分别用鲜草与干草生产的鱼腥草注射液指纹图谱对比研究.doc

分别用鲜草与干草生产的鱼腥草注射液指纹图谱对比研究【关键词】 鱼腥草注射液摘要 采用GCMS分析了21个厂家的鱼腥草注射液指纹图谱。结果发现，采用干草和鲜草生产的注射液的指纹图谱之间存在一定的差异。在药材干燥过程中发现，药材挥发油的含量及主要化合物的含量随干燥时间的变化与鱼腥草注射液的研究结果非常一致，结果说明鲜草注射液与干草注射液指纹图谱之间的差别主要是由于原药材的干燥程度所引起。在鱼腥草注射液指纹图谱标准制定中应该考虑到两类药材的影响。关键词 鱼腥草注射液，指纹图谱，色谱质谱1 引言鱼腥草注射液是鱼腥草的水蒸气提取物，它被广泛地应用于痰热咳血、 白带、 尿路感染 1。在抑菌、抗病毒、治疗白血病、抗氧化和抗诱变等方面也具有较好的疗效。鱼腥草主要生长在我国的东南和西南地区阴凉潮湿的山谷坡地，厂家根据自身的条件，有的采用干的鱼腥草，有的则用鲜药材。在我国鱼腥草注射液40多个生产厂家中，采用鲜草和干草生产注射液的厂家约各一半。研究两类原料生产的注射液产品之间化学成分是否存在差异，这些差异是否是由原料引起等问题，以增加产品质量的可控性非常重要。2 实验部分2.1 供试品的制备分别取21个厂家的鱼腥草注射液200 mL，水蒸气蒸馏40 min，挥发油直接用正己烷收集，定容至2 mL。4储存。鱼腥草于2004年8月，在湖南怀化湖南正清制药厂的鱼腥草研究基地采得，由怀化学院生物系伍贤进教授鉴定。按0.8 Kg/批，分成7批，在242条件下分别自然干燥0、0.5、1、2、4、8和16 d。然后按中国药典(2000 版)的要求提取鱼腥草药材的挥发油。4储存，分析时取20 L挥发油，溶于1 mL的正己烷中。2.2 GC/MS分析条件GC2010型气相色谱仪、QP2010 质谱检测器（日本岛津公公司）；class5k 软件； OV1 毛细管柱 (30 m0.25 mm i.d., 膜厚0.25 m)。进样口温度280，检测器温度230，载气为氦气，恒流模式，流速0.70 mL/min，分流比101，程序升温：50（6 min）10min230（16 min）。进样量：1.0 。质谱检测器，电离方式EI，电离能量70 e，质量范围20450 ，扫描间隔: 0.2 s/次。3 结果与讨论3.1 干草和鲜草鱼腥草注射液GCMS 指纹图谱分析鱼腥草注射液按上述的GCMS条件进行分析。110号厂家所用的原料为新鲜鱼腥草，1121号厂家所用的生产原料为干草。为了使样品具有代表性，每个厂家注射液各取10批，GCMS分析后，对10批 注射液的指纹图谱求均值，各均值指纹图谱代表各厂家注射液指纹图谱，均值指纹图谱结果见图1。 图1 不同厂家注射液的均值指纹图谱（略）Fig.1 Mean fingerprints of Houttuynia cordata injections from different factories为了表征两类注射液之间的差异，对其进行主成分分析。从图1可以看出，注射液中有些物质含量较高，比如19.3min附近的甲基正壬酮，其相对含量约3040%。这些大含量的物质可能将样品间的细微差别掩盖。为了更好地考察各样品之间的差异，采用加权方法对大峰进行处理后，再对21个厂家的指纹图谱进行主成分分析，用第一、二主成分做图，结果见图2。从图2可见，两类注射液的差别较明显：110号样本明显聚为一类，这类为鲜草注射液；除14号厂家外的其余10个厂家聚为第二类。14号厂家的注射液可能由于生产工艺等因素导致了其偏离了两类注射液。将两类厂家注射液指纹图谱分别求均值，结果见图3。从图可以看出，干草注射液指纹图谱中 a、b和c 个峰的要比鲜草注射液指纹图谱大得多。3.2 干燥过程中的鱼腥草药材GCMS指纹图谱分析将鱼腥草在242条件下自然阴干，药材被分成7份，分别干燥0、0.5、1、2、4、8和16 d。然后提取挥发油进行分析。药材中挥发油含量分别为0.35、0.33、0.27、0.23、0.22、0.21和0.20 mL/kg。挥发油含量在前2 d的变化较大，随后，变化趋缓。 图2 主成分分析结果（略）Fig.2 The score plot obtained by principal components analysis 图3 两类鱼腥草注射液的平均指纹图谱（略）Fig.3 Mean pattern of two kind of Houttuynia cordata injection 鲜草注射液的平均指纹图谱（mean pattern of Houttuynia cordata injection made of fresh raw material）； 2. 干草注射液的平均指纹图谱(mean pattern of Houttuynia cordata injection made of dry raw material）. 为了找出其中主要成分随干燥的变化规律，首先必须对药材所含的组分进行定性定量分析。色谱中大部分峰都已经基线分离，但是其中有些看起来是单组分的峰，通过质谱分析，这说明其应该是重叠峰。如果直接通过搜索质谱库来进行定性定量，其结果则不精确，甚至错误。因此在定性定量之前，必须进行分辨。本实验采用直观推导式演进特征投影法 (HELP) 来提取其纯的质谱和色谱。原始数据中的背景、基线漂移和严重的不等性噪声分别通过相应的方法进行预处理。对其进行秩估计,确定每个峰中存在的组分数。通过HELP 解析得到它们的纯质谱。HELP方法详细的解析过程参见文献1。然后在质谱库中进行物质的相似性匹配，以对化合物进行定性。有了纯的质谱，就可以求得各物质的纯色谱。随后对各纯色谱峰进行面积积分，以对其进行准确定量。 根据定性定量结果，可找出鱼腥草药材中组分随干燥时间的变化规律。由于挥发油随着干燥时间的延长而降低，所以大部分组分在干燥过程中也应该是逐渐减少。表1列出了最具有代表性的4种化合物（保留时间为13.7 min 的香叶烯、保留时间为21.7 min 的石竹烯、保留时间为22.3 min 的4十三酮和保留时间为23.6 min 的山酸乙酯）的变化趋势。4种物质含量在前2 d下降得很快，随后则基本稳定。值得注意的是，先前对鲜草注射液的指纹图谱分析却发现这4个组分含量同干草注射液一样（见图3）。但是在鲜药材中这4个组分含量都较大，其原因可能是在鲜草注射液生产过程中，从药材的采集到最后进蒸馏釜蒸馏中间由于洗涤、运输等需要12 d时间。而这个过程，刚好类似于自然干燥过程。结果导致了这4个组分在鲜草注射液中的含量也同在干草注射液中一样低。药材挥发油含量在干燥的前2 d的急剧下降也证实了该推论。相反，从表1可见，保留时间为17.2 min的1壬醇、保留时间为20.4 min的正癸酸和保留时间为23.9 min的石竹烯氧化物的含量则随着干燥时间的延长而增加。通过比较鲜草注射液和干草注射液的指纹图谱，发现这2大类注射液指纹图谱最大的区别（见图3中a、b和c 个峰）在于干草注射液在保留时间17.017.2 min、20.220.4 min和23.924.0 min处的个峰较鲜草注射液的大得多。鱼腥草药材干燥影响的研究结果为此提供了有力的证据。表1 几个主要组分的相对百分含量随干燥时间的变化（略）Table 1 The content change of several components with dry time3.3 相似度评价以上结果说明，鲜草与干草注射液之间确实存在一定的差异，其差异由药材所引起。因此，考虑将注射液分为干草和鲜草注射液两类，分别建立共有模式，进行指纹图谱相似度评价。在不分类时，采用本实验室的指纹图谱相似度评价软件考察样品之间的差异。计算结果见表2。从表2可见，其中有些厂家的相似度较低，最低的只有0.4940。在前面的加权主成分分析时，发现14号样为一奇异样本，这里不再考虑。那么相似度最低的为0.6867。将两类注射液分别重建共有模式，重新计算相似度，将鲜草注射液的指纹图谱与鲜草注射液的共有模式进行比较，结果10个厂家的相似度分别为0.9384、0.9365、0.8486、0.8284、0.9417、0.9287、 0.8132、0.9123、0.9347和0.8774。将干草注射液的指纹图谱与干草注射液的共有模式进行比较，结果11个厂家的相似度分别为0.8327、09259、0.9371、0.9372、0.8836、0.9664、0.9448、0.9192、 0.8492和0.8678。很明显，相似度提高了很多。表2 所有厂家注射液指纹图谱相对与均值的相关系数（略）Table 2 Correlation coefficients of the samples compared with the mean of all samples研究结果表明：用鲜草和干草为原料生产的注射液的指纹图谱之间确实存在一定的差异，这种差异主要是由于药材的差异所导致。这说明注射液产品的成分变化依赖于原药材。因此在鱼腥草注射液指纹图谱标准制定中应该考虑到药材的影响。References1 Zheng Huzhan（郑虎占）, Dong Zehong(董泽宏), She Jing(佘 靖). Modern Study of Traditional Chinese Medicine, Vol.3 (中药现代研究及应用，第三卷), Beijing（北京）：Xueyuan Press（学苑出版社），1998: 2 Chiang L C, Chang J S, Chen D C. Am. J. Chin. Med., 2003, 31 (3): 3553623 Chang J S, Chiang L C, Chen C C. Am. J. Chin. Med., 2001, 29(2): 303308 Chen Y Y, Liu J F, Chen C M. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 2003, 49(2): 327331 Kvalheim O M, Liang Y Z. Anal. Chem., 1992, 64(8): 936946 Keller H R, Massart D L. Anal. Chem. Acta, 1992, 263(1): 2128 Li X N, Liang Y Z, Chau F T. Chemom. Intell. Lab. Syst., 2002, 63(2): 139153 Malinowski E R. Factor AnalysisWiley/Interscience, New York,1991 Shen H L, Liang Y Z, Kvalheim O M. Chemom. Intell. Lab. Syst., 2000, 51(1): 49591 Liang Yizeng(梁逸曾). White, Grey and Black Mult