（内含子和外显子边界序列的保守性）：A.型内含子的结构和剪接（四膜虫）内含子结构特点：前体RNA中内含子边界序列5U-G3；内含子序列中含有多对内部核心序列CCS，成对反向平行，序列互补，可以形成分子内双链二级结构，保证长的内含子能有序的折叠；在靠近的内含子的5边序内，存在一段与5供点、3受点序列发生互补，形成二级结构的内部引导序列IGS，利用其将供点U与受点G靠近以进行剪接。剪接过程是由具有催化活性的RNA分子通过转脂反应完成自我剪接的。这种自身具有酶活性的RNA分子被命名为核酶ribozyme作用方式剪切型：作用相当于内切核酸酶的作用，可催化RNA分子切除一段核苷酸序列。剪接型：作用相当于内切酶和连接酶两种酶的联合作用，催化自身RNA进行剪切和连接。B.型内含子的结构和剪接a.边界序列供点，受点符合GT-AG法则b.在靠近内含子3端受点上游PyPuPyPyUAPy7nt分支位点，A为完全保守的碱基。c.分支位点两侧存在一些短的序列，与其上游互相成为反向重复序列（IR），形成茎 环结构。 A不在IR序列内，成为转酯攻击位点C.型内含子的结构和剪接a.边界序列供点，受点符合GT-AG法则b.PyXPyUPuAPy7nt分支位点，A为转酯攻击位点。 c.内含子内部序列不能形成有序的二级折叠，必须由snRNA逐级组装成剪接体才能完成剪接过程。 与型区别剪接体是40-60S的核糖核蛋白复合物，由核内一种富含U的小分子RNA（UsnRNA）和若干剪接蛋白组成。作用是通过不同RNA分子之间的互补序列，将内含子的3个关键位点-5供点、3受点和分支位点精确而又有序的聚在一起，便于完成转酯反应。反式剪接：锥虫的可变表面糖蛋白（VGS）的基因成熟RNA的5端上游结合了一段35nt的外来RNA，有高度保守序列AGTTT：被剪接的前导序列SL或小外显子型内含子前体mRNA中，起始密码AUG的上游序列被称为引导序列，其中第30-70nt序列内存在反式剪接方式通用的受点5-AG。与SL中的供点3-GU以2-5磷酸酯键连接形成Y-内含子结构。选择性剪接：从5端向3端对内含子进行逐一的剪接称为组成性剪接。对内含子以及外显子进行选择性的剪接称为选择性剪接。不同细胞或组织的选择性剪接可以由单一基因或一个初级转录物产生多种蛋白质，这种蛋白称为同源异型蛋白第五章：核糖体的主要作用：一提供tRNA，mRNA和相关蛋白质因子的结合位置，使它们在核糖体上保持正确的相对位置二包括rRNA在内的组分具有催化功能，能执行翻译中许多关键的化学反应。（循环使用）亚基可被重复利用终止密码子UAG（琥珀型，Amber） UAA（赭石型，Ochre）UGA（蛋白石型，Opal）摇摆假说密码子第1、2位碱基必需按标准配对，第3位碱基和tRNA反密码子第1位碱基的配对可以有一定灵活性。蛋白质的翻译：将核苷酸的序列通过密码子的方式转换为氨基酸的序列，并准确地合成肽链。起始：蛋白质合成装备的组装、模板mRNA在核糖体的准确定位以及起始氨基酸的插入。起始因子IF的蛋白质延伸：核糖体以3个核苷酸残基为单位沿着mRNA移动，聚合的肽链由N端向C端逐步延伸（氨基酸转移，转肽和易位）EF GTP水解终止：核糖体遇到终止密码时翻译停止，核糖体上附着的mRNA及合成的肽链被释放，翻译装置解体，循环使用。第六章：免疫球蛋白(Ig)的多样性T淋巴细胞功能是调节免疫应答，杀伤抗原，但不分泌抗体，细胞免疫。B淋巴细胞由骨髓分化成熟，主要功能是分泌免疫球蛋白(Ig)，称为体液免疫。免疫球蛋白的结构和多样性免疫球蛋白由两条重链和两条轻链由二硫键连接构成了Y型的对称结构。N端可变区（V区）识别抗原，多变性表现抗体的多样性。C端的恒定区（C区）重链CH1，CH2，CH3效应区抗体和抗原结合时此区可变换角度，以适应不同大小的抗原决定簇。抗体多样性产生机制：V基因的数量较多，存在有30个V、300个V和1000个重链V基因。V-J和D-J的连接组合多，由于V与J或D的连接是随机的，这样轻链的V基因和J区域或者是重链的V、D和J区域的组合成为另一个高度可变因素，会产生许多的V-J和V-D-J连接形式。V-J和V-D-J的重组并非总是精确的，往往会出现一些错误，进而增加抗体的多样性。在D与J片段的连接处，经常存在一系列核苷酸由末端转移酶催化而插入到DNA中，这样也会进一步导致抗体的多样性。有证据显示，在V基因中存在体细胞突变，这些突变也是导致抗体的多样性一个因素。B细胞中所合成的任何一条轻链都可和任何一条重链组合，在每个B细胞中，不同轻链和重链的组合进一步地增加了抗体的多样性。由于相似结构的抗原决定簇间的交叉反应，一个抗体经常能够与不止一个抗原决定簇反应。RNA干涉RNA干涉（RNAi）是指短的双链RNA可以降解内源的同源mRNA，而使相应基因表达沉默的一种现象，属转录后的基因沉默（PTGS）。广泛存在于原核生物和真核生物中，是原核和真核生物中广泛存在的基因表达的调控机制。RNA干涉使基因沉默表现为以下特征：RNAi是转录后水平基因沉默的机制。RNAi具有极高的干涉特异性RNAi具有极高的干涉效率dsRNA介导的干涉表现为惊人的细胞穿透力。RNAi的分子机制RNA干涉可分为起始和效应阶段起始阶段：加入的小分子RNA或者内源产生的dsRNA被切割为21-23个核苷酸长度的小分子干扰RNA片段。内源的依赖RNA的RNase参与反应（Dicer酶），以一种ATP依赖的方式逐步切割双链RNA成干扰RNA片段。效应阶段：siRNA双链首先与一个核酶复合物结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。RNAi分子机制的另一个模型是：随机降解的PCR在线虫和植物中，依赖RNA的RNA聚合酶RdRP对RNAi是必须的。 RdRP以配对的siRNA为引物，以靶RNA为模板，类似PCR扩增形成dsRNA，然后由Dicer切割形成新的siRNA，进入下一步反应。可解释RNAi的高效性和干涉效应的可扩散性。miRNA（21nt的RNA，由茎环状的单链RNA前体剪切，可形成蛋白复合体miRNP）功能：参与转录后的基因沉默过程，在生物体的生长、发育、分化、凋亡等方面可能起着关键的作用。miRNA与siRNA的区别：microRNA是内源的，siRNA主要为外源导入的miRNA不能介导靶RNA的降解，但可与靶RNA不完全互补，抑制蛋白质的翻译。miRNA与siRNA的相同处：形成都需要Dicer，形成的复合体中具有相同的蛋白组成，人工的siRNA在体内能产生类似miRNA的功能，内源miRNA在与靶RNA完全互补的前提下，也能表现剪切靶RNA的干涉效应，因此，两者可能有基本相同的作用途径。6.7 翻译后的基因表达调控6.7.1蛋白质前体的加工加工过程：N端甲硫氨酸和信号肽的切除细菌蛋白质氨基端的甲酸甲硫氨酸的甲酰基在脱甲酰化酶的作用下水解。无论是原核还是真核细胞，在蛋白质合成完成前，N端的Met将被切除；而分泌蛋白的信号肽在穿膜后被内质网腔的信号肽酶切除和水解。新生肽链剪切加工如新合成的胰岛素前体是胰岛素原，必须先切除信号肽变成胰岛素原，再切除C肽，才能变成有活性的胰岛素。伴刀豆蛋白A的成熟加工过程。P268图多肽的修饰新合成的多肽的氨基酸侧链被磷酸化，糖基化，乙酰化，羟基化和甲基化等。羟基化（hydroxylation）是多肽链上的脯氨酸和赖氨酸残基在内质网中受羟化酶、分子氧和维生素C作用产生羟脯氨酸和羟赖氨酸。如果胶原蛋白的羟基化受抑制，则胶原纤维不能进行交联，将极大地降低它的张力强度。二硫键的形成两个半胱氨酸的巯基氧化形成的，二硫键的形成对许多酶和蛋白质的活性是必需的。亚基的聚合6.7.2 蛋白质的转运（或分泌）蛋白质的合成位点与功能位点常常是分开的，蛋白质要发挥功能还必须经过多种途径到达其作用区域。原核细胞中核糖体附着在细胞内膜上，新合成的蛋白质穿过内膜进入细胞间质中，通过细胞外膜扩散到细胞外。真核细胞中核糖体或游离或附着在粗糙内质网上，在游离的核糖体上合成的蛋白质可扩散到细胞质中，而在粗糙内质网上的核糖体合成的蛋白质则必须经过高尔基体等几个膜系统，通过选择，加工，然后分泌、扩散或运输到其功能部位。6.7.2.1 翻译转运同步机制蛋白质分泌的信号肽假说分泌蛋白是一类典型的翻译和转运同步进行的蛋白质，对这类蛋白质跨膜转运的研究使人们认识到包括内质网或质膜的蛋白质转运的机制，即信号肽假说。分泌是蛋白质从细胞内部释放到胞外空间的过程。卵蛋白、免疫球蛋白等，蛋白质的穿膜过程与肽链的延伸相结合，翻译和转运是同步的。1.原核生物分泌蛋白穿膜的分子模式完整的信号肽是保证蛋白质转运的必要条件。仅有信号肽不足以保证蛋白质转运。指导蛋白质转运的信号可能要长于蛋白酶降解掉的信号肽链。信号肽的切除并不是蛋白质转运所必需的。2. 真核细胞分泌蛋白穿膜的分子模式真核细胞中分泌蛋白的转运需要信号受体蛋白和船坞蛋白等两个重要的蛋白质因子参与。SRP功能：SRP能识别正在合成的并将通过内质网膜的蛋白质信号肽，这是多肽正确转运的前提。暂时终止多肽链的合成SRP-信号肽-多核糖体复合物与内膜上的SRP受体蛋白-船坞蛋白结合。6.7翻译后的转运机制蛋白质主要在粗面内质网上合