RNA提取步骤.doc

RNA提取：用TaKaRa RNAiso Reagent试剂提取RNA步骤(1).试剂盒之外所需准备试剂： 氯仿： 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧 异丙醇：异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点，0.6V1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候Trizol法提RNA，加氯仿就是要剧烈手摇才行，这样才能彻底地两相混匀。而且DNA在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的，不会跑水相里头去。醇沉淀是很经常用的方法，因为RNA和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以用来沉淀 75%乙醇（DEPC 处理水配制） RNase-free 水（制备方法：使用 RNase-free 的玻璃瓶，向超纯水中加入 DEPC 至终浓度 0.01%（v/v），过夜搅拌后，高温高压灭菌。(2).尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 a） 用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37下处理 12 小时。 b） 然后在 120下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。 RNA 实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。(3) 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌（180，60 分钟）或使用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用 RNA 实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后再进行高温高压灭菌。 RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。实验操作1. RNAiso Reagent 的使用量情况如下。 2. 实验样品的研磨和匀浆。 A. 贴壁培养细胞 倒出培养液，用 1PBS 清洗一次。 每10 cm2生长的培养细胞中加入 2 ml的RNAiso Reagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于 细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥 离细胞）。 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 室温静置 5 分钟。 B. 悬浮培养细胞 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4离心 2 分钟，弃上清。 向每 5106个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 室温静置 5 分钟。 C. 动物组织、植物材料样品 将超低温冻结的 RNA 提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响 RNA 的收率和质量）。 对于普通的 RNA 提取样品，可以向研钵中加入适量的 RNAiso Reagent，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的 RNAiso Reagent 的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。 将匀浆液转移至离心管中，室温静置 5 分钟。 12,000 g 4离心 5 分钟。 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。3. 总 RNA 的提取。 向上述步骤 2 的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Reagent 的 1/5 体积量），盖紧离心管盖，用力震荡（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置 5 分钟。 12,000 g 4离心 15 分钟。 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在 1530下静置 10 分钟。 12,000 g 4离心 10 分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 4. RNA 沉淀的清洗。 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入 75的乙醇 l ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4离心 5 分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制 RNA 中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。 5. RNA 的溶解。 室温干燥沉淀 25 分钟（不可以离心或加热干燥，否则 RNA 将会很难溶解，有关 RNA 溶解可以参考Troubleshooting 中的相关说明），加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80保存。 流程图组织和细胞总RNA提取（TRIzol法）（一）试剂准备 1 TRIzol 试剂。 2 氯仿 3 异丙醇 4 75% 乙醇（ DEPC H2O 配制） 5 DEPC H2O （二）操作步骤 1 样品处理： 组织：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 及液氮中保存的组织均可）置于1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置5min 。 2 加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。 3 4 离心， 12000g 15min ，取上清。 4 加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min 。 5 4 离心， 12000g 10min ，弃上清。 6 加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ， 7500g 5min ，弃上清。 7. 晾干，加入适量的 DEPC H 2O 溶解（ 65 促溶 10-15min ）。 （三）注意事项 1 样品量和 Trizol 的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少 Trizol 量，否则会使内源性 RNase 的抑制不完全，导致 RNA 降解。 2 实验过程必须严格防止 RNsae 的污染。 二、总 RNA 定量 RNA 定量方法与 DNA 定量相似。 RNA 在 260nm 波长处有最大的吸收峰。因此，可以用 260nm 波长分光测定 RNA 浓度， OD 值为 1 相当于大约 40 g/ml 的单链 RNA 。如用 1cm 光径，用 ddH2O 稀释DNA样品n倍并以 ddH